一種墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的快速繁殖方法
【專利摘要】一種墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的快速繁殖方法，以墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭無菌苗基部組織為材料，在含有多種植物生長調(diào)節(jié)劑和附加物的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得原球莖，將獲得的原球莖進行增殖與分化培養(yǎng)，再進行壯苗、生根，移栽。本發(fā)明將原球莖的增殖與分化步驟合二為一，培養(yǎng)程序簡單，不僅大大降低了配制培養(yǎng)基的材料成本，還降低了配制培養(yǎng)基和接種的人力成本，原球莖誘導(dǎo)率高、數(shù)量多，增殖系數(shù)大，具有生產(chǎn)成本低，種苗質(zhì)量高，培養(yǎng)周期短和無變異等諸多優(yōu)勢。
【專利說明】
一種墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于蘭科植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]墨蘭(Cymbidiumsinense)為蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)地生蘭類多年生草本花卉，為五大傳統(tǒng)國蘭之一，其葉片飄逸秀美，花瓣香氣濃郁，花色多變，花期冬季至早春，具有很高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。因其多在春節(jié)前后開花，又稱報歲蘭，其傳統(tǒng)的分株繁殖方法，繁殖系數(shù)極低，一般每年只能增殖I?3倍。
[0003]虎頭蘭(Cymbidium hookerianum)是蘭科蘭屬附生性多年生草本植物。原產(chǎn)于我國西南地區(qū)，主要分布在貴州、西藏、云南、四川等省區(qū)，世界各國多有引種栽培。目前我國虎頭蘭的種苗、成品花大多從日本、韓國及我國臺灣地區(qū)引進?；㈩^蘭葉長碧綠，花莖斜生，花淺黃綠色、表面有紫紅色條紋或小斑點，花形似“虎頭”，十分典雅，因而具有很高的觀賞價值，是世界著名的“蘭花新星”，深受各國人民的喜愛。但是，虎頭蘭主要采取傳統(tǒng)的分株方法進行繁殖，其繁殖率低，周期長，遠不能滿足花卉市場需求。
[0004]大花蕙蘭是蘭屬的多代雜交種，虎頭蘭是大花蕙蘭原始雜交親本材料之一，二者均為附生蘭。近年，有關(guān)附生蘭與地生蘭的雜交育種研究工作取得了一些進展，一些雜交蘭可通過雜交種子無菌萌發(fā)成苗，但是，由于基因型不同，附生蘭與地生蘭的雜交蘭對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、激素配比等要求不同，還存在著繁殖系數(shù)低，長勢差、生根困難等問題。
[0005]運用生物技術(shù)快速繁殖名優(yōu)國蘭已有一些報道，翁錦周等(亞熱帶植物科學(xué)，2006，35(3)37?38)以墨蘭(Cymbidium sinense)地下根狀莖段為外植體，探討不同濃度活性炭對其離體培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，在MS+NAA2.0mg/L+10%椰汁的培養(yǎng)基中加入1.0g/L活性炭對原球莖的誘導(dǎo)效果最好;MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+活性炭4.0g/L適合于不定芽分化;在1/2MS+NAA 1.0mg/L+BA 0.5mg/L+10%椰汁的培養(yǎng)基中加入0.5?3.0g/L活性炭有利于提高成苗率，但是，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基用于墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的組織培養(yǎng)中，夕卜植體稍膨大卻并未形成原球莖。
[0006]曹受金以虎頭蘭莖尖、莖段和葉為外植體開展了組培研究，結(jié)果表明:適宜的原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:KC+5mg/L 6-BA+0.5(或1.0)mg/L NAA+0.5?I %蔗糖;莖尖的原球莖誘導(dǎo)率為38?75% ;莖段的原球莖誘導(dǎo)率為48?78% ;葉的原球莖誘導(dǎo)率為5?16% ;增殖培養(yǎng)基:KC+5mg/L BA+0.1 (或0.5)mg/L NAA+0.2蛋白胨;原球莖的鮮重増加率為50?58% (曹受金，北方園藝，2007(3):167?169)，但是，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基用于墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的組織培養(yǎng)中，也未獲得原球莖。
[0007]“紅美人”是墨蘭紅櫻姬與虎頭蘭的雜交品種，株型漂亮，花期長，集花大、花香、花色艷美于一體，目前，其繁殖方式主要為常規(guī)分株繁殖，一年只能得到I?3倍的增殖速度，繁殖系數(shù)低，周期長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的組培快速繁殖方法，以雜交蘭無菌苗基部組織為材料，誘導(dǎo)原球莖進行增殖、分化，壯苗、生根，培養(yǎng)程序簡單，繁殖系數(shù)大，速度快，生產(chǎn)成本低，種苗質(zhì)量高，便于工廠化生產(chǎn)。
[0009]為了達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0010]—種墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0011]I)誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0012]取墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭無菌苗，切去根及頂部葉片，取基部組織0.5?0.8cm，剝?nèi)?2層葉鞘，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)45?60d，獲得雜交蘭原球莖；
[0013]其中，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤2.0?6.0mg/L，萘乙酸0.5?3.0mg/L，激動素0.5?I.5mg/L，毒莠定0.2?0.5mg/L，水解酪蛋白0.5?I.5g/L，活性炭0.I ?0.5g/L，蔗糖20?40g/L和瓊脂粉5.5?6.5g/L，pH=5.4?5.8;
[0014]2)增殖培養(yǎng)與分化
[0015]取步驟I)獲得的雜交蘭原球莖，進行切割，以2?4個原球莖為一團，接種于原球莖增殖與分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30?60d，形成新生原球莖，新生原球莖再分化成不定芽；
[0016]其中，所述的增殖與分化培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤2.0?3.0mg/L，激動素0.2?0.5mg/L，萘乙酸0.5?I.0mg/L，水解酪蛋白0.5?I.5g/L，活性炭0.1?0.5g/L，蔗糖 30 ?40g/L 和瓊脂粉 5.5 ?6.5g/L，pH=5.4?5.8;
[0017]3)壯苗與生根培養(yǎng)
[0018]將步驟2)獲得的不定芽切成單芽，接種于壯苗與生根培養(yǎng)基中，在帶瓶蓋的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)25?35d，獲得生根試管苗；
[0019]4)試管苗移栽
[0020]將步驟3)獲得的生根試管苗帶瓶蓋常溫條件下煉苗5?7d，然后打開瓶蓋再煉苗2?3d，將生根試管苗取出，去除基部殘留的培養(yǎng)基，移栽于基質(zhì)中，澆水后保持溫度25±2°C，空氣濕度70?80%。
[0021]進一步，步驟3)所述壯苗與生根培養(yǎng)基包括:1/2MS培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.1?0.2mg/L，卩引噪丁酸0.5?I.5mg/L，萘乙酸0.2?0.5mg/L，鹿糖20?30g/L，瓊脂粉5.5?
6.5g/L和活性炭0.I ?0.5g/L，pH=5.4?5.8。
[0022]又進一步，步驟4)所述的基質(zhì)為泥炭:椰殼=I?3:1，質(zhì)量比。
[0023]優(yōu)選地，所述的墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的品種為紅美人。
[0024]如無特殊說明，本發(fā)明所述的單位mg/L或g/l是指在I升培養(yǎng)基中各組分的含量，1/2MS是指MS培養(yǎng)基中的無機鹽成分減半。
[0025]本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟I)中，以雜交蘭的基部組織為外植體，取材方便，誘導(dǎo)率高。本發(fā)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加含量為0.5?1.5g/L的水解酪蛋白，水解酪蛋白為培養(yǎng)物提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，添加后可將誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間提前10?15d，先形成的新生原球莖再分化成不定芽，且原球莖培養(yǎng)物生長健壯。
[0026]本發(fā)明的增殖與分化培養(yǎng)基中，添加了多種植物生長激素，合理調(diào)節(jié)植物生長激素配比，相互之間能起到配合協(xié)同作用，6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和激動素(KT)是細胞分裂素類物質(zhì)，本發(fā)明添加較高濃度的6-BA，可直接促進細胞分裂、分化，促進芽的形成，萘乙酸(NAA)為生長素類物質(zhì)，具有促進外植體誘導(dǎo)愈傷組織或生根的作用，低濃度的NAA對6-BA、KT的促進細胞分裂、分化具有輔助作用，將原球莖的增殖與分化步驟合二為一，不需進行轉(zhuǎn)接，不需另外配制培養(yǎng)基，簡化了培養(yǎng)過程，縮短了培養(yǎng)時間。
[0027]本發(fā)明在誘導(dǎo)、增殖與分化階段加入了0.5?1.5g/L的水解酪蛋白，由于多種氨基酸的復(fù)合效應(yīng)，可增強培養(yǎng)物對培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，加入少量的活性炭，既控制外植體褐化，又不影響其對營養(yǎng)和激素的吸收，使得培養(yǎng)物生長茂盛。生根階段，減少了水解酪蛋白的添加量，為生根苗逐漸適應(yīng)外界條件起了一個緩沖的作用，在生根培養(yǎng)基中添加6-BA 0.1?0.2mg/L，可以保持培養(yǎng)物生長旺盛，對促進壯苗也有一定的積極作用。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果:
[0029]I)采用本發(fā)明方法進行雜交蘭組織培養(yǎng)快速繁殖種苗，誘導(dǎo)原球莖數(shù)量多、繁殖系數(shù)大，單個原球莖的增殖系數(shù)在8以上，可達9.6，增殖速度快，移栽成活率高。
[0030]2)采用本發(fā)明方法進行雜交蘭快速繁殖，合理調(diào)節(jié)好激素配比，將原球莖的增殖與分化步驟合二為一，不需進行轉(zhuǎn)接，不需另外配制培養(yǎng)基，大大降低了配制培養(yǎng)基的藥品、試劑，還降低了配制培養(yǎng)基和接種的人力成本。
[0031]3)利用本發(fā)明繁育雜交蘭種苗，種苗質(zhì)量好，能保持本品種特征特性，控制好繁殖周期，可減少接種和培養(yǎng)基配制方面的人力成本，還可以減少生產(chǎn)成本。
【附圖說明】
[0032]圖1為本發(fā)明實施例1獲得的原球莖。
[0033]圖2為本發(fā)明實施例1中原球莖分化的不定芽。
[0034]圖3為本發(fā)明實施例1中獲得的生根試管苗。
[0035]圖4為本發(fā)明實施例1獲得的紅美人雜交蘭小苗。
【具體實施方式】
[0036]以下結(jié)合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但所述實施例不限制本發(fā)明的保護范圍。
[0037]實施例1
[0038]—種墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭的快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0039]I)誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0040]取墨蘭與虎頭蘭的雜交后代“紅美人”無菌苗，切去根及頂部葉片，取基部組織
0.6cm，剝?nèi)ネ饷鍵?2層葉鞘，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基;進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)50d，獲得雜交蘭原球莖(參見圖1)，原球莖誘導(dǎo)率達83.3%；
[0041]其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+6-BA5.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAAl.0mg/L+PIC 0.3mg/L+水解酪蛋白1.0mg/L+活性炭0.lg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.0g/L，pH=5.6;
[0042]2)增殖培養(yǎng)與分化
[0043]取步驟I)獲得的雜交蘭原球莖，進行切割，接種于原球莖增殖與分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20d后原球莖開始增殖，40d后形成大量新生原球莖，增殖系數(shù)達9.6，45d后，先形成的原球莖逐漸分化成大量不定芽(參見圖2);
[0044]其中，增殖與分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0mg/L+KT 0.5mg/L+NAA0.5mg/L+水解酪蛋白 1.0g/L+鹿糖30g/L+活性炭0.2g/L+瓊脂粉6.0g/L，pH=5.6;
[0045]3)壯苗與生根培養(yǎng)
[0046]將步驟2)獲得的不定芽切成單芽，接種于壯苗與生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后，獲得生根試管苗(參見圖3);
[0047]其中，壯苗與生根培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.2mg/L+IBA I.0mg/L+NAA0.2mg/L+水解酪蛋白 0.2g/L+活性炭 0.2g/L+蔗糖 20g/L+瓊脂粉 6.0g/L，pH=5.6;
[0048]4)試管苗移栽
[0049]將步驟3)獲得的生根試管苗帶瓶蓋常溫條件下煉苗5d，然后打開瓶蓋再煉苗3d，將生根試管苗取出，去除基部殘留的培養(yǎng)基，移栽于泥炭:椰殼=2:1的基質(zhì)中，澆水，保持溫度25 ± 2°C，空氣濕度80%左右，移栽I個月后，紅美人雜交蘭小苗全部成活(參見圖4)。
[0050]實施例2
[0051]—種墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭的快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0052]I)誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0053]取墨蘭與虎頭蘭的雜交后代“紅美人”無菌苗，切去根及頂部葉片，取基部組織
0.8cm，剝?nèi)ネ饷鍵?2層葉鞘，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基;進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)53d，獲得雜交蘭原球莖，原球莖誘導(dǎo)率達75.0%；
[0054]其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+6-BA4.0mg/L+KT I.5mg/L+NAAI.0mg/L+PIC 0.2mg/L+水解酪蛋白1.0mg/L+活性炭0.4g/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.0g/L，pH=5.6;
[0055]2)增殖培養(yǎng)與分化
[0056]取步驟I)獲得的雜交蘭原球莖，進行切割，接種于原球莖增殖與分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20d后原球莖開始增殖，40d后形成大量新生原球莖，增殖系數(shù)達8.4，45d后，先形成的原球莖逐漸分化成大量不定芽；
[0057]其中，增殖與分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.5mg/L+KT 0.5mg/L+NAA0.5mg/L+水解酪蛋白 1.0g/L+鹿糖30g/L+活性炭0.2g/L+瓊脂粉6.0g/L，pH=5.6;
[0058]3)壯苗與生根培養(yǎng)
[0059]將步驟2)獲得的不定芽切成單芽，接種于壯苗與生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后，獲得生根試管苗；
[0060]其中，壯苗與生根培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.lmg/L+IBA 0.5mg/L+NAA0.5mg/L+水解酪蛋白 0.2g/L+活性炭 0.2g/L+蔗糖 20g/L+瓊脂粉 6.0g/L，pH=5.6;
[0061 ] 4)試管苗移栽
[0062]將步驟3)獲得的生根試管苗帶瓶蓋常溫條件下煉苗7d，然后打開瓶蓋再煉苗3d，將生根試管苗取出，去除基部殘留的培養(yǎng)基，移栽于泥炭:椰殼=3:1的基質(zhì)中，澆水，保持溫度25±2°C，空氣濕度80%左右，移栽I個月后，紅美人雜交蘭小苗全部成活。
[0063]對比例I
[0064]取墨蘭與虎頭蘭的雜交后代“紅美人”無菌苗，切去根及頂部葉片，取基部組織
0.6cm，剝?nèi)ネ饷鍵?2層葉鞘，接種于墨蘭的誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+NAA 2.0mg/L+椰汁1wt%+活性炭1.0g/L+鹿糖30g/L+瓊脂粉6.0g/L,pH= 5.6；進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)50d，外植體稍膨大而未形成原球莖。
[0065]說明墨蘭的組織培養(yǎng)過程中使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基不適用于墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭無菌苗基部繁殖，這可能與墨蘭和虎頭蘭的雜交蘭的基因型及外植體類型不同有關(guān)。
[0066]對比例2
[0067]取墨蘭與虎頭蘭的雜交后代“紅美人”無菌苗，切去根及頂部葉片，取基部組織
0.6cm，剝?nèi)ネ饷鍵?2層葉鞘，接種于虎頭蘭的誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+活性炭0.lg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6.0g/L，pH= 5.6;進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)50d，未獲得雜交蘭原球莖。
[0068]對比例3
[0069]取墨蘭與虎頭蘭的雜交后代“紅美人”無菌苗，除增殖與分化培養(yǎng)階段中增殖與分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+活性炭0.5g/L+瓊脂粉6.0g/L，pH= 5.6，增殖培養(yǎng)25d后原球莖開始增殖，40d后增殖系數(shù)為4.4，其余步驟與本發(fā)明實施例1相同。
【主權(quán)項】
1.一種墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的快速繁殖方法，包括以下步驟: 1)誘導(dǎo)培養(yǎng) 取墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭無菌苗，切去根及頂部葉片，取基部組織0.5?0.8cm，剝?nèi)?2層葉鞘，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)45?60d，獲得雜交蘭原球莖； 其中，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤2.0?6.0mg/L，萘乙酸0.5?3.0mg/L，激動素0.5?I.5mg/L，毒莠定0.2?0.5mg/L，水解酪蛋白0.5?I.5g/L，活性炭0.1?0.5g/L，蔗糖 20 ?40g/L 和瓊脂粉 5.5 ?6.5g/L，pH=5.4?5.8; 2)增殖培養(yǎng)與分化 取步驟I)獲得的雜交蘭原球莖，進行切割后接種于原球莖增殖與分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30?60d，形成新生原球莖，新生原球莖再分化成不定芽； 其中，所述的增殖與分化培養(yǎng)基包括:MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤2.0?3.0mg/L,激動素0.2?0.5mg/L，萘乙酸0.5?I.0mg/L，水解酪蛋白0.5?I.5g/L，活性炭0.1?0.5g/L，蔗糖 30 ?40g/L 和瓊脂粉 5.5 ?6.5g/L，pH=5.4?5.8; 3)壯苗與生根培養(yǎng) 將步驟2)獲得的不定芽切成單芽，接種于壯苗與生根培養(yǎng)基中，在帶瓶蓋的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)25?35d，獲得生根試管苗； 4)試管苗移栽 將步驟3)獲得的生根試管苗帶瓶蓋在常溫條件下煉苗5?7d，然后打開瓶蓋再煉苗2?3d，將生根試管苗取出，去除基部殘留的培養(yǎng)基，移栽于基質(zhì)中，澆水后保持溫度25±2°C，空氣濕度70?80 %。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的快速繁殖方法，其特征在于，步驟3)所述的壯苗與生根培養(yǎng)基包括:1/2MS培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.1?0.2mg/L，吲哚丁酸0.5?I.5mg/L，萘乙酸0.2?0.5mg/L，鹿糖20?30g/L，瓊脂粉5.5?6.5g/L和活性炭0.1?0.5g/L，pH=5.4?5.8。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的快速繁殖方法，其特征在于，步驟4)所述的基質(zhì)為泥炭:椰殼=I?3:1，質(zhì)量比。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的快速繁殖方法，其特征在于，所述的墨蘭與虎頭蘭的雜交蘭種苗的品種為紅美人。
【文檔編號】A01H4/00GK105875410SQ201610236257
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】朱建軍, 殷麗青, 張春英, 李秀芬, 孫翊, 范曉芬, 張治忠
【申請人】上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院, 上海景香農(nóng)業(yè)科技有限公司