一種抗刺激隱核蟲黑鯛苗種的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗刺激隱核蟲黑鯛苗種的生產(chǎn)方法，屬于抗病性魚苗生產(chǎn)領域，具體為抗刺激隱核蟲魚苗生產(chǎn)領域。首次采用變溫感染和變溫養(yǎng)殖的方式來生產(chǎn)抗病性的黑鯛苗種，感染時的水溫與感染后10天內(nèi)的養(yǎng)殖水溫保持一定溫差，從而增強刺激隱核蟲活幼蟲的免疫效果，進而與輪換養(yǎng)殖結合，獲得了有效免疫保護期較長的抗刺激隱核蟲黑鯛苗種，免疫后第8個月還具有70％的相對保護率，第9個月仍有42％的相對保護率。
【專利說明】
-種抗刺激隱核蟲黑銅苗種的生產(chǎn)方法
技術領域
[0001] 本技術設及一種抗刺激隱核蟲黑觸苗種的生產(chǎn)方法，屬于抗病性魚苗生產(chǎn)領域， 具體為抗刺激隱核蟲魚苗生產(chǎn)領域。
【背景技術】
[0002] 黑觸(Acanthopagrus schlegelii)，隸屬于觸科、觸屬，是沿岸性魚類，一般不作 長距離徊游，是中國沿海增殖放流的優(yōu)良品種，也是中國東南沿海海水養(yǎng)殖的名貴品種之 〇
[0003] 刺激隱核蟲病俗稱海水魚白點病，是由一種海水魚類專性寄生纖毛蟲----刺激隱 核蟲化巧91:〇。日巧〇]111'1'；[1日]13)引起的致死性寄生蟲?。ā博?〇11113]1(113腳旨633，1997)。近 年來，刺激隱核蟲病已經(jīng)成為我國危害最嚴重的寄生蟲病之一，給海水漁業(yè)造成了巨大的 危害化U0 et al. ,2008)，被列為國家《一、二、Ξ類動物疫病病種名錄》中唯一的水生動物 二類疫病(農(nóng)業(yè)部，2008)。刺激隱核蟲的宿主范圍很廣泛，除軟骨魚類對刺激隱核蟲有較強 抵抗力外，海水硬骨魚類普遍能被刺激隱核蟲感染，其中黑觸也是刺激隱核蟲感染的對象 之一。
[0004] 由于刺激隱核蟲生活史的復雜性，使得該病的防控非常困難。目前生產(chǎn)上主要采 用藥物防治如福爾馬林、硫酸銅、叮晚黃、孔雀綠、亞甲基蘭、哇林派、甲硝化挫、高儘酸鐘、 氯化鋼、橫胺嚷挫、巧喃挫酬和青霉素等（Colorni and Burgess，1997;蔡澤平等，2001; No;ri1:aka et al.，200l;No;ri1:aka et al.，2003;黃諱等，2004)，然而運些方法由于存諸多 缺陷，如效果不穩(wěn)定、破壞養(yǎng)殖環(huán)境、危害食品安全、實施不便等，很難達到理想的效果。
[0005] Colorni(1987)提議用不同的物理方法防治刺激隱核蟲病，其中一種方法是將魚 在2個水族箱中進行輪換飼養(yǎng)，空置的水族箱進行干燥和清潔處理。運種方法很有效，但是 他沒有給出具體的操作方法，特別是沒有給出不同溫度下輪換的頻率和總共需要的時間運 兩個關鍵數(shù)據(jù)。張團委(2012)測定了卵形錯錢和斜帶石斑魚在不同溫度下感染刺激隱核蟲 的輪換頻率和輪換周期，但是沒有測定運種方法是否會誘發(fā)海水魚產(chǎn)生獲得性免疫保護。
[0006] 目前研究證實，海水魚類對刺激隱核蟲感染會產(chǎn)生獲得性免疫保護，疫苗接種可 能成為防治刺激隱核蟲病的有效方法(Yoshinaga et al，1997;Yambot et al，2006;Luo et al ,2007;化1:anaka and Hirazawa，2008)。近年來研究者開展了一些刺激隱核蟲免疫防 治的基礎研究和應用研究，發(fā)現(xiàn)用刺激隱核蟲幼蟲經(jīng)體表感染海水魚如斜帶石斑魚、卵形 錯錢等，可W達到80%W上的免疫保護率(Luo et al，2007;但學明等，2008;化shinaga et al，1997)，但是運些實驗的有效免疫保護期最長只能達到3個月，且沒有詳細研究不同溫度 對海水魚獲得性免疫保護力的影響。
[0007] 在實際生產(chǎn)過程中，迫切需要一種有效免疫保護期較長的黑觸苗種，為滿足此需 要，
【申請人】經(jīng)多次試驗和嘗試，摸索出了一種有效免疫保護期較長的、抗刺激隱核蟲黑觸苗 種的生產(chǎn)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明旨在克服抗刺激隱核蟲的黑觸苗種免疫保護期過短、不適應工業(yè)化養(yǎng)殖生 產(chǎn)等缺點，提供了一種實用性較強的抗刺激隱核蟲黑觸苗種的生產(chǎn)方法。
[0009] 本發(fā)明將采用獨特的變溫感染和輪換養(yǎng)殖方法，培育出抗刺激隱核蟲感染的黑觸 苗種，運種黑觸苗對刺激隱核蟲的免疫保護力要達到8個月W上，免疫后第8個月還具有 70%的相對保護率，第9個月仍有42 %的相對保護率。
[0010] 本發(fā)明的獨特之處在于，首次采用變溫感染和變溫養(yǎng)殖的方式來生產(chǎn)抗病性的 石斑魚苗種，感染時的水溫與感染后10天內(nèi)的養(yǎng)殖水溫保持一定溫差，從而增強刺激隱核 蟲活幼蟲的免疫效果，進而與輪換養(yǎng)殖結合，獲得了有效免疫保護期較長的抗刺激隱核蟲 黑觸苗種。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)勢在于，解決了一直困擾養(yǎng)殖戶的海水魚類苗種免疫保護期短的技術 問題，采用獨創(chuàng)性的感染養(yǎng)殖方式，生產(chǎn)出了有效免疫保護期長達8個月的抗刺激隱核蟲黑 觸苗種，適用于養(yǎng)殖廠及養(yǎng)殖戶的黑觸健康養(yǎng)殖，可減免海水白點病所帶來的巨大損失，大 大提高漁民的養(yǎng)殖效益。
[0012] 本發(fā)明是通過W下技術方案實現(xiàn)的：
[001引1.刺激隱核蟲活幼蟲的收集和濃度計算
[0014]利用?？诘拇碳る[核蟲傳代系統(tǒng)對刺激隱核蟲進行傳代和收集，其傳代宿主為卵 形錯錢，采集發(fā)育良好的刺激隱核蟲包囊，置于消過毒的干凈燒杯中解化，解化用水為高壓 滅菌的、加入適量青霉素和鏈霉素的自然海水;收集解出2小時內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲液，充 分混勻后取50化蟲液，加10化甲醒將幼蟲殺死，在顯微鏡下計數(shù)，記算出幼蟲液的活蟲濃 度。
[00巧]2.黑觸苗種馴養(yǎng)、感染
[0016] 購置9g左右的黑觸苗種，感染前2周對魚苗進行試養(yǎng)馴化，直至其進食、活動正常， 在整個養(yǎng)殖過程中，飼養(yǎng)用水用600目的濾網(wǎng)過濾，其鹽度在30%。左右，pH為8左右，溶氧量 在5.6mg/LW上;將黑觸苗種分為對照組和實驗組(第1-9組)共十個小組，實驗組每組魚苗 用解出2小時內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲感染，感染時水溫第1-3組為24°C、第4-6組為27 °C、第7-9 組為30°C，感染用水量為1L海水/尾魚，感染劑量為7000個幼蟲/尾魚;感染6小時后分別把 魚苗放入不同的輪養(yǎng)池中，其中第1、4、7組水溫控制在24 °C，第2、5、8組水溫控制在27 °C，第 3、6、9組水溫控制在30°C ;對照組不進行刺激隱核蟲感染，養(yǎng)殖水溫為27°C。輪養(yǎng)池長40 米，寬1.5米，高1米，池中間用密封隔板將養(yǎng)殖池一分為二，保證兩側水不互通，感染后的魚 苗全部放置在池的一側，加入終濃度為化pm的聚維酬艦溶液(有效艦含量為10%)預防繼發(fā) 感染。具體分組情況見下表：
[0017]
[0018] ~3、感染后黑觸苗種的輪換養(yǎng)殖
' '
[0019] 為了保證黑觸苗種不被脫落的刺激隱核蟲包囊解出的幼蟲再次感染，每2天要將 苗種置換到干凈的池中養(yǎng)殖，對照組魚種按同樣方法換池。具體方法為:將輪養(yǎng)池中間的密 封隔板拔出，采用誘食和驅趕方法將全部魚苗集中到池的另一側，插上密封隔板，加入終濃 度為化pm的聚維酬艦溶液(有效艦含量為10%)預防繼發(fā)感染。排凈原來養(yǎng)魚一側的海水， 加入30cm深的淡水，浸泡8小時，即可殺滅所有粘附于池底的刺激隱核蟲包囊，刷洗后排凈 淡水，加注干凈海水待下一次使用。按上述方法輪換養(yǎng)殖5次，魚體上的刺激隱核蟲全部脫 落，整個輪換養(yǎng)殖過程均保持W上的控溫方式。此后將免疫過的魚苗全部放入干凈的養(yǎng)殖 池中養(yǎng)殖，不必控溫，保持自然水溫。
[0020] 4、致死劑量的測定和有效免疫保護期的測定
[0021] 黑觸致死劑量的測定在攻毒前兩周進行。從空白對照組隨機取50尾魚，分為10組， 每組5尾，在塑料桶內(nèi)分開喂養(yǎng)。在幼蟲脫包高峰期，收集和計數(shù)2小時內(nèi)脫包的活躍幼蟲， 分別用設定好的劑量梯度感染10組魚，感染用水量為1L海水/尾魚。統(tǒng)計一周內(nèi)各組魚的死 亡數(shù)，能使5尾黑觸全部死亡的最低感染劑量就是該魚的刺激隱核蟲致死劑量。
[0022] 攻毒:每30天從對照組和每組免疫過的魚苗中各取50尾魚，用致死劑量的刺激隱 核蟲幼蟲攻毒。攻毒時空白對照組和實驗組混養(yǎng)在一起，海水用量仍為每尾魚1L，同時用致 死劑量的幼蟲進行感染攻毒，統(tǒng)計各個實驗組7天內(nèi)實驗魚的死亡情況，計算免疫9個月內(nèi) 的相對保護率，刺激隱核蟲攻毒后實驗魚的相對保護率(RPS)，RPS =(對照組死亡率-免疫 組死亡率)/對照組死亡率X 100%。
[0023]
[0024] 結果發(fā)現(xiàn):與沒有免疫過的對照組相比，免疫過的黑觸苗種死亡率有顯著降低， 其中第8組(3(TC感染，27Γ養(yǎng)殖)有效免疫保護期最長，免疫后第8個月還具有70%的相對 保護率，第9個月仍有42 %的相對保護率。因此，30°C感染，27 °C養(yǎng)殖的方法能讓黑觸獲得最 長的有效免疫保護期，可W采取該方法來生產(chǎn)抗刺激隱核蟲的黑觸苗種。
[0025] 本發(fā)明的優(yōu)點和效果：1、感染和輪換養(yǎng)殖操作簡單易行，且不損傷魚體，感染時無 需拱取魚苗，輪換養(yǎng)殖時也只需要將池中間的密封隔板拔出，采用誘食和驅趕方法就可把 全部魚苗集中到池的另一側，此方法對魚體無任何損傷，且簡單易行。2.采用獨特的變溫感 染和輪換養(yǎng)殖方法能讓黑觸獲得最長的有效免疫保護期，采用30°C感染，27Γ養(yǎng)殖的方法 能讓黑觸在免疫后第8個月還具有70%的相對保護率，第9個月仍有42%的相對保護率。此 方法產(chǎn)生的有效免疫保護期比W前任何報道的方法都要長。
【具體實施方式】
[0026] 1.刺激隱核蟲活幼蟲的收集和濃度計算
[0027] 利用?？诘拇碳る[核蟲傳代系統(tǒng)對刺激隱核蟲進行傳代和收集，其傳代宿主為卵 形錯錢，采集發(fā)育良好的刺激隱核蟲包囊，置于消過毒的干凈燒杯中解化，解化用水為高壓 滅菌的、加入適量青霉素和鏈霉素的自然海水;收集解出2小時內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲液，充 分混勻后取50化蟲液，加10化甲醒將幼蟲殺死，在顯微鏡下計數(shù)，記算出幼蟲液的活蟲濃 度。
[002引2.黑觸苗種馴養(yǎng)、感染
[0029]購置9g左右的黑觸苗種，感染前2周對魚苗進行試養(yǎng)馴化，直至其進食、活動正常， 在整個養(yǎng)殖過程中，飼養(yǎng)用水用600目的濾網(wǎng)過濾，其鹽度在30%。左右，pH為8左右，溶氧量 在5.6mg/LW上;將黑觸苗種分為對照組和實驗組(第1-9組)共十個小組，實驗組每組魚苗 用解出2小時內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲感染，感染時水溫第1-3組為24°C、第4-6組為27 °C、第7- 9組為30°C，感染用水量為1L海水/尾魚，感染劑量為7000幼蟲/尾魚;感染6小時后分別把魚 苗放入不同的輪養(yǎng)池中，其中第1、4、7組水溫控制在24°C，第2、5、8組水溫控制在27°C，第3、 6、9組水溫控制在30°C ;對照組不進行刺激隱核蟲感染，養(yǎng)殖水溫為27°C。輪養(yǎng)池長40米，寬 1.5米，高1米，池中間用密封隔板將養(yǎng)殖池一分為二，保證兩側水不互通，感染后的魚苗全 部放置在池的一側，加入終濃度為化pm的聚維酬艦溶液(有效艦含量為10%)預防繼發(fā)感 染。具體分組情況見下表：
[0030]
[0031] 3、感染后黑觸苗種的輪換養(yǎng)殖
' '
[0032] 為了保證黑觸苗種不被脫落的刺激隱核蟲包囊解出的幼蟲再次感染，每2天要將 苗種置換到干凈的池中養(yǎng)殖，對照組魚種按同樣方法換池。具體方法為:將輪養(yǎng)池中間的密 封隔板拔出，采用誘食和驅趕方法將全部魚苗集中到池的另一側，插上密封隔板，加入終濃 度為化pm的聚維酬艦溶液(有效艦含量為10%)預防繼發(fā)感染。排凈原來養(yǎng)魚一側的海水， 加入30cm深的淡水，浸泡8小時，即可殺滅所有粘附于池底的刺激隱核蟲包囊，刷洗后排凈 淡水，加注干凈海水待下一次使用。按上述方法輪換養(yǎng)殖5次，魚體上的刺激隱核蟲全部脫 落，整個輪換養(yǎng)殖過程均保持W上的控溫方式。此后將免疫過的魚苗全部放入干凈的養(yǎng)殖 池中養(yǎng)殖，不必控溫，保持自然水溫。
[0033] 4、致死劑量的測定和有效免疫保護期的測定
[0034] 黑觸致死劑量的測定在攻毒前兩周進行。從空白對照組隨機取50尾魚，分為10組， 每組5尾，在塑料桶內(nèi)分開喂養(yǎng)。在幼蟲脫包高峰期，收集和計數(shù)2小時內(nèi)脫包的活躍幼蟲， 分別用設定好的劑量梯度感染10組魚，感染用水量為1L海水/尾魚。統(tǒng)計一周內(nèi)各組魚的死 亡數(shù)，能使5尾黑觸全部死亡的最低感染劑量就是該魚的刺激隱核蟲致死劑量。
[0035] 攻毒:每30天從對照組和每組免疫過的魚苗中各取50尾魚，用致死劑量的刺激隱 核蟲幼蟲攻毒。攻毒時空白對照組和實驗組混養(yǎng)在一起，海水用量仍為每尾魚1L，同時用致 死劑量的幼蟲進行感染攻毒，統(tǒng)計各個實驗組7天內(nèi)實驗魚的死亡情況，計算免疫9個月內(nèi) 的相對保護率，刺激隱核蟲攻毒后實驗魚的相對保護率(RPS)，RPS =(對照組死亡率-免疫 組死亡率)/對照組死亡率X 100%。
[0036]
[0037] 結果發(fā)現(xiàn):與沒有免疫過的對照組相比，免疫過的黑觸苗種死亡率有顯著降低，其 中第8組(30°C感染，27°C養(yǎng)殖)有效免疫保護期最長，免疫后第8個月還具有70%的相對保 護率，第9個月仍有42%的相對保護率。因此，30°C感染，27°C養(yǎng)殖的方法能讓黑觸獲得最長 的有效免疫保護期，可W采取該方法來生產(chǎn)抗刺激隱核蟲的黑觸苗種。
【主權項】
1. 一種抗刺激隱核蟲黑鯛苗種的生產(chǎn)方法，包括以下四個步驟： (1) 刺激隱核蟲活幼蟲的收集和濃度計算 利用專門的刺激隱核蟲傳代系統(tǒng)對刺激隱核蟲進行傳代和收集，其傳代宿主為卵形鯧 鰺，采集發(fā)育良好的刺激隱核蟲包囊，置于消過毒的干凈燒杯中孵化，孵化用水為高壓滅菌 的、加入適量青霉素和鏈霉素的自然海水;收集孵出2小時內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲液，充分混 勻后取50yL蟲液，加 IOyL甲醛將幼蟲殺死，在顯微鏡下計數(shù)，記算出幼蟲液的活蟲濃度。 (2) 黑鯛苗種馴養(yǎng)、感染 購置9g左右的黑鯛苗種，感染前2周對魚苗進行試養(yǎng)馴化，直至其進食、活動正常，在整 個養(yǎng)殖過程中，飼養(yǎng)用水用600目的濾網(wǎng)過濾，其鹽度在30%。左右，pH為8左右，溶氧量在 5.6mg/L以上;將黑鯛苗種分為對照組和實驗組(第1-9組)共十個小組，實驗組每組魚苗用 孵出2小時內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲感染，感染時水溫第1-3組為24°C、第4-6組為27°C、第7-9組 為30 °C，感染用水量為IL海水/尾魚，感染劑量為7000個幼蟲/尾魚;感染6小時后分別把魚 苗放入不同的輪養(yǎng)池中，其中第1、4、7組水溫控制在24°C，第2、5、8組水溫控制在27°C，第3、 6、9組水溫控制在30 °C ;對照組不進行刺激隱核蟲感染，養(yǎng)殖水溫為27 °C。輪養(yǎng)池長40米，寬 1.5米，高1米，池中間用密封隔板將養(yǎng)殖池一分為二，保證兩側水不互通，感染后的魚苗全 部放置在池的一側，加入終濃度為2ppm的聚維酮碘溶液(有效碘含量為10%)預防繼發(fā)感 染。 (3) 感染后黑鯛苗種的輪換養(yǎng)殖 為了保證黑鯛苗種不被脫落的刺激隱核蟲包囊孵出的幼蟲再次感染，每2天要將苗種 置換到干凈的池中養(yǎng)殖，對照組魚種按同樣方法換池;具體方法為:將輪養(yǎng)池中間的密封隔 板拔出，采用誘食和驅趕方法將全部魚苗集中到池的另一側，插上密封隔板，加入終濃度 為2ppm的聚維酮碘溶液(有效碘含量為10 % )預防繼發(fā)感染;排凈原來養(yǎng)魚一側的海水，加 入30cm深的淡水，浸泡8小時，即可殺滅所有粘附于池底的刺激隱核蟲包囊，刷洗后排凈淡 水，加注干凈海水待下一次使用;按上述方法輪換養(yǎng)殖5次，魚體上的刺激隱核蟲全部脫落， 整個輪換養(yǎng)殖過程均保持以上的控溫方式;此后將免疫過的魚苗全部放入干凈的養(yǎng)殖池中 養(yǎng)殖，不必控溫，保持自然水溫。 (4) 致死劑量的測定和有效免疫保護期的測定 黑鯛致死劑量的測定在攻毒前兩周進行，從空白對照組隨機取50尾魚，分為10組，每組 5尾，在塑料桶內(nèi)分開喂養(yǎng)。在幼蟲脫包高峰期，收集和計數(shù)2小時內(nèi)脫包的活躍幼蟲，分別 用設定好的劑量梯度感染10組魚，感染用水量為IL海水/尾魚。統(tǒng)計一周內(nèi)各組魚的死亡 數(shù)，能使5尾黑鯛全部死亡的最低感染劑量就是該魚的刺激隱核蟲致死劑量； 攻毒:每30天從對照組和每組免疫過的魚苗中各取50尾魚，用致死劑量的刺激隱核蟲 幼蟲攻毒。攻毒時空白對照組和實驗組混養(yǎng)在一起，海水用量仍為每尾魚1L，同時用致死劑 量的幼蟲進行感染攻毒，統(tǒng)計各個實驗組7天內(nèi)實驗魚的死亡情況，計算免疫9個月內(nèi)的相 對保護率，刺激隱核蟲攻毒后實驗魚的相對保護率(RPS)，RPS=(對照組死亡率-免疫組死 亡率)/對照組死亡率X 100% ; 最后，根據(jù)有效免疫保護期的測定結果，選擇能讓黑鯛獲得最長有效免疫保護期的變 溫感染、養(yǎng)殖方法，來生產(chǎn)抗刺激隱核蟲的黑鯛苗種;采用該方法可生產(chǎn)出免疫保護力高達 8個月以上的抗刺激隱核蟲的黑鯛苗種。
【文檔編號】A01K67/033GK105875445SQ201610236555
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月8日
【發(fā)明人】但學明, 李安興, 李言偉, 莫澤權
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學, 中山大學