一種四倍體冬棗的繁育方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種四倍體冬棗的繁育方法，利用外植體接種、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、過渡煉苗、溫室盆栽、大田苗圃、誘導植株的倍性鑒定、嫁接、果實品質(zhì)的測定步驟的系統(tǒng)化調(diào)整，從而選育出優(yōu)良的四倍體冬棗苗木。使用該方法可獲得優(yōu)質(zhì)的四倍體冬棗植株，屬于無性繁殖，不受季節(jié)影響，使冬棗品種的提純選優(yōu)更加方便和快速，繁育的冬棗樹普遍具有性狀優(yōu)良，抗病、抗逆性強，苗木健壯、節(jié)間短、根系發(fā)達，果實具有個大、無核等特點，具有較高的經(jīng)濟效益。
【專利說明】
一種四倍體冬棗的繁育方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及植株的栽培方法，具體涉及一種四倍體冬棗的繁育方法。
【背景技術】
[0002]目前，我國的水果生產(chǎn)處于一個全新的競爭環(huán)境中，優(yōu)良果品和優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)方式是取得良好效益的關鍵。對于中國原產(chǎn)的特色水果，加大研究力度，提高果品品質(zhì)，增強競爭力，已成為我國果品產(chǎn)業(yè)中的核心問題之一。我國是棗樹的起源地和栽培中心，種植資源非常豐富。但目前的二倍體冬棗存在果實偏小、果核大、果皮薄及貯性差，易遭病蟲害等缺點，而且農(nóng)戶片面追求產(chǎn)量，使用激素處理增大果實，大大降低了冬棗的優(yōu)良品質(zhì)。據(jù)調(diào)查，目前市場上冬棗的優(yōu)質(zhì)棗率不到10%，農(nóng)藥殘留量超標95%以上，優(yōu)質(zhì)率低，農(nóng)藥殘留量高，基本上沒有達到出口標準的高檔棗。這些問題大大限制了沾化冬棗的持續(xù)發(fā)展和市場競爭力，已成為制約沾化冬棗產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的極大障礙。
[0003]另外，多倍化是植物進化的主要方式之一，多倍體植株多表現(xiàn)營養(yǎng)器官和生殖器官的巨大性，具有高的雜和性，較強的適應性和抗逆性。果樹一般具有遺傳上高度雜合、優(yōu)良多倍體品種存在和通常能無性繁殖等特點，更適合多倍體的誘導和培育。到目前為止，已在梨、杏、桃、樹莓、栗、醋栗、蘋果、香蕉、葡萄、草莓、越桔、柑桔、菠蘿、獼猴桃、核桃、櫻桃等果樹上成功地誘導出多倍體植株，大大豐富了世界各國的果樹種質(zhì)資源。多倍化植株的誘導不僅涉及到誘導基因突變的過程，更需要結合特有的培植過程，因為合理的培植過程同時也是植株性狀改進的重要方式之一。而目前棗樹中僅有金絲小棗通過秋水仙素獲得四倍體植株的報道，針對冬棗的四倍體植株誘導及培植結合的研究在本申請之前未見相關報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決以上現(xiàn)有技術中的問題，本發(fā)明創(chuàng)造性的提出一種四倍體冬棗的繁育方法，使用該方法可獲得優(yōu)質(zhì)的四倍體冬棗植株，屬于無性繁殖，不受季節(jié)影響，使冬棗品種的提純選優(yōu)更加方便和快速，繁育的冬棗樹普遍具有性狀優(yōu)良，抗病、抗逆性強，苗木健壯、節(jié)間短、根系發(fā)達，果實具有個大、無核等特點。
[0005]本發(fā)明采取的技術方案如下:
一種四倍體冬棗的繁育方法，其特點在于栽植步驟如下:
(1)外植體接種:在生長季節(jié)剪取剛萌發(fā)的棗頭枝或二次枝頂芽2cm，用無菌水沖洗干凈，然后在超凈臺上用酒精消毒，然后用次氯酸鈉和升汞分別消毒，最后用無菌水沖洗干凈；
(2)初代培養(yǎng):將材料放在解剖鏡下用解剖針剝?nèi)?.3-0.5mm的生長點接種到MS +BA2.0mg/L+ IBA0.4的培養(yǎng)基上，用秋水仙素液體做誘導處理，待發(fā)出的芽長至3cm時，按節(jié)剪成段，作為繼代繁殖材料;所述的秋水仙素設0.05%,0.1%,0.3%,0.5% 4個濃度，處理時間設12h，24h，48h，72h，96h 5個處理時間。
[0006](3)繼代培養(yǎng):將初代培養(yǎng)新抽出的芽梢剪成Icm的莖段，莖段保留一節(jié)以上，轉(zhuǎn)接到MS+BA1.5 +IBA0.5繼代培養(yǎng)基上，將后續(xù)培養(yǎng)形成的芽梢反復轉(zhuǎn)接不斷的分化增殖；
(4)生根培養(yǎng):將繼代培養(yǎng)基上的芽梢剪成Icm帶1-2節(jié)的莖段，接到適宜的生根培養(yǎng)基1/2 MS+NAAlmg/L+ IBA0.5mg/L+LH200mg/L
上培養(yǎng)，試管苗莖段根長達到2cm以上后，脫瓶移栽；
(5)過渡煉苗:當試管苗生根培養(yǎng)5周后，上部長出2cm以上的健壯枝葉，將試管苗移到溫室避光處進行無土基質(zhì)過渡煉苗，移栽初期相對濕度保持在80%左右，溫度28—30°C。
[0007](6)溫室盆栽:煉苗20天后，在溫室內(nèi)將棗苗移入營養(yǎng)缽或小素燒盆中，基質(zhì)用專門配制的營養(yǎng)土(珍珠巖:蛭石:草炭:園土重量份數(shù)比為1: 1: 0.5:0.5)。
[0008](7)大田苗圃:待生長30天后，將棗苗從營養(yǎng)缽或小素燒盆中移入大田苗圃；
(8)誘導植株的倍性鑒定:葉形指數(shù)，節(jié)間作為指標進行形態(tài)學上的鑒定，利用常規(guī)壓片法鑒定誘導植株的染色體數(shù)目，利用熒光顯微鏡觀測保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目，氣乳大小及密度，利用流式細胞儀檢測誘導植株細胞的DNA含量。
[0009](9)嫁接:將鑒定后的四倍體小植株嫁接到成年的冬棗樹上，進行多倍體植株的盆栽抗性試驗、大田抗性試驗，選擇抗性水平高、性狀優(yōu)良的株系。
[0010](10)果實品質(zhì)的測定:對抗性水平高、性狀優(yōu)良的株系進行果實品質(zhì)的測定，果實硬度利用GY-1型圓盤硬度計測定，果實的可溶固形物含量利用ATAGO數(shù)字折射計PRl測定，果實維生素C含量采用差分分析分光光度計法測定，果實的大小和重量測定，果核的有無，從而選育出優(yōu)良的四倍體冬棗苗木。
[0011]以上步驟(I)中消毒步驟具體為:在超凈臺上用70%酒精消毒5s，用5%的次氯酸鈉和0.1 %的升汞分別消毒8min。
[0012]以上步驟(4)中接到生根培養(yǎng)基上8-10d，試管苗莖段的腋芽開始萌動，同時莖段基部產(chǎn)生白色突起，12天后生出3—5條小白根，30—40天后根長達到2cm以上。
[0013]以上步驟(5)中無土基質(zhì)為珍珠巖、蛭石的混合物，具體為無土基質(zhì)為珍珠巖與蛭石質(zhì)量比為1:3混合物。
[0014]本發(fā)明的有益效果為:本申請在無菌條件下，把冬棗植物的組織或單個細胞從植物體上取下，放在由人工控制光照、溫度、濕度和營養(yǎng)物質(zhì)等因素的玻璃容器內(nèi)培養(yǎng)，使它繼續(xù)生存或發(fā)展，最后發(fā)育成一棵完整的冬棗植株，在室內(nèi)人工控制的環(huán)境條件下進行，屬于無性繁殖，可實現(xiàn)快速繁殖生產(chǎn);人工控制，不受季節(jié)影響;節(jié)省土地;可篩選性強，能繁殖無病毒苗；品種提純選優(yōu)更加方便。通過這種方法生產(chǎn)的沾化冬棗苗木能保持其母體優(yōu)良性狀，并脫毒，抗病、抗逆性顯著增強；苗木本身健壯、節(jié)間短、根系發(fā)達;提前進入盛果期，結果品質(zhì)好。
[0015]利用秋水仙素誘導四倍體沾化冬棗，可望在保持棗果優(yōu)良品質(zhì)的同時，使果實變大一倍左右，個體樹增產(chǎn)至少50%，效益有顯著提高，并從根本上解決農(nóng)戶使用激素處理增大果實造成沾化冬棗品質(zhì)嚴重退化的影響;誘導產(chǎn)生的四倍體冬棗由于遺傳物質(zhì)加倍，在貯藏性、抗病性等會有優(yōu)良性狀的變化，儲藏時間更長，儲藏期間水分損失更少;抗病性明顯增強，可大幅減少農(nóng)藥的使用量，從而可以改良土壤結構，減少環(huán)境污染，保護了天敵，維護了生物的多樣性和生態(tài)平衡，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的良性循環(huán)，具有較高的生態(tài)效益。
【具體實施方式】
[0016]下面的實施例是對本發(fā)明的進一步詳細描述。
[0017]實施例:
1.項目研究地點
根據(jù)本項目特點，試驗在多地點開展。高效冬棗精尖培養(yǎng)體系的建立、適應性和抗逆性試驗在沾化縣冬棗研究所進行;植株的倍性鑒定、果實品質(zhì)測定在山東大學生命科學學院細胞工程試驗室進行;冬棗苗木田間選育在沾化縣冬棗研究所下屬的中國高新技術苗木繁育場進行。
[0018]2.項目研發(fā)規(guī)模
項目研究的不同階段，規(guī)模由小到大，抗性鑒定階段由小到大，每種材料的規(guī)模在1000平方米左右，至開發(fā)階段規(guī)模擴大。到項目結束后，建成良種示范基地100畝，達到年產(chǎn)30萬株四倍體冬棗新品種苗木的生產(chǎn)能力。
[0019]3.項目研發(fā)內(nèi)容
(I)以秋水仙素離體處理沾化冬棗莖尖，建立冬棗多倍體誘導技術體系。
[0020](2)利用節(jié)間縮短、葉形指數(shù)變小等外部特征對誘導植株進行初步倍性判定，細胞學檢測和染色體計數(shù)進一步鑒定植株倍性。在此基礎上，利用流式細胞儀測定細胞的DNA含量，最終判定誘導植株的倍性。
[0021](3)將四倍體小苗嫁接到成年棗樹上加速生長和提早結實，同時對四倍體植株進行形態(tài)特征和生長發(fā)育的研究。
[0022](4)觀測四倍體沾化冬棗的棗果性狀和采收期變化，選擇優(yōu)良植株;對采收的棗果進行果實品質(zhì)、貯藏期等方面的研究，選擇果大、質(zhì)優(yōu)的沾化冬棗植株。
[0023](5)在對優(yōu)良四倍體植株進行綜合性狀的分析的基礎上，建立良種苗木示范田，進行苗木產(chǎn)品的繁殖推廣，以盡快在生產(chǎn)上發(fā)揮作用。
[0024]4.研究方法
(I)外植體接種:在4月底5月初剪取剛萌發(fā)的棗頭枝或二次枝頂芽2cm，用無菌水沖洗干凈，然后在超凈臺上用70%酒精消毒5s，用5%的次氯酸鈉和0.1%的升汞分別消毒8min，最后用無菌水沖洗干凈。
[0025](2)初代培養(yǎng):將材料放在解剖鏡下用解剖針剝?nèi)?.3-0.5mm的生長點接種到MS +BA2.0mg/L+IBA0.4的培養(yǎng)基上，用秋水仙素液體做誘導處理，秋水仙素設0.05%,0.1%,
0.3%,0.5% 4個濃度，處理時間設12h，24h，48h，72h，96h 5個處理時間，待發(fā)出的芽長至3cm時，按節(jié)剪成段，作為繼代繁殖材料；
(3)繼代培養(yǎng):將初代培養(yǎng)新抽出的芽梢剪成Icm的莖段，莖段保留一節(jié)以上，轉(zhuǎn)接到MS+BAl.5 +IBA0.5繼代培養(yǎng)基上，將后續(xù)培養(yǎng)形成的芽梢反復轉(zhuǎn)接不斷的分化增殖；
(4)生根培養(yǎng):將繼代培養(yǎng)基上的芽梢剪成Icm帶1-2節(jié)的莖段，接到適宜的生根培養(yǎng)基(1/2 MS + NAAlmg/L+IBA0.5mg/L + LH200mg/L)上培養(yǎng)8-10d，試管苗莖段的腋芽開始萌動，同時莖段基部產(chǎn)生白色突起，12天后生出3—5條小白根，30—40天后根長達到2cm以上后，脫瓶移栽；
(5)過渡煉苗:當試管苗生根培養(yǎng)5周后，上部長出2cm以上的健壯枝葉，將試管苗移到溫室避光處進行無土基質(zhì)過渡煉苗，無土基質(zhì)為珍珠巖與蛭石質(zhì)量比為1:3混合物，移栽初期相對濕度保持在80%左右，溫度28—30°C。
[0026](6)溫室盆栽:煉苗20天后，棗苗枝葉生長良好，在溫室內(nèi)將棗苗移入營養(yǎng)缽或小素燒盆中，基質(zhì)用珍珠巖:蛭石:草炭:園土按重量份數(shù)比為1:1:0.5:0.5配制。
[0027](7)大田苗圃:待生長30天后，且棗苗生長旺盛，將其從營養(yǎng)缽或小素燒盆中移入大田苗圃；
(8)誘導植株的倍性鑒定:利用常規(guī)壓片法鑒定誘導植株的染色體數(shù)目，利用流式細胞儀檢測誘導植株細胞的DNA含量。測得葉形指數(shù)為1.85，節(jié)間平均3.7厘米。利用常規(guī)壓片法鑒定誘導植株的染色體數(shù)目，染色體數(shù)目為48條。利用流式細胞儀所測得的量是相對值，利用流式細胞儀測得為四倍體。
[0028](9)嫁接:將鑒定后的四倍體小植株嫁接到大田中成年的冬棗樹上，進行多倍體植株的抗性(即抗寒、抗旱、抗?jié)?、抗病蟲、抗逆性等)觀察試驗，選擇抗性水平高、性狀優(yōu)良的株系。
[0029](10)果實品質(zhì)的測定:對抗性水平高、性狀優(yōu)良的株系進行果實品質(zhì)的測定，果實硬度利用GY-1型圓盤硬度計測定，果實的可溶固形物含量利用ATAGO數(shù)字折射計PRl測定，果實維生素C含量采用差分分析分光光度計法測定，果實的大小和重量測定，果核的有無，從而選育出優(yōu)良的四倍體冬棗苗木。
[0030]測得的大致指標為:測得果實平均硬度8.7kg/cm2，果實的可溶固形物含量利用ATAGO數(shù)字折射計PRl測定，可溶性固形物為33%。果實維生素C含量采用差分分析分光光度計法測定，維生素C308mg/100g，平均單果重21.09g，最大單果重57.5g，果形指數(shù)為0.918,果核小。但以上指標并非為本發(fā)明篩選的具體點值指標，在以上指標左右的也可以考慮。
[0031]5.實施效果
建立高效離體誘導沾化冬棗四倍植株的技術體系，誘導頻率不低于6%，獲得四倍體沾化冬棗植株400株，然后高接于成年棗樹上，加快生產(chǎn)和果實發(fā)育。然后再獲得四倍體結棗植株300株，從中選出果實增大20%以上，并保持優(yōu)良品質(zhì)的多倍體植株20-30株，選育出在果實耐貯藏性或抗病性增強的植株10株。
[0032]通過培育四倍體植株，其果品體積將明顯增大，個體樹將增產(chǎn)50%，效益有顯著提高，且其耐貯性和抗逆性將顯著增強。
【主權項】
1.一種四倍體冬棗的繁育方法，其特征在于栽植步驟如下: (1)外植體接種:在生長季節(jié)剪取剛萌發(fā)的棗頭枝或二次枝頂芽2cm，用無菌水沖洗干凈，然后在超凈臺上用酒精消毒，然后用次氯酸鈉和升汞分別消毒，最后用無菌水沖洗干凈； (2)初代培養(yǎng):將材料放在解剖鏡下用解剖針剝?nèi)?.3-0.5mm的生長點接種到MS +BA2.0mg/L+ IBA0.4的培養(yǎng)基上，用秋水仙素液體做誘導處理，待發(fā)出的芽長至3cm時，按節(jié)剪成段，作為繼代繁殖材料； (3)繼代培養(yǎng):將初代培養(yǎng)新抽出的芽梢剪成Icm的莖段，莖段保留一節(jié)以上，轉(zhuǎn)接到MS+BAl.5 +IBA0.5繼代培養(yǎng)基上，將后續(xù)培養(yǎng)形成的芽梢反復轉(zhuǎn)接不斷的分化增殖； (4)生根培養(yǎng):將繼代培養(yǎng)基上的芽梢剪成Icm帶1-2節(jié)的莖段，接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，試管苗莖段根長達到2cm以上后，脫瓶移栽； (5)過渡煉苗:當試管苗生根培養(yǎng)5周后，上部長出2cm以上的健壯枝葉，將試管苗移到溫室避光處進行無土基質(zhì)過渡煉苗，移栽初期相對濕度保持在78%-82%，溫度28—30°C ； (6)溫室盆栽:煉苗20天后，在溫室內(nèi)將棗苗移入營養(yǎng)缽或小素燒盆中，基質(zhì)用珍珠巖、輕石、草炭、園土配制的營養(yǎng)土 ； (7)大田苗圃:待生長30天后，將棗苗從營養(yǎng)缽或小素燒盆中移入大田苗圃； (8)誘導植株的倍性鑒定:葉形指數(shù)，節(jié)間作為指標進行形態(tài)學上的鑒定，利用常規(guī)壓片法鑒定誘導植株的染色體數(shù)目，利用熒光顯微鏡觀測保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目，氣乳大小及密度，利用流式細胞儀檢測誘導植株細胞的DNA含量； (9)嫁接:將鑒定后的四倍體小植株嫁接到成年的冬棗樹上，進行多倍體植株的盆栽抗性試驗、大田抗性試驗，選擇抗性水平高、性狀優(yōu)良的株系； (10)果實品質(zhì)的測定:對抗性水平高、性狀優(yōu)良的株系進行果實品質(zhì)的測定，果實硬度利用GY-1型圓盤硬度計測定，果實的可溶固形物含量利用ATAGO數(shù)字折射計PRl測定，果實維生素C含量采用差分分析分光光度計法測定，果實的大小和重量測定，果核的有無，從而選育出優(yōu)良的四倍體冬棗苗木。2.如權利要求1所述的一種四倍體冬棗的繁育方法，其特征在于步驟(I)中消毒步驟具體為:在超凈臺上用70%酒精消毒5s，用5%的次氯酸鈉和0.1%的升汞分別消毒8min。3.如權利要求1所述的一種四倍體冬棗的繁育方法，其特征在于:步驟(4)中接到生根培養(yǎng)基上8-10d，試管苗莖段的腋芽開始萌動，同時莖段基部產(chǎn)生白色突起，12天后生出3—5條小白根，30—40天后根長達到2cm以上。4.如權利要求1或3所述的一種四倍體冬棗的繁育方法，其特征在于:所述的生根培養(yǎng)基為I/2 MS+NAAlmg/L +IBA0.5mg/L+LH200mg/L培養(yǎng)基。5.如權利要求1所述的一種四倍體冬棗的繁育方法，其特征在于:步驟(6)中基質(zhì)用的按珍珠巖、輕石、草炭、園土為I: 1:0.5:0.5的重量份數(shù)比配制的營養(yǎng)土。6.如權利要求1所述的一種四倍體冬棗的繁育方法，其特征在于:步驟(5)中無土基質(zhì)為珍珠巖、蛭石的混合物。7.如權利要求6所述的一種四倍體冬棗的繁育方法，其特征在于:所述的無土基質(zhì)為珍珠巖與蛭石質(zhì)量比為I: 3混合物。8.如權利要求1所述的一種四倍體冬棗的繁育方法，其特征在于:所述的秋水仙素設 .0.05%，0.1%，0.3%，0.5%4個濃度，處理時間設1211，2411，4811，7211，9611 5 個處理時間。
【文檔編號】A01H1/08GK105918117SQ201610367712
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】尹魁林, 于洪長, 許可軍, 劉榮昌, 李占輝
【申請人】沾化縣冬棗研究所