一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蟬花的方法，所述方法包括如下步驟：從野生蟬花中分離篩選出蟬花菌株，將其接種于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至長出菌絲體，再進(jìn)行明暗交替培養(yǎng)，待長滿孢子后，將孢子洗下，制成孢子懸液；以柞蠶活體蠶蛹為寄主，采用注射、浸泡或體噴的方法使用蟬花孢子懸液將柞蠶活體蠶蛹感染；將已感染的柞蠶蠶蛹，培養(yǎng)至蠶蛹變硬，進(jìn)行明暗交替培養(yǎng)。本發(fā)明采用活體蠶蛹為寄主培育蠶蛹蟬花，營養(yǎng)成分豐富、無毒，可以開發(fā)成各種食品及保健品，食用安全可靠；本發(fā)明以柞蠶蠶蛹培育蟬花的方法，培養(yǎng)周期短，技術(shù)工藝簡便，適用于大規(guī)模化生產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于培育蟬花的方法，具體涉及一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蝴花(Cordycepscicadae)為麥角菌科大蝴草(Cordyceps cicadae Shing)寄生在蟬科昆蟲山蟬若蟲上的子座及若蟲尸體的復(fù)合體，是我國傳統(tǒng)的一種名貴中藥材。在中國，蟬花被用作傳統(tǒng)的中藥材和食物已經(jīng)有1500多年，遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于冬蟲夏草?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明蟬花含多種活性成分，具有治療小兒抽搐、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜、改善腎功能、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)等功用，是一種與冬蟲夏草相近的珍貴藥材，可作為冬蟲夏草的替代品。
[0003]蟬花市場需求量日益增大，然而蟬花生長需要特定的生態(tài)環(huán)境和寄主昆蟲，自然出產(chǎn)率較低，再加上人們長期大量采挖，資源日趨減少。為了滿足市場和臨床的需求，近年來，科研人員開展了蟬花的人工培育研究，并取得了一定的進(jìn)展。目前，國內(nèi)外已有一些關(guān)于蟬花人工培養(yǎng)技術(shù)的公開報(bào)道。例如，“一種蟬花的培養(yǎng)方法(CN103392500A)”，將蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)活化后接種于培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)至長出菌蕾后，避光進(jìn)行通風(fēng)培養(yǎng)，培養(yǎng)40天左右即可收獲子實(shí)體。“以蟬幼蟲為寄主的蟬花子實(shí)體及其培育方法(CN102763560A)”，將蛹蟲草子實(shí)體在固體培養(yǎng)基上經(jīng)孢子分離提純復(fù)壯，得到蛹蟲草菌絲體，經(jīng)用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，制成液體菌種，對金蟬幼蟲進(jìn)行處理，在蟬幼蟲身體上用無菌針扎小洞，用無菌注射器吸入液體菌種注入蟬幼蟲體后背，將已注射感染的蟬幼蟲置于無菌的組培瓶內(nèi)，用注射器將0.1ml液體菌種注入蟬幼蟲外體，蓋上瓶蓋，培養(yǎng)至蟬花子實(shí)體長至3cm長?！耙环N蟬花仿生的培養(yǎng)方法(CN103975765A)”，以蟬花的生態(tài)環(huán)境和生長規(guī)律為依據(jù)，采用微生物工程技術(shù)、生態(tài)學(xué)和栽培學(xué)的方法，進(jìn)行蟬花仿生培養(yǎng)栽培技術(shù)系統(tǒng)研究，確立蟬花在天然竹林下仿生栽培技術(shù)操作規(guī)程，建立仿生態(tài)體系，從而獲得優(yōu)質(zhì)蟬花原料?！耙环N人工金蟬花的生產(chǎn)方法(CN103598014A)”，將野生金蟬花低溫除濕，進(jìn)行干燥，收集蟬花孢子粉，按照孢子粉與培養(yǎng)基以重量比為I: 1000比例混合，將混合后的培養(yǎng)基在15-25°C下培養(yǎng)20-30天獲得蟬花。“一種蟬擬青霉人工培養(yǎng)的方法及其培養(yǎng)產(chǎn)物的應(yīng)用(CN102242070A)”經(jīng)過菌種制備、配料裝盒、滅菌、接種、固體發(fā)酵、采收等步驟大規(guī)模人工培養(yǎng)蟬擬青霉，采用玉米粉、麩皮、小麥、大麥、大米、粟、高粱等谷物與甘蔗渣、蔗糖、貝殼粉、蠶蛹粉、硝酸鉀為培養(yǎng)基培養(yǎng)蟬擬青霉?！耙环N蟬花的人工培養(yǎng)方法(CN101225362A)”，選擇蟬擬青霉異核體菌株，經(jīng)用培養(yǎng)基培養(yǎng)蟬擬青霉I周后，用0.05%吐溫80水將蟬擬青霉孢子洗下并稀釋成蟬擬青霉孢子液，將感染體(家蠶老熟幼蟲)置于蟬擬青霉孢子液中感染后，20 °C-28 °C培養(yǎng)2-3周獲得蟬花。
[0004]柞蠶蠶蛹營養(yǎng)成分高，富含蛋白質(zhì)、脂類和活性物質(zhì)，含有賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸等8種人體必需氨基酸。柞蠶蛹能烹調(diào)色香味倶全的風(fēng)味食品，是東北人招待親朋好友的上等美味，通過精加工可制作出許多別具風(fēng)味的高級菜肴。因柞蠶蛹個(gè)體大，蛹期時(shí)間長，近年來，柞蠶蛹作為基質(zhì)培養(yǎng)蛹蟲草逐漸成為柞蠶業(yè)多用途利用領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但是，迄今為止，還沒有采用柞蠶蠶蛹培育蟬花的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法。本發(fā)明采用柞蠶活體蠶蛹為寄主培育蠶蛹蟬花，營養(yǎng)成分高、無毒，可以開發(fā)成各種食品及保健品，食用安全可靠;本發(fā)明以柞蠶蠶蛹培育蟬花的方法，培養(yǎng)周期短，技術(shù)工藝簡便，適用于大規(guī)?；a(chǎn)。
[0006]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，包括如下步驟:
[0007](I)從野生蟬花中分離篩選出蟬花菌株，將蟬花菌株培養(yǎng)至長出菌絲體，再進(jìn)行明暗交替培養(yǎng)，待長滿孢子后，將孢子洗下，制成蟬花孢子懸液；
[0008](2)對柞蠶活體蠶蛹體表進(jìn)行消毒;通過蟬花孢子懸液對柞蠶蠶蛹進(jìn)行感染；
[0009](3)將已感染的柞蠶蠶蛹，培養(yǎng)至蠶蛹變硬，且節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體；
[0010](4)將變硬的蠶蛹，放在無菌環(huán)境中，進(jìn)行明暗交替培養(yǎng)。
[0011 ]進(jìn)一步地，步驟(I)所述將蟬花菌株培養(yǎng)至長出菌絲體為將蟬花菌株接種于TOA固體培養(yǎng)基上，20-22 °C暗培養(yǎng)8-10天至長出菌絲體。
[0012]進(jìn)一步地，步驟(I)所述將孢子洗下為通過0.03-0.07%吐溫80的無菌水將孢子洗下。
[0013]進(jìn)一步地，步驟(I)所述明暗交替培養(yǎng)具體步驟為22_24°C明暗交替培養(yǎng)，周期為12-14h，光照強(qiáng)度250-350LX，濕度85%-95%，培養(yǎng)時(shí)間為10-12d;步驟(4)所述明暗交替培養(yǎng)具體步驟為20-25°C明暗交替培養(yǎng)，周期為10-14h，光照強(qiáng)度150-400LX，濕度85%-95%，培養(yǎng)時(shí)間為15-30d。該生長條件模擬野生蟬花自然生長條件，得到的蟬花不僅外形與野生蟬花相似，而且質(zhì)量與野生蟬花相當(dāng)。
[OOM]進(jìn)一步地，步驟(I)所述蝴花孢子懸液濃度為14-1O7個(gè)/mL。
[0015]進(jìn)一步地，步驟(2)所述對柞蠶蠶蛹進(jìn)行感染為用注射器在蠶蛹皮下組織注射ΙΟ-? 5ul蝴花孢子懸液 ，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中 。
[0016]進(jìn)一步地，步驟(2)所述對柞蠶蠶蛹進(jìn)行感染為將蠶蛹放在蟬花孢子懸液中浸泡10-15min后取出，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中。
[0017]進(jìn)一步地，步驟(2)所述對柞蠶蠶蛹進(jìn)行感染為通過噴霧的方法在蠶蛹體表噴射蟲單花孢子懸液，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中。
[0018]進(jìn)一步地，步驟(3)所述培養(yǎng)至蠶蛹變硬為20-25 °C暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬。
[0019]進(jìn)一步地，步驟(4)所述無菌環(huán)境為煮沸0.5-1.5h滅菌的沙子或者無菌塑料盒。
[0020]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法具有如下優(yōu)點(diǎn):柞蠶蛹為蛹滯育，蛹期時(shí)間長，用來培育蟬花不受季節(jié)限制;采用柞蠶活體蠶蛹為寄主培育蠶蛹蟬花，營養(yǎng)成分高、無毒，可以開發(fā)成各種食品及保健品，食用安全可靠;本發(fā)明的培育方法，培養(yǎng)周期短，技術(shù)工藝簡便，適用于大規(guī)模化生產(chǎn);本發(fā)明一方面為柞蠶蛹資源高附加值的開發(fā)利用提供了新途徑，有利于提高柞蠶業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益;另一方面，近年來由于蟲草需求量大增，導(dǎo)致冬蟲夏草價(jià)格直線上升，進(jìn)而推動了對蟬花的需求，同時(shí)隨著蟬花生態(tài)環(huán)境破壞，蟬花資源即將面臨枯竭的問題，因此，本發(fā)明對保護(hù)蟬花野生資源、維持生態(tài)平衡具有潛在的社會效益。
【附圖說明】
[0021]圖1為實(shí)施例1條件下培育的蟬花樣本；
[0022]圖2為實(shí)施例2條件下培育的蟬花樣本；
[0023]圖3為實(shí)施例3條件下培育的蟬花樣本；
[0024]圖4為實(shí)施例4條件下培育的蟬花樣本。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0026]實(shí)施例1
[0027]1、從采集于浙江安吉竹林的野生蟬花中分離，經(jīng)多代篩選獲得能夠感染柞蠶蛹的蟬花菌株，將其接種于TOA固體培養(yǎng)基上，20°C暗培養(yǎng)10天至長出菌絲體后，再進(jìn)行24°C明暗交替培養(yǎng)，周期為14h，光照強(qiáng)度350Lx，濕度95 %，培養(yǎng)時(shí)間為1d。待長滿孢子后，用
0.03%吐溫80的無菌水將孢子洗下，制成蟬花孢子懸液，稀釋至濃度為14個(gè)/mL。
[0028]2、通過噴霧的方法用75%酒精對柞蠶蠶蛹體表進(jìn)行消毒，用微量注射器在柞蠶蠶蛹皮下組織注射1ul的蟬花孢子懸液，接種后迅速放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行感染。
[0029]3、將已感染的柞蠶蠶蛹，在20°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬，節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體，一般約為1d。
[0030]4、將變硬的柞蠶蠶蛹，埋入煮沸0.5h滅菌的沙子中，轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)箱，進(jìn)行25°C明暗交替培養(yǎng)，周期為14h，光照強(qiáng)度400Lx，濕度95%，培養(yǎng)15d得到圖1所示的蟬花樣本。
[0031]實(shí)施例2
[0032]1、從采集于浙江安吉竹林的野生蟬花中分離，經(jīng)多代篩選獲得能夠感染柞蠶蛹的蟬花菌株，將其接種于PDA固體培養(yǎng)基上，21°C暗培養(yǎng)9天至長出菌絲體后，再進(jìn)行23°C明暗交替培養(yǎng)，周期為12h，光照強(qiáng)度300Lx，濕度90%，培養(yǎng)時(shí)間為I Id。待長滿孢子后，用0.05%吐溫80的無菌水將孢子洗下，制成蟬花孢子懸液，稀釋至濃度為16個(gè)/mL。
[0033]2、通過噴霧的方法用75%酒精對柞蠶蠶蛹體表進(jìn)行消毒，將蠶蛹放在蟬花孢子懸液中浸泡1min后取出，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行感染。
[0034]3、將已感染的柞蠶蠶蛹，在22°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬，節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體，一般約為15d。
[0035]4、將變硬的柞蠶蠶蛹，放入無菌塑料盒中，并覆蓋一層保鮮膜，轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)箱，進(jìn)行220C明暗交替培養(yǎng)，周期為12h，光照強(qiáng)度300Lx，濕度90 %，培養(yǎng)20d得到圖2所示蟬花樣本。
[0036]實(shí)施例3
[0037]1、從采集于浙江安吉竹林的野生蟬花中分離，經(jīng)多代篩選獲得能夠感染柞蠶蛹的蟬花菌株，將其接種于PDA固體培養(yǎng)基上，22°C暗培養(yǎng)8天至長出菌絲體后，再進(jìn)行22°C明暗交替培養(yǎng)，周期為12h，光照強(qiáng)度250Lx，濕度85 %，培養(yǎng)時(shí)間為12d。待長滿孢子后，用0.07 %吐溫80的無菌水將孢子洗下，制成蟬花孢子懸液，稀釋至濃度為15個(gè)/mL。
[0038]2、通過噴霧的方法用75%酒精對柞蠶蠶蛹體表進(jìn)行消毒，用微量注射器在柞蠶蠶蛹皮下組織注射15ul的蟬花孢子懸液，接種后迅速放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行感染。
[0039]3、將已感染的柞蠶蠶蛹，在25°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬，節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體，一般約為8d。
[0040]4、將變硬的柞蠶蠶蛹，埋入煮沸1.5h滅菌的沙子中，轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)箱，進(jìn)行20°C明暗交替培養(yǎng)，周期為10h，光照強(qiáng)度150LX，濕度85%，培養(yǎng)30d得到圖3所示的蟬花樣本。
[0041 ] 實(shí)施例4
[0042]1、從采集于浙江安吉竹林的野生蟬花中分離，經(jīng)多代篩選獲得能夠感染柞蠶蛹的蟬花菌株，將其接種于PDA固體培養(yǎng)基上，22°C暗培養(yǎng)9天至長出菌絲體后，再進(jìn)行22°C明暗交替培養(yǎng)，周期為12h，光照強(qiáng)度300Lx，濕度90%，培養(yǎng)時(shí)間為1d。待長滿孢子后，用0.05%吐溫80的無菌水將孢子洗下，制成蟬花孢子懸液，稀釋至濃度為17個(gè)/mL。
[0043]2、通過噴霧的方法用75%酒精對柞蠶蠶蛹體表進(jìn)行消毒，將蠶蛹放在蟬花孢子懸液中浸泡15min后取出，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行感染。
[0044]3、將已感染的柞蠶蠶蛹，在23°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬，節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體，一般約為15d。
[0045]4、將變硬的柞蠶蠶蛹，放入無菌塑料盒中，并覆蓋一層保鮮膜，轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)箱，進(jìn)行23°C明暗交替培養(yǎng)，周期為12h，光照強(qiáng)度200Lx，濕度90%，培養(yǎng)23d得到圖4所示的蟬花樣本。
[0046]實(shí)施例5
[0047]1、從采集于浙江安吉竹林的野生蟬花中分離，經(jīng)多代篩選獲得能夠感染柞蠶蛹的蟬花菌株，將其接種于TOA固體培養(yǎng)基上，21°C暗培養(yǎng)10天至長出菌絲體后，再進(jìn)行23°C明暗交替培養(yǎng)，周期為13h，光照強(qiáng)度300Lx，濕度90 %，培養(yǎng)時(shí)間為12d。待長滿孢子后，用
0.05%吐溫80的無菌水將孢子洗下，制成蟬花孢子懸液，稀釋至濃度為15個(gè)/mL。
[0048]2、通過噴霧的方法用75%酒精對柞蠶蠶蛹體表進(jìn)行消毒，在通過噴霧的方法在蠶蛹體表噴射蟬花孢子懸液，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行感染。
[0049]3、將已感染的柞蠶蠶蛹，在22°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬，節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體，一般約為12d。
[0050]4、將變硬的柞蠶蠶蛹，放入無菌塑料盒中，并覆蓋一層保鮮膜，轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)箱，進(jìn)行22°C明暗交替培養(yǎng)，周期為12h，光照強(qiáng)度250Lx，濕度90%，培養(yǎng)時(shí)間為25d。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)從野生蟬花中分離篩選出蟬花菌株，將蟬花菌株培養(yǎng)至長出菌絲體，再進(jìn)行明暗交替培養(yǎng)，待長滿孢子后，將孢子洗下，制成蝴花孢子懸液； (2)對柞蠶活體蠶蛹體表進(jìn)行消毒;通過蟬花孢子懸液對柞蠶蠶蛹進(jìn)行感染； (3)將已感染的柞蠶蠶蛹，培養(yǎng)至蠶蛹變硬，且節(jié)間出現(xiàn)白色菌絲體； (4)將變硬的蠶蛹，放在無菌環(huán)境中，進(jìn)行明暗交替培養(yǎng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(I)所述將蟬花菌株培養(yǎng)至長出菌絲體為將蟬花菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上，20-22Γ暗培養(yǎng)8-10天至長出菌絲體。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(I)所述將孢子洗下為通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03-0.07 %吐溫80的無菌水將孢子洗下。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(I)所述明暗交替培養(yǎng)具體步驟為22-240C明暗交替培養(yǎng)，周期為12-14h，光照強(qiáng)度250-350Lx，濕度85%-95%，培養(yǎng)時(shí)間為10-12d;步驟(4)所述明暗交替培養(yǎng)具體步驟為20-25°C明暗交替培養(yǎng)，周期為10_14h，光照強(qiáng)度150-400Lx，濕度85%-95%，培養(yǎng)時(shí)間為15-30d。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(1)所述蟬花孢子懸液濃度為14-1O7個(gè)/mL。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(2)所述對柞蠶蠶蛹進(jìn)行感染為用注射器在蠶蛹皮下組織注射10-15ul蟬花孢子懸液，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(2)所述對柞蠶蠶蛹進(jìn)行感染為將蠶蛹放在蟬花孢子懸液中浸泡10-15min后取出，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(2)所述對柞蠶蠶蛹進(jìn)行感染為通過噴霧的方法在蠶蛹體表噴射蟬花孢子懸液，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(3)所述培養(yǎng)至蠶蛹變硬為20-25°C暗培養(yǎng)至蠶蛹變硬。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述以柞蠶蠶蛹為寄主人工培育蠶蛹蟬花的方法，其特征在于，步驟(4)所述無菌環(huán)境為煮沸0.5-1.5h滅菌的沙子或者無菌塑料盒。
【文檔編號】A01G1/04GK105940956SQ201610395291
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】唐順明, 沈興家, 魏兆軍, 曾光遠(yuǎn), 劉莉萍, 張有做, 趙巧玲, 趙珊珊, 張偉
【申請人】江蘇科技大學(xué)