戊炔草胺套罩刺葡萄芽的倍性誘變方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種戊炔草胺套罩刺葡萄芽的倍性誘變方法，包括以下步驟：（1）將戊炔草胺溶于二甲基亞砜溶劑中，再用水稀釋至戊炔草胺的質(zhì)量濃度0.003%?0.007%，獲得戊炔草胺溶液；（2）將所述戊炔草胺溶液制成戊炔草胺瓊脂膏，套罩于正處于萌芽狀態(tài)的刺葡萄芽上5?7天，即完成刺葡萄芽的倍性誘變。本發(fā)明通過套罩法誘導(dǎo)處于萌芽生長狀態(tài)的刺葡萄芽而成功獲得刺葡萄四倍體，主要試劑為戊炔草胺。作用于刺葡萄芽的戊炔草胺溶液濃度為0.005%時，誘變效果最好，誘變率高達60%以上。
【專利說明】
戊炔草胺套罩刺葡萄芽的倍性誘變方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種戊炔草胺套罩刺葡萄芽的倍性誘變方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 刺葡萄(V.davidii.Foex)屬東亞種群，2n = 2x = 38,是我國南方主要野生葡萄之 一，主要分布在長江以南亞熱帶溫濕雨林叢山中，能較好適應(yīng)高溫多濕氣候條件，對葡萄常 患病害白腐病、炭疽病、黑痘病等具有很好抗性，適應(yīng)性強，這一獨特表現(xiàn)為南方葡萄無公 害化種植描繪了廣闊前景，也為葡萄耐濕性砧木及新品種選育等方面提供了優(yōu)秀資源與材 料。刺葡萄的新蔓、嫩葉與果實色彩非常豐富，觀賞效果與價值比普通葡萄更高，是公園、庭 院等處優(yōu)良垂直觀賞綠化植物。大多數(shù)刺葡萄果粒的皮色為蘭黑色或蘭紫色，藥用效果與 價值比一般葡萄更顯著，更有利于人們身體健康。與栽培于長江以南的其它葡萄相比，刺葡 萄更適于葡萄的加工與釀酒，其附加產(chǎn)品更豐富，附加值更高。因刺葡萄具有上述幾方面獨 特表現(xiàn)，長江以南許多地方的農(nóng)民已把野生刺葡萄家植化并獲得了極大成功。
[0003] 刺葡萄果粒較小，果內(nèi)含種子較多。已有利用秋水仙素處理刺葡萄已萌動種子和 生長芽，誘其染色體加倍而成功獲得刺葡萄多倍體的研究報道。但秋水仙素是一劇毒植物 堿，操作過程中稍有不慎，即對處理對象和操作者帶來極大危害。
[0004] 現(xiàn)在還沒有將戊炔草胺運用于刺葡萄并誘導(dǎo)刺葡萄染色體加倍的成功報道，本研 究的意義是首次利用戊炔草胺(Propyzamid)作用于已處于生長狀態(tài)的刺葡萄芽并對其進 行倍性誘導(dǎo)，為得到粒大優(yōu)質(zhì)，少籽或無籽的刺葡萄多倍體新品種提供優(yōu)良的種質(zhì)資源與 新品系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是，將戊炔草胺應(yīng)用于刺葡萄芽的倍性誘變，并探索適宜 的倍性誘變條件。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是，提供一種戊炔草胺套罩刺葡萄芽的倍性誘變方法，包括以 下步驟：
[0007] (1)將戊炔草胺溶于二甲基亞砜溶劑中，再用水稀釋至戊炔草胺的質(zhì)量濃度 0.003 % -0.007 %，獲得戊炔草胺溶液；
[0008] (2)將所述戊炔草胺溶液制成戊炔草胺瓊脂膏，套罩于正處于萌芽狀態(tài)的刺葡萄 芽上5-7天，即完成刺葡萄芽的倍性誘變。
[0009] 進一步地，所述戊炔草胺溶液中二甲基亞砜的質(zhì)量濃度為0.04%-0.08%。
[0010] 進一步地，在溫度為13-18°c的條件下將所述戊炔草胺瓊脂膏套罩在刺葡萄芽上。
[0011] 進一步地，所述戊炔草胺溶液中最適戊炔草胺的質(zhì)量濃度為0.005 %。
[0012] 進一步地，所述套罩時間為6天。
[0013] 戊炔草胺（Propyzamide，CAS: 23950-58-5，分子式：C12H11C12NO;分子量 256 · 13)又 叫快敵蜱;拿草特;戊炔草胺;炔苯酰草胺;戊炔草胺標準品；戊炔草胺標準溶液等。它屬除 草劑的一種，對植物微管蛋白有很強的結(jié)合力，能有效阻止植物微管的聚合，誘導(dǎo)植物染色 體加倍。與秋水仙素相比，戊炔草胺具有低毒性、低濃度、低成本、高效率誘導(dǎo)染色體加倍等 特點，目前的市場價格為Ig/元。
[0014] 本發(fā)明的主要創(chuàng)新在于：1、本發(fā)明利用套罩法，使用戊炔草胺溶液處理刺葡萄芽， 成功地對刺葡萄芽實現(xiàn)了倍性誘變。戊炔草胺溶液濃度對刺葡萄芽誘變率的影響很大，本 發(fā)明通過實驗探索出誘導(dǎo)刺葡萄芽發(fā)生倍性變異的合適戊炔草胺溶液濃度為0.003%-0.007% (本發(fā)明中的濃度均指質(zhì)量濃度），最佳濃度為0.005%，最佳套罩時間為6天;該用 量與秋水仙素的用量相比，濃度低了一百多倍。2、正處于萌芽狀態(tài)的刺葡萄芽的細胞分裂 旺盛，本發(fā)明在此階段進行套罩，并通過合理控制套罩時間，染色體加倍的概率提高，使得 刺葡萄芽成功發(fā)生倍性變異。3、用二甲基亞砜(DMSO)做戊炔草胺淡黃色晶狀粉末的溶劑， 可以增強戊炔草胺溶液對刺葡萄芽的滲透作用，可以在低戊炔草胺溶液濃度條件下實現(xiàn)較 好的滲透，提高刺葡萄芽細胞內(nèi)染色體誘變效果，避免了刺葡萄芽受更高藥劑濃度的滲透 作用的影響，降低了葡萄芽的死亡率(刺葡萄芽用0.005%的戊炔草胺瓊脂膏套罩6d，萌芽 率仍可達66.7%)。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明通過套罩法成功誘導(dǎo)刺葡萄芽而獲得了刺葡萄四倍 體，套罩使用的戊炔草胺瓊脂膏，最合適的濃度為〇 . 005 %左右，誘變率高達60 %以上。目 前，戊炔草胺于生產(chǎn)上普遍做一種除草劑在使用，而秋水仙素是一種從百合科植物中提取 的劇毒植物堿，所以無論從濃度、毒性、成本、誘導(dǎo)效率高低等幾方面看，植物倍性誘導(dǎo)試驗 中如能更多地利用戊炔草胺替代秋水仙素作誘變劑，低濃度、低毒性、低成本、高誘導(dǎo)效率 的優(yōu)勢將非常明顯。
【附圖說明】
[0016] 圖1表示刺葡萄二倍體染色體(2n = 2x = 38)(X5500);
[0017] 其中，"X"表示顯微鏡放大位數(shù)；
[0018] 圖2表示刺葡萄四倍體染色體(2n-4x = 76) ( X 5500);
[0019] 圖3表示對照(2n)刺葡萄氣孔（X800);
[0020]圖4表示變異體(4n)刺葡萄氣孔（X800)。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0022] 實施例1
[0023]試材與戊炔草胺瓊脂膏的制備
[0024] 2014年3月21日，從刺葡萄植株上選取生長大致相同、有15個芽（多的側(cè)芽抹除）、 且已處于活動狀態(tài)的枝蔓12條，并將選中的枝蔓拉平綁縛。
[0025]戊炔草胺瓊脂膏(培養(yǎng)基）的制備:將戊炔草胺配制成濃度為0.05%的母液，后分 別稀釋配成濃度為0.003%、0.004%、0.005%、0.006%、0.007%的戊炔草胺溶液。將瓊脂 (10%)充分溶解至上述各戊炔草胺溶液與清水中，分別制成用防水膠囊盛裝的各濃度戊炔 草胺瓊脂膏與清水對照瓊脂膏。
[0026] 處理方法
[0027] 該試驗以套罩法進行。以清水瓊脂膏套罩為對照，3個處理;每處理套罩表現(xiàn)大致 相同的刺葡萄2枝蔓上芽2X15 = 30個，并用黑色膠布固定防水膠囊。
[0028] 套罩6d后，去掉膠囊，用清水洗凈粘附于芽與枝蔓上的瓊脂，后隨著枝蔓的生長發(fā) 育，仔細觀測各處理枝蔓上芽發(fā)生出的葉片、枝蔓、果等組織器官生長發(fā)育情況與誘變效 應(yīng)。
[0029] 觀測伴隨刺葡萄新蔓的抽發(fā)與生長進行。
[0030] 各處理萌芽率統(tǒng)計方法：
[0031] 萌芽率=萌芽數(shù)/處理芽數(shù)(30個）X 100%
[0032]各處理誘變率統(tǒng)計方法：
[0033]誘變率=產(chǎn)生的變異枝蔓數(shù)/鏡檢枝蔓數(shù)X 100%。
[0034]葉片形態(tài)與含水量觀測方法
[0035] 分別采集已停止生長，具有明顯變異特征葉片（2n-4x = 76)與對照葉片（2n = 2x = 38)各50片，用電子數(shù)顯卡尺測量各處理葉片厚度，求平均值；用有機玻璃直尺測量各處 理葉片的長度與寬度，分別求平均值；用電子天平稱取各處理葉片鮮重(W鮮)；利用烘干法在 烘箱里先70°C、后105°C將各處理葉片烘至恒重(W干)，利用數(shù)學方法計算變異體葉片(4n)與 對照葉片(2n)含水量:葉片含水量=(W鮮-W干)/W鮮X 100%。
[0036]氣孔觀測方法
[0037] 晴天上午8:30~10:00,分別取已停止生長、具有明顯變異特征葉片(4n)與對照葉 片（2n)各10片。用毛筆醮火膠棉溶液于葉背主脈兩側(cè)涂一薄層，2~4min后用鑷子揭下溶 膠，去掉葉背絨毛。然后再于主脈兩側(cè)涂抹一層，取下凝膠印膜，置于顯微鏡下觀察并拍 照。
[0038]枝蔓粗度與節(jié)間長短觀測方法
[0039]分別選取已停止生長或進入緩慢生長，具有明顯變異特征的枝蔓(4n)與對照枝蔓 (2n)各5條，分別測量第3~12節(jié)(5 X 10 = 50節(jié))節(jié)間粗度，求平均值;用有機玻璃直尺分別 測量第3~12節(jié)(5 X 10 = 50節(jié))節(jié)間長度，求平均值。
[0040]果實內(nèi)在與外在品質(zhì)觀測方法
[0041] 2015年9月15日，從具有明顯變異特征枝蔓與對照枝蔓上剪取果穗各15穗，用電子 天平分別稱取果穗重量，計算4n與2n果穗與果粒平均重量；用便攜式手持數(shù)顯糖度計分別 測量上述二者可溶性固形物含量，求平均值。
[0042]結(jié)果分析
[0043] 本實施例在采用去壁低滲法對選取的莖尖進行鏡檢的同時，觀測了染色體數(shù)目 (圖1，2)。單元視野中觀察到對照刺葡萄染色體數(shù)目為2n = 2x = 38,而刺葡萄變異類型的染 色體數(shù)目大多為2n-4x = 76，有少量的為2n = 2x = 38+4、2n = 2x = 38+6等類型。
[0044] 戊炔草胺對刺葡萄生長芽的倍性誘變效應(yīng)結(jié)果分析
[0045] 從表1可以看出，用不同濃度的戊炔草胺膠囊套罩相應(yīng)芽后，芽的萌芽率隨戊炔草 胺濃度的升高而降低，而變異率在濃度為0.003 %~0.005%范圍內(nèi)呈上升趨勢，超過 0.005%，盲芽率(芽的死亡率)升高，變異率因此受抑制而降低。據(jù)此，0.005%濃度的戊炔 草胺對處于生長狀態(tài)的刺葡萄芽有最好的倍性誘變效果，其倍性誘導(dǎo)率達62.5%，且染色 體數(shù)量大多由（2n = 2x = 38)變成了（2n-4x = 76)(見圖1與圖2)。
[0046]表1不同套罩濃度的戊炔草胺對刺葡萄生長芽倍性誘變效果
[0048] 注:表中小寫英文字母表示p 50.05
[0049] 戊炔草胺對刺葡萄葉片的形態(tài)影響
[0050] 采集具有明顯變異特征的葉片(4n) 50片、對照（2n)葉片50片，從形態(tài)、大小、葉片 厚度等方面進行了觀測與分析:從葉片形態(tài)方面觀察，對照刺葡萄葉片(2n)為闊卵形，受戊 炔草胺影響產(chǎn)生的倍性變異葉片(4n)為心形;變異體葉片的葉色比對照的更濃綠，變異體 葉片葉面較脆且更粗糙；已產(chǎn)生倍性變異的葉片比對照的更厚(見表2);對照葉片雖比已產(chǎn) 生倍性變異的葉片長且寬，但從測得的葉片含水量高低方面分析，發(fā)生倍性變異的葉片比 對照的含水量要低，干物質(zhì)含量相對較高(見表2)。
[0051] 表2刺葡萄對照(2n)與倍性變異體(4n)葉片形態(tài)比較
[0053] 注:表中小寫英文字母表示p 50.05
[0054] 戊炔草胺對葉片氣孔形態(tài)與大小的影響
[0055] 把從變異體與對照葉的葉背取下的凝膠印膜置于顯微鏡下進行觀測:變異體葉片 氣孔(4n)的長度和寬度均大于對照(2n)，說明變異體葉片的氣孔比對照大?？磮D3和圖4,變 異體葉片的氣孔密度比對照的小(見圖3、4)。
[0056] 戊炔草胺對刺葡萄枝蔓粗度與節(jié)間長度的影響
[0057] 從表3可以看出，刺葡萄變異四倍體的節(jié)間長度與對照二倍體的相比，節(jié)間明顯變 短，是對照的54.40%;枝蔓節(jié)間粗度也明顯變細，僅對照的50.10%。這與同源多倍體的生 長速率一般低于二倍體有關(guān)。
[0058] 表3戊炔草胺對刺葡萄枝蔓粗度與節(jié)間長度的影響
[0060] 注:表中小寫英文字母表示P = 0.05
[0061] 湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學院藤本園中栽植的變異四倍體刺葡萄果實成熟期與對 照二倍體的無明顯差異，二者都于8/下旬~9/上中旬成熟。成熟后果粒顏色都為藍黑色，顏 色深淺并無顯著區(qū)別。從表4可以看出，4η果穗與果粒雖比2η都稍大，稍重，但都未達到顯 著水平。變異四倍體的可溶性固形物含量達19.39%，比對照的11.15%明顯要高。
[0062]表4戊炔草胺對果實外形與可溶性固形物的影響
[0064] 注:表中小寫英文字母表示pf 0.05
[0065] 實施例2
[0066] 本實施例還提供刺葡萄芽在不同套罩時間的倍性誘變效果試驗。試驗結(jié)果表明， 用0.005%濃度的戊炔草胺作用刺葡萄芽6天，其誘變率達到60%以上，倍性誘變效果仍然 最好;當套罩時間延長時，萌芽率明顯下降。
[0067] 表5不同套罩時間對刺葡萄生長芽倍性誘變效果
【主權(quán)項】
1. 一種戊炔草胺套罩刺葡萄芽的倍性誘變方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將戊炔草胺溶于二甲基亞砜溶劑中，再用水稀釋至戊炔草胺的質(zhì)量濃度0.003%- 0.007%，獲得戊炔草胺溶液； (2) 將所述戊炔草胺溶液制成戊炔草胺瓊脂膏，套罩于正處于萌芽狀態(tài)的刺葡萄芽上 5-7天，即完成刺葡萄芽的倍性誘變。2. 如權(quán)利要求1所述的倍性誘變方法，其特征在于，所述戊炔草胺溶液中二甲基亞砜的 質(zhì)量濃度為〇. 〇4%-〇. 08%。3. 如權(quán)利要求1所述的倍性誘變方法，其特征在于，在溫度為13-18Γ的條件下將所述 戊炔草胺瓊脂膏套罩于刺葡萄芽上。4. 如權(quán)利要求1所述的倍性誘變方法，其特征在于，所述戊炔草胺溶液中戊炔草胺的質(zhì) 量濃度為0.005%。5. 如權(quán)利要求1所述的倍性誘變方法，其特征在于，所述套罩時間為6天。
【文檔編號】A01H1/08GK105941141SQ201610375056
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】蔡冬元, 林繼華, 劉芳, 歐陽英, 徐蘭, 徐一蘭, 鄧建平
【申請人】湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學院