一種板栗體細胞胚的誘導方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)，具體公開了一種板栗的體細胞胚的誘導方法，將板栗的幼胚胚尖作為外植體，進行體細胞胚的誘導培養(yǎng)，所述幼胚胚尖優(yōu)選取自開花后45～54天的板栗。本發(fā)明以主栽品種‘燕山紅栗’板栗作為試驗材料，以幼胚胚尖作為外植體，并優(yōu)化了采集時間和誘導方法，對板栗體細胞胚發(fā)育過程進行研究，為今后進一步建立板栗轉基因再生體系進行核心種質遺傳改良奠定了堅實的基礎。
【專利說明】
一種板栗體細胞胚的誘導方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)，具體地說，涉及板栗的體細胞胚的誘導。
【背景技術】
[0002] 板栗(Castanea mollissima)是殼斗科栗屬植物，根系發(fā)達，適應性強，是我國重 要的生態(tài)經(jīng)濟林樹種。栗屬植物分布遍及北半球的亞洲、歐洲、非洲和美洲大陸。現(xiàn)存的栗 屬植物有十多種，其中，進行經(jīng)濟栽培的種主要有中國板栗Castanea mollissima、歐洲栗 Castanea sativa、日本栗Castanea crenata、美洲栗Castanea dentate。板栗在中國栽培 歷史悠久。由于板栗屬于異花授粉植物、長期進行實生繁殖、種間可以雜交，以及板栗生長 地區(qū)復雜的地理生態(tài)條件等，在長期的系統(tǒng)發(fā)育和進化過程中，形成了豐富的種質資源。
[0003] 體細胞胚(somatic embryo)又叫胚狀體，是離體培養(yǎng)條件下沒有經(jīng)過受精過程而 形成的胚胎類似物。植物體細胞胚發(fā)生途徑有兩種:直接發(fā)生途徑和間接發(fā)生途徑，兩者區(qū) 別在于是否經(jīng)由胚性愈傷組織的發(fā)生。多數(shù)植物體細胞胚的發(fā)生都是間接發(fā)生途徑，如柑 橘須經(jīng)胚性愈傷組織誘導形成體細胞胚，但也有一些植物的體細胞胚是通過直接發(fā)生途徑 形成的，如在蘋果葉片培養(yǎng)中，離體葉片可以直接產(chǎn)生體細胞胚。還有少數(shù)植物，體細胞胚 發(fā)生途徑既可以通過直接途徑也可以通過間接途徑，如葡萄等。由于體細胞胚是單細胞起 源，具有兩極性、遺傳穩(wěn)定性高等特點，目前被廣泛應用于基因遺傳轉化體系的研究中。在 桃、山核桃等果樹中，利用體細胞胚發(fā)生進行植株再生及遺傳轉化體系的研究已進行了成 功報道。懸浮培養(yǎng)等手段有利于體細胞胚的發(fā)生，在百合和馬尾松體細胞胚的研究中已有 應用，并且利用懸浮培養(yǎng)誘導體細胞胚發(fā)生，可有效控制體細胞胚發(fā)生同步化，懸浮培養(yǎng)物 生長較快，培養(yǎng)周期短等優(yōu)點。
[0004] 在栗屬植物美洲栗和歐洲栗中，利用未成熟胚和葉片等作為外植體都已成功誘導 了體細胞胚的發(fā)生，此后，以體細胞胚再生體系成功進行了美洲栗和歐洲栗基因遺傳轉化， 獲得轉基因植株。對于我國板栗體細胞胚的發(fā)生，張玲等利用板栗胚珠作為外植體對體細 胞胚的發(fā)生作了初步研究，僅僅誘導出胚性愈傷，出現(xiàn)球形胚，但體細胞胚并未繼續(xù)發(fā)育至 成熟，且胚珠誘導體細胞胚的效率較低，因此，亟需一種高效完整的誘導板栗體細胞胚發(fā)生 的方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種板栗體細胞胚的誘導 方法。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案如下：
[0007] -種板栗體細胞胚的誘導方法，將板栗的幼胚胚尖作為外植體，進行體細胞胚的 誘導培養(yǎng)。本發(fā)明通過試驗發(fā)現(xiàn)，將幼胚胚尖作為外植體，具有極高的愈傷組織誘導率。
[0008] 進一步地，本發(fā)明優(yōu)化了外植體的采集時間，優(yōu)選所述幼胚胚尖取自開花后45~ 54天的板栗。
[0009] 進一步地，所述方法包括如下步驟：
[0010] (1)將外植體接種到誘導培養(yǎng)基中進行誘導增殖培養(yǎng)；
[0011] (2)將增殖培養(yǎng)得到的體細胞胚或體細胞胚發(fā)生前體轉移至發(fā)育培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 并觀察體細胞胚形態(tài)；
[0012] (3)當觀察到出現(xiàn)子葉形胚時，將發(fā)育培養(yǎng)基中的體細胞胚轉移至成熟培養(yǎng)基中， 促進體細胞胚發(fā)育至成熟。
[0013] 更進一步地，本發(fā)明提供兩種誘導方法，即不懸浮培養(yǎng)誘導與懸浮培養(yǎng)誘導，具體 如下：
[0014] 不懸浮培養(yǎng)誘導:所述步驟(1)將外植體接種到誘導培養(yǎng)基中，在23~25°C條件下 進行暗培養(yǎng)，直至有體細胞胚形成；
[0015] 所述誘導培養(yǎng)基的配方為：WPM((木本植物）培養(yǎng)基基鹽混合物）+ 109mg · L_ 1NitschfcNitsch維生素粉末（1000x) + l .Og · L-1 水解酪蛋白（Casein hydrolysate) + O.Smg.L-1 2,4-0+0.311^.1/1 6-芐基氨基嘌呤(6-BA)+3%蔗糖+0.7% 瓊脂。
[0016] 懸浮培養(yǎng)誘導:所述步驟(1)包括：
[0017] Sl、將外植體接種到誘導培養(yǎng)基中，在23~25°C條件下暗培養(yǎng)28~32天，得到體細 胞胚發(fā)生前體；
[0018] S2、將體細胞胚發(fā)生前體接種到液態(tài)的增殖培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)40~50天，得到增 殖的體細胞胚發(fā)生前體;懸浮培養(yǎng)條件為，23~25 °C下，搖床，暗培養(yǎng)；
[0019] 所述誘導培養(yǎng)基的配方為:WPM+Schenk&Hildebrandt維生素粉末（100x)+2.Omg · L-1 2,4-D+3% 蔗糖+0.7%瓊脂；
[0020] 所述增殖培養(yǎng)基的配方為:WPM+Schenk&Hildebrandt維生素粉末（100x)+2·Omg · L1 2,4_D+3% 鹿糖。
[0021 ]配方中的上述成分（除激素類、鹿糖、瓊脂）均可購自Phytotechnology laboratories公司。激素類、蔗糖、瓊脂可使用本領域常用試劑，屬于本領域技術人員的常 規(guī)選擇。
[0022]懸浮培養(yǎng)中使用的維生素不可以高溫滅菌，而不懸浮培養(yǎng)的維生素可以直接高溫 滅菌。
[0023]其中，"3%蔗糖"和"0.7%瓊脂"中的百分比是指質量比體積，相當于30g · I/1鹿糖 和7g · IZ1瓊脂。
[0024]進一步地，懸浮培養(yǎng)中的搖床條件為100~120rpm。
[0025] 需要說明的是，無論是懸浮培養(yǎng)還是不懸浮培養(yǎng)，二者的區(qū)別僅在于步驟（1)的不 同，后續(xù)步驟均一致。
[0026] 所述步驟(2)為:將增殖培養(yǎng)得到的體細胞胚或體細胞胚發(fā)生前體轉移至發(fā)育培 養(yǎng)基中，在23~25°C條件下進行暗培養(yǎng)；
[0027] 所述發(fā)育培養(yǎng)基的配方為:WPM+109mg〃L-1NitschfcNitsch維生素粉末（1000 x) + 1.0g"L-1 水解酪蛋白（Casein hydrolysate)+0· 5g"L-1L-谷氨酰胺(L_glutamine)+6%鹿糖 +0.7%瓊脂。
[0028] 所述步驟(3)中，當觀察到出現(xiàn)子葉形胚時，將發(fā)育培養(yǎng)基中的體細胞胚轉移至成 熟培養(yǎng)基中，在23~25°C條件下進行暗培養(yǎng)；
[0029] 所述成熟培養(yǎng)基的配方為：B5基本培養(yǎng)基（Gamborg's "B5" salts) + 109mg · L- Sitsch&Nitsch維生素粉末（1000x)+0.1mg · L-1 萘乙酸(NAA)+0.1mg · L-1 6-芐基氨基嘌呤 (6-BA)+6% 蔗糖+0.7% 瓊脂。
[0030] 進一步地，本發(fā)明提供所述幼胚胚尖的獲得方法，具體為:將采集的板栗去蓬后得 到板栗果實，對板栗果實進行消毒處理后，剝取幼胚胚尖。
[0031] 所述消毒處理具體為：利用75%乙醇處理Imin后，利用3%NaC10處理5min，無菌水 沖洗去除殘留。
[0032]本發(fā)明的有益效果在于：
[0033] 本發(fā)明以主栽品種'燕山紅栗'板栗作為試驗材料，以幼胚胚尖作為外植體，并優(yōu) 化了采集時間和誘導方法，對板栗體細胞胚發(fā)育過程進行研究，為今后進一步建立板栗轉 基因再生體系進行核心種質遺傳改良奠定了堅實的基礎。
【附圖說明】
[0034] 圖1為本發(fā)明實驗例1中'燕山紅栗'的外觀圖。
[0035] 圖2為本發(fā)明實驗例1中'燕山紅栗'去除刺蓬后的未成熟果實。
[0036] 圖3為本發(fā)明實驗例1中'燕山紅栗'兩種不同形態(tài)(胚珠、幼胚胚尖)外植體;A.胚 珠;B.幼胚胚尖(黑框所示），bar = 1mm。
[0037] 圖4為本發(fā)明實驗例1中誘導形成的兩種不同愈傷組織形態(tài);A.胚性愈傷組織;B. 非胚性愈傷組織。
[0038]圖5為本發(fā)明實驗例1中體視顯微鏡觀察到的（不經(jīng)懸浮培養(yǎng))體細胞胚的形態(tài)結 構，bar=lmm;箭頭所指為球形胚箭頭所指為不同階段的體細胞胚，分別是A.球形胚前體； B.球形胚;C.過渡期;D.心形胚;E.魚雷形胚;F.子葉形胚。
[0039] 圖6為本發(fā)明實驗例1中懸浮培養(yǎng)過程板栗體細胞胚的形態(tài)觀察，箭頭所指為球形 胚。
[0040] 圖7為本發(fā)明實驗例1中體視顯微鏡觀察到的(經(jīng)懸浮培養(yǎng))體細胞胚的形態(tài)結構， bar = Imm;箭頭所指為球形胚箭頭所指為不同階段的體細胞胚，分別是A.球形胚前體;B.球 形胚;C.心形胚;D.魚雷形胚;E.子葉形胚。
【具體實施方式】
[0041] 下面將結合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領域的技 術人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。
[0042] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0043] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0044] 實施例1
[0045] 本實施例以'燕山紅栗'為例，用于說明本發(fā)明所述的板栗體細胞胚的誘導方法。 [0046] 包括如下步驟：
[0047] 一、板栗的采集：
[0048] '燕山紅栗'第一次盛花期后的45天~54天進行采集，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0049] 二、板栗的消毒與外植體的獲取：
[0050] 將采集的板栗去蓬，在超凈工作臺上進行表面消毒及接種工作，75%乙醇處理 Imin，3%NaC10處理5min，無菌水沖洗3~4次。在對外植體消毒滅菌的過程中，輕輕搖晃三 角瓶，使得乙醇、NaClO與外植體充分接觸;無菌水沖洗時，也要輕輕搖晃三角瓶，保證無菌 水與外植體充分接觸，每次2min。用尖頭鑷子小心從板栗未成熟果實中剝取板栗幼嫩的幼 胚胚尖，用于之后的接種。
[0051]三、體細胞胚的誘導和增殖培養(yǎng)：
[0052] (1)體細胞胚發(fā)生前體(proembryogenic mass，PEMs)的誘導和增殖培養(yǎng)：
[0053] 誘導：將幼胚胚尖接種于誘導培養(yǎng)基（WPM+Schenk&Hildebrandt維生素粉末 (100x)+2.0mg · L-1 2,4-D+3%蔗糖+0.7%瓊脂）上。25°C暗培養(yǎng)30天。
[0054] 增殖：PEMs增殖培養(yǎng)采用懸浮培養(yǎng)，即接種5g PEMs于60mL增殖培養(yǎng)基（WPM+ SchenMHildebrandt維生素粉末（100x)+2.Omg · L-1 2,4-D+3%鹿糖）中。100rpm，25°C暗培 養(yǎng)45天，每兩周更換一次新鮮培養(yǎng)基。
[0055] (2)體細胞胚的誘導和增殖培養(yǎng)：
[0056] 將懸浮培養(yǎng)的PEMs轉移至發(fā)育培養(yǎng)基(WPM+109mg〃L-1NitschfcNitsch維生素粉末 (1000x) + l · 0g〃L-1水解酪蛋白+0 · 5g〃L-1L-谷氨酰胺+6%蔗糖+0 · 7%瓊脂），23~25°C暗培 養(yǎng)，每兩周利用體視顯微鏡(OLYMPUS SZX7)觀察體細胞胚形態(tài)。
[0057] 四、體細胞胚的成熟
[0058] 當觀察體細胞胚的形態(tài)中出現(xiàn)子葉形胚時，將發(fā)育培養(yǎng)基的體細胞胚轉移至成熟 培養(yǎng)基(B5基本培養(yǎng)基+109mg · L-Sitsch&Nitsch維生素粉末（1000x)+0.1mg · L-1萘乙酸+ O.lmg · L-1 6-BA+6%蔗糖+0.7%瓊脂），23~25。。暗培養(yǎng)。每周利用體視顯微鏡(OLYMPUS SZX7)觀察體細胞胚形態(tài)。在此培養(yǎng)基上，體細胞胚可發(fā)育子葉型胚。
[0059] 實施例2
[0060]本實施例與實施例1的區(qū)別在于:步驟三、體細胞胚的誘導和增殖培養(yǎng)過程不同， 具體如下：
[0061 ] (1)將幼胚胚尖接種于誘導培養(yǎng)基(WPM+109mg · L-1NitschfcNitsch維生素粉末 (1000x)+1.0g · L-1 水解酪蛋白+0.5mg · L-1 2,4-D+0.3mg · L-1 6-BA+3%蔗糖+0.7%瓊脂） 上，23~25°C暗培養(yǎng)。每月更換一次新鮮培養(yǎng)基，大約三個月（誘導與增殖)后，有體細胞胚 形成。誘導培養(yǎng)基可作為增殖培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上，胚性愈傷組織可以保持胚性增殖。每 兩周利用體視顯微鏡(OLYMPUS SZX7)觀察體細胞胚形態(tài)。
[0062] (2)將成功誘導的體細胞胚轉移至發(fā)育培養(yǎng)基（WPM+109mg · L-lNitsch&Nitsch Vitamin Powder+l.Og · L-ICasein hydrolysate+0.5g · L-lL-glutamine+6%鹿糖+0.7% 瓊脂），23~25°C暗培養(yǎng)。此培養(yǎng)基可誘導體細胞胚進一步發(fā)育。
[0063] 對比例1~2
[0064] 對比例1~2與實施例1~2的區(qū)別在于:步驟二中，用尖頭鑷子小心從板栗未成熟 果實中剝取板栗幼嫩的胚珠。
[0065] 實驗例1
[0066]本實驗例用于說明樣品采集時間、外植體的選擇以及誘導方法對板栗體細胞胚發(fā) 育的影響。
[0067] 具體實驗方案如下：
[0068] -、不同發(fā)育時期對板栗胚性愈傷組織的影響
[0069]在研究胚性愈傷組織誘導和增殖過程發(fā)現(xiàn)，不同采樣時期(第一次盛花期后42天、 45天、48天、51天、54天、57天、60天、63天、66天)誘導的胚性愈傷組織出現(xiàn)了不同程度的褐 變。褐變較為嚴重的胚性愈傷組織在后期進行增殖培養(yǎng)時，不能有效增殖，并且褐變程度會 逐漸變大。由表1可以看出，'燕山紅栗'在花后54天以后的樣品開始褐變，花后57天以后所 采樣品褐變等級達到三級以上。因此，'燕山紅栗'采用花后54天之前的樣品用于胚性愈傷 組織的誘導。因此，'燕山紅栗'最適宜胚性愈傷組織誘導的取樣時間為花后45天~54天之 間。
[0070]表1不同取樣時間'燕山紅栗'誘導胚性愈傷組織的褐變等級
Luu〃」 汪：田t個酡精佛計算葸仂紐織的褐父準，政米用褐父等級的萬沄米佰計兵褐變 程度。愈傷組織褐變等級劃分:〇級，無褐變發(fā)生;一級，輕微褐變發(fā)生，約占愈傷組織的1 % ; 二級，輕度褐變發(fā)生，約占愈傷組織的20% ;三級，可明顯觀察到褐變發(fā)生，約占愈傷組織的 50 % ;四級，褐變較嚴重，約占愈傷組織的70 % ;五級，完全褐變。
[0073] 二、外植體類型和誘導方法對板栗胚性愈傷組織誘導的影響
[0074] 分別接種'燕山紅栗'兩種不同形態(tài)(胚珠、幼胚胚尖)的幼胚外植體（圖3)，每個月 觀察統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導率。試驗中觀察到胚性愈傷組織（圖4，A)呈淡黃色，細胞顆粒較 小呈松散排列，細胞表面有光澤，而非胚性愈傷組織顏色略呈褐色，細胞排列緊密（圖4，B)。
[0075] 從愈傷組織誘導率來看(表2)，接種'燕山紅栗'胚珠（圖3，A)的愈傷組織誘導率分 別為54.99%和0.1 %，而接種幼胚胚尖(直徑2mm左右，圖3，B)的愈傷組織誘導率都在95% 以上，差異極顯著，因此，幼胚胚尖是誘導板栗愈傷組織較適宜的外植體。
[0076] 從愈傷組織誘導率和胚性愈傷組織誘導率(表2)也可看出，兩種誘導方法對于幼 胚胚尖都比較合適，愈傷組織誘導率均在95%以上，胚性愈傷組織誘導率均在79%以上;而 對于胚珠作為外植體，不經(jīng)懸浮培養(yǎng)尚可誘導小部分愈傷組織，而懸浮培養(yǎng)并不適合胚珠 作為外植體來誘導。但是，懸浮培養(yǎng)時，愈傷組織生長較快，培養(yǎng)周期相對較短，這是懸浮培 養(yǎng)的主要優(yōu)勢。
[0077]表2不同誘導方法、不同外植體的愈傷組織及胚性愈傷組織誘導率比較
[0079]注:表中數(shù)據(jù)為3次重復的平均值土標準誤差；同列中不同大寫字母表示0.01水平 差異極顯著。
[0080] 愈傷組織誘導率（％ )=長出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)X100%。
[0081 ] 胚性愈傷組織誘導率（％ )=長出胚性愈傷組織的外植體數(shù)/長出愈傷外植體數(shù)X 100%〇
[0082]三、板栗體細胞胚發(fā)生形態(tài)學觀察
[0083]接種'燕山紅栗'幼胚胚尖，觀察兩個板栗品種胚性愈傷組織發(fā)育前期的形態(tài)學變 化過程。結果發(fā)現(xiàn)離體暗培養(yǎng)5天后，開始有愈傷組織發(fā)生。接種10天、15天和20天后分別觀 察胚性愈傷組織形態(tài)，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織形態(tài)隨時間變化不大。胚性愈傷組織顏色均呈現(xiàn) 乳白色或淡黃色，色澤較鮮亮。將幼胚胚尖接種到體細胞胚誘導培養(yǎng)基上，3個月后觀察到 有體細胞胚的形成。經(jīng)發(fā)育培養(yǎng)基、成熟培養(yǎng)基，觀察到體細胞胚呈現(xiàn)不同的形態(tài)。利用體 視顯微鏡可觀察到球形胚前體、球形胚、過渡期、心形胚、魚雷形胚和子葉胚等胚性愈傷組 織的形態(tài)結構（圖5和圖7)。
[0084] 試驗過程中發(fā)現(xiàn)，體細胞胚發(fā)生前體在液體誘導培養(yǎng)基中，增殖相當快，且長勢均 勻，轉移至發(fā)育培養(yǎng)基后體細胞胚生長較為一致，球形胚等出現(xiàn)較整齊(圖6 )，且增殖較快。
[0085] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一種板栗體細胞胚的誘導方法，其特征在于，將板栗的幼胚胚尖作為外植體，進行體 細胞胚的誘導培養(yǎng)。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼胚胚尖取自開花后45~54天的板 栗。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 將外植體接種到誘導培養(yǎng)基中進行誘導增殖培養(yǎng)； (2) 將增殖培養(yǎng)得到的體細胞胚或體細胞胚發(fā)生前體轉移至發(fā)育培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并觀 察體細胞胚形態(tài)； (3) 當觀察到出現(xiàn)子葉形胚時，將發(fā)育培養(yǎng)基中的體細胞胚轉移至成熟培養(yǎng)基中，促進 體細胞胚發(fā)育至成熟。4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)將外植體接種到誘導培養(yǎng)基 中，在23~25°C條件下進行暗培養(yǎng)，直至有體細胞胚形成； 所述誘導培養(yǎng)基的配方為:WPM+109mg · L-Sitsch&Nitsch維生素粉末（1000x)+1.0g · L一1水解酪蛋白+O.Smg·!/1 2,4-0+0.311^1/1 6-芐基氨基嘌呤+3%蔗糖+0.7%瓊脂。5. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)包括： 51、 將外植體接種到誘導培養(yǎng)基中，在23~25°C條件下暗培養(yǎng)28~32天，得到體細胞胚 發(fā)生前體； 52、 將體細胞胚發(fā)生前體接種到液態(tài)的增殖培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)40~50天，得到增殖的 體細胞胚發(fā)生前體;懸浮培養(yǎng)條件為，23~25 °C下，搖床，暗培養(yǎng)； 所述誘導培養(yǎng)基的配方為：WPM+Schenk&Hildebrandt維生素粉末（100x)+2.0mg · L-1 2,4-D+3% 蔗糖+0.7%瓊脂； 所述增殖培養(yǎng)基的配方為:WPM+Schenk&Hildebrandt維生素粉末（100x)+2·Omg · L-1 2,4_D+3% 鹿糖。6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，搖床培養(yǎng)的條件為100~120rpm。7. 根據(jù)權利要求4~6任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)將增殖培養(yǎng)得到的 體細胞胚或體細胞胚發(fā)生前體轉移至發(fā)育培養(yǎng)基中，在23~25°C條件下進行暗培養(yǎng)； 所述發(fā)育培養(yǎng)基的配方為:WPM+109mg · L-Sitsch&Nitsch維生素粉末（1000x)+1.0g · L一1水解酪蛋白+0.5g · IZ1L-谷氨酰胺+6%蔗糖+0.7%瓊脂。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)中，當觀察到出現(xiàn)子葉形胚 時，將發(fā)育培養(yǎng)基中的體細胞胚轉移至成熟培養(yǎng)基中，在23~25°C條件下進行暗培養(yǎng)； 所述成熟培養(yǎng)基的配方為：B5基本培養(yǎng)基+109mg · L-1NitschfcNitsch維生素粉末 (1000X)+0.1mg · L-1萘乙酸+O.lmg · L-1 6-芐基氨基嘌呤+6%蔗糖+0.7%瓊脂。9. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述幼胚胚尖的獲得方法為:將采集的 板栗去蓬后得到板栗果實，對板栗果實進行消毒處理后，剝取幼胚胚尖。10. 根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于，所述消毒處理為:利用75%乙醇處理Imin 后，利用3 % NaClO處理5min，無菌水沖洗去除殘留。
【文檔編號】A01H4/00GK105941149SQ201610341816
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】秦嶺, 曹慶芹, 邢宇, 張卿, 逯丹, 陳雙雙, 姜奕晨
【申請人】北京農(nóng)學院