一種富鎂蟬花的人工培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種富鎂蟬花的人工培養(yǎng)方法，該方法包括如下步驟：步驟1，蟬花菌種在液體培養(yǎng)基中進行擴增；步驟2，將步驟1擴增后的菌種接種到固體培養(yǎng)基中進行固體培養(yǎng)；步驟3，對孢梗束進行采收；其特征在于，在步驟2所述固體培養(yǎng)基中加入鎂鹽，其加入量為7～15％。本發(fā)明人工培養(yǎng)方法采用在蟬花液體和固體培養(yǎng)基中添加定量的鎂鹽，通過微生物轉(zhuǎn)化后，制成富鎂蟬花，食用安全、方便，可滿足各類人群對鎂元素的要求。
【專利說明】
一種富鎂蟬花的人工培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種蟬花的人工培養(yǎng)方法，具體涉及一種富鎂蟬花的人工培養(yǎng)方法，屬于生物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]鎂是人體細胞內(nèi)的主要陽離子，濃集于腺粒體中，僅次于鉀和磷，在細胞外液僅次于鈉和鈣居第三位。鎂是多種酶的激活劑，在能量和物質(zhì)代謝中起重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)鎂與第二信使cAMP的生成，與激素及生長因子、心肌細胞和陽離子通道等多種生理功能有關(guān)。
[0003]鎂離子作為酶的輔助因子參與體內(nèi)所有能量代謝，激活和催化約350多種酶系統(tǒng)，包括葡萄糖的利用，脂肪、蛋白質(zhì)和核酸的合成，三磷酸腺苷代謝及膜離子運轉(zhuǎn)等，并與線粒體細胞及所有膜結(jié)構(gòu)和功能完整性有關(guān)。鎂離子通過激活膜上的酶，保持細胞內(nèi)的穩(wěn)定，鎂離子的改變也影響鈣的代謝所以鎂具有維持心肌、神經(jīng)、肌肉的正常功能的特殊作用。現(xiàn)有研究表明缺鎂可引起各種心律失常如心室性早搏、房性早搏、心動過速甚至房顛；使蛋白質(zhì)合成下降，降低機體抵抗力及免疫功能，人體腫瘤發(fā)生率增加；形成支氣管哮喘高敏綜合癥。常見的胃腸道疾病如胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃炎等多是由于胃酸分泌過多引起的，鎂鹽作為抗酸藥具有較強的緩沖能力，能快速持續(xù)中和胃酸而不會引起堿中毒及繼發(fā)性酸分泌增加的現(xiàn)象；鎂劑既能維護肝細胞膜的穩(wěn)定性，促進肝細胞功能恢復，又能促進膽汁代謝。鎂能促進糖原和能量貯存，改善胃腸功能，、術(shù)后早期應用鎂劑使患者的腸道功能恢復時間明顯提前，患者的營養(yǎng)狀況改善較快，術(shù)后恢復較快。鎂可治療腹瀉與便秘。
[0004]鎂也是組成骨的主要成分，鎂促進骨、牙齒及細胞形成，是正常骨的細胞間質(zhì)的形成所需要的。鎂在骨的礦質(zhì)代謝中有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，與ca凋激素也有關(guān)系。鎂不足可刺激甲狀旁腺素(PTH)分泌，促進骨吸收。有研究表明，輕微的鎂缺乏能損害礦物質(zhì)平衡，是骨質(zhì)疏松的危險因素。鎂缺乏和骨質(zhì)疏松經(jīng)常同時出現(xiàn)，治療骨質(zhì)疏松不僅需補鈣應同時補鎂。
[0005]鎂代謝與糖代謝相互影響，血糖濃度往往與血鎂濃度呈負相關(guān)，糖尿病人血清鎂比正常人低，尿鎂比正常人高，血鎂水平與胰島素敏感性呈負相關(guān)，補鎂可改善胰島素敏感性和胰島素分泌。糖尿病并發(fā)視網(wǎng)膜病變與血鎂呈負相關(guān)，低血鎂癥被認為是視網(wǎng)膜病變的危險因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種富鎂蟬花的培養(yǎng)方法。
[0007]本發(fā)明的目的是通過如下方案實現(xiàn)的:
[0008]—種富鎂蟬花的人工培養(yǎng)方法，該方法包括如下步驟:
[0009]步驟1，蟬花菌種在液體培養(yǎng)基中進行擴增；
[0010]步驟2，將步驟I擴增后的菌種接種到固體培養(yǎng)基中進行固體培養(yǎng)；
[0011]步驟3，對抱梗束進彳丁米收；
[0012]其特征在于，在步驟2所述固體培養(yǎng)基中加入鎂鹽，其加入量為7?15%。
[0013]進一步，固體培養(yǎng)基中鎂鹽的加入量為7?11% ;更進一步，為9?11%。
[0014]進一步，在步驟I液體培養(yǎng)基加入鎂鹽，其加入量為I?3%。
[0015]進一步，所述鎂鹽為檸檬酸鎂、醋酸鎂、硫酸鎂、氯化鎂。更進一步，所述鎂鹽為檸檬酸鎂。
[0016]進一步，步驟2接種量為15 %?30 %;更進一步，接種量為20 %?25 %;更進一步為 25%。
[0017]進一步，步驟2固體培養(yǎng)過程中，在菌絲體生長階段采用遮光培養(yǎng)；從孢梗束始發(fā)至采收階段采用光照培養(yǎng)。
[0018]本發(fā)明所述固體培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)固體培養(yǎng)基，如谷物培養(yǎng)基，農(nóng)作物秸桿培養(yǎng)基，農(nóng)作物皮殼培養(yǎng)基，經(jīng)濟林木樹枝培養(yǎng)基，植物莖桿培養(yǎng)基等；其中優(yōu)選谷物培養(yǎng)基；所述谷物可選自小麥、玉米、大米、小米、黃豆粉、蕎麥、大麥、燕麥、糙米、粳米中的任意一種或幾種。更進一步，所述固體培養(yǎng)基為小麥培養(yǎng)基或蕎麥培養(yǎng)基。
[0019]本發(fā)明步驟I所述液體培養(yǎng)過程以菌種擴增為目的，可采用常規(guī)的菌種擴培方法，包括斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)中的任意一種或幾種方法的組合；所用培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的液體培養(yǎng)基，如馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯-葡萄糖-水培養(yǎng)基(PSB)、酵母浸出粉-復合氨基酸-蔗糖培養(yǎng)基(SAAY)、酵母浸出粉-白砂糖-大豆水解蛋白培養(yǎng)基，麩皮煮汁-白砂糖培養(yǎng)基中的任意一種或幾種。
[0020]本發(fā)明中所述蝴花(Isaria cicadae Miquel)是廣布種，廣泛分布在我國秦嶺-淮河以南的18個省、市、區(qū)。在我國長江以南的亞熱帶和熱帶地區(qū)，且多在低洼地帶及滇藏高原的金沙江、怒江、瀾滄江和雅魯藏布江等河谷地帶。只要在其生長季節(jié)，每年的6-8月，按照一般中藥材的采集方法都可采到，是現(xiàn)有技術(shù)中已知菌種，并可以從商業(yè)途徑購買獲得。
[0021]本發(fā)明所用的蟬花菌株已經(jīng)在第CN201110178274.6號專利中公開(保藏號為CGMCC N0.3453)。
[0022]本發(fā)明人工培養(yǎng)方法采用在蟬花液體和固體培養(yǎng)基中添加定量的鎂鹽，通過微生物轉(zhuǎn)化后，制成富鎂蟬花，食用安全、方便，可滿足各類人群對鎂元素的要求。
【具體實施方式】
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[0023]以下實施例中，實施例1-9及對照實施例采用保藏號為CGMCC N0.3453的蟬擬青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq.) Samson];實施例10-13采用實施例14制備蝴花菌株。
[0024]以下實施例中，鎂元素含量測定參照“GB/T5009.90-200食品中鐵、鎂、錳的測定”方法進行；氨基酸含量測定參照“GB/T 5009.124-2003食品中氨基酸的測定”方法進行；HEA含量測定參照“《蛹蟲草子實體中N6- (2-羥乙基)-腺苷的分離純化及抗腫瘤作用》，食用菌學報2013.20(1):62?65”方法進行。
[0025]實施例1
[0026]斜面培養(yǎng):將蟬花菌種接種于斜面試管中，再將接種菌種的斜面試管放入22°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)時間為7天，待菌絲長滿試管；
[0027]液體培養(yǎng):在500ml三角瓶中裝入200ml液體培養(yǎng)基，在0.1 IMpa壓力下高壓滅菌30分鐘，待冷卻至室溫，將I支斜面試管的菌種接種到500ml三角瓶培養(yǎng)基上，并置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度22±1°C，150轉(zhuǎn)/分鐘條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3天；
[0028]固體培養(yǎng):按25%的接種量接種種子培養(yǎng)得到的菌種，接種后的容器放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為22-24°C，空氣相對濕度65% -70% ;首先要將培養(yǎng)室遮光，使發(fā)菌室基本黑暗。待菌絲體長滿料面時(室內(nèi)培養(yǎng)3?5天)，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。接種后定期檢查，及時剔除生長勢差、感染雜菌的培養(yǎng)容器。此后為誘導形成孢梗束時期，保持培養(yǎng)室溫度為20-22°C，相對空氣濕度65%?70%，保證有散射光(10Lx?200Lx)誘導孢梗束形成。培養(yǎng)室要適時通風換氣，保持發(fā)菌室空氣新鮮；
[0029]采收及處理:采收孢梗束；
[0030]液體培養(yǎng)基:SAAY培養(yǎng)基(酵母浸出粉0.5 %，復合氨基酸I %，白砂糖3.5 %，水95% )，加入3%的檸檬酸鎂；
[0031]固體培養(yǎng)基:小麥培養(yǎng)基，加入7%的梓檬酸鎂。
[0032]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為300.llmg/100g，達到了中國營養(yǎng)學會推薦居民每日攝入鎂的參考值(NRV);與安利鈣鎂片相比，鎂含量提高了 152% ;
[0033]另外，該富鎂蟬花中其他有效成分也明顯提高，如氨基酸總量為18.81g/100g，較NRV提高2.7% ;HEA(即N6_(2_羥乙基)腺苷，又名繭草菌素，是蟲草的特有成分，已作為蟲草制品的質(zhì)量控制指標之一)含量為0.078 %，較NRV提高56 %。
[0034]實施例2
[0035]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0036]液體培養(yǎng)基:SAAY培養(yǎng)基，加入3 %的醋酸鎂；
[0037]固體培養(yǎng)基:玉米培養(yǎng)基，加入7.5%的醋酸鎂；
[0038]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為157.01mg/100g。
[0039]實施例3
[0040]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0041 ] 液體培養(yǎng)基:SAAY培養(yǎng)基，加入3 %的氯化鎂；
[0042]固體培養(yǎng)基:大麥培養(yǎng)基，加入8%的氯化鎂；
[0043]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為163.21mg/100g。
[0044]實施例4
[0045]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0046]液體培養(yǎng)基:SAAY培養(yǎng)基，加入3 %的硫酸鎂；
[0047]固體培養(yǎng)基:黃豆培養(yǎng)基，加入9%的硫酸鎂；
[0048]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為125.26mg/100g。
[0049]實施例5
[0050]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0051 ]液體培養(yǎng)基:SAAY培養(yǎng)基，加入3 %的朽1檬酸鎂；
[0052]固體培養(yǎng)基:蕎麥培養(yǎng)基，加入10%的朽1檬酸鎂；
[0053]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為265.66mg/100go
[0054]實施例6
[0055]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0056]液體培養(yǎng)基:SAAY培養(yǎng)基，不加梓檬酸鎂；
[0057]固體培養(yǎng)基:小麥培養(yǎng)基，加入9%的梓檬酸鎂；
[0058]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為295.34mg/100g。
[0059]實施例7
[0060]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0061]液體培養(yǎng)基:SAAY培養(yǎng)基，不加梓檬酸鎂；
[0062]固體培養(yǎng)基:玉米培養(yǎng)基，加入9.5%的朽1檬酸鎂；
[0063]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為275.17mg/100g。
[0064]實施例8
[0065]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0066]液體培養(yǎng)基:SAAY培養(yǎng)基，加入I %的朽1檬酸鎂；
[0067]固體培養(yǎng)基:大麥培養(yǎng)基，加入10%的梓檬酸鎂；
[0068]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為225.62mg/100g。
[0069]實施例9
[0070]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0071]液體培養(yǎng)基:SAAY培養(yǎng)基，加入I %的朽1檬酸鎂；
[0072]固體培養(yǎng)基:黃顯培養(yǎng)基，加入10.5%的梓檬酸鎂；
[0073]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為225.34mg/100g。
[0074]實施例10
[0075]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0076]液體培養(yǎng)基:SAAY培養(yǎng)基，加入1.5%的梓檬酸鎂；
[0077]固體培養(yǎng)基:蕎麥培養(yǎng)基，加入11%的梓檬酸鎂；
[0078]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為295.63mg/100g。
[0079]實施例11
[0080]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0081 ]液體培養(yǎng)基:酵母浸出粉3%，白砂糖3%，大豆水解蛋白0.5%，加入1.5%的檸檬酸鎂；
[0082]固體培養(yǎng)基:蕎麥培養(yǎng)基，加入11%的梓檬酸鎂；
[0083]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為320.53mg/100g。
[0084]實施例12
[0085]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0086]液體培養(yǎng)基:麩皮煮汁4%，白砂糖3%，加入3%的硫酸鎂；
[0087]固體培養(yǎng)基:小麥培養(yǎng)基，加入9%的硫酸鎂；
[0088]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為315.63mg/100g。
[0089]實施例13
[0090]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0091 ] 液體培養(yǎng)基:PSB培養(yǎng)基(馬鈴薯20 %，葡萄糖2 % )，加入I %的檸檬酸鎂；
[0092]固體培養(yǎng)基:小麥培養(yǎng)基，加入10%的梓檬酸鎂；
[0093]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為300.16mg/100go
[0094]實施例14
[0095]在我國長江以南的亞熱帶和熱帶地區(qū)低洼地帶，7月，按照一般中藥材的方法采集。在超鏡工作臺上，在無菌條件下，將采來的新鮮蟲草用無菌水沖洗干凈，置于已滅菌的直徑為15cm的培養(yǎng)皿中，蟲草的內(nèi)菌核部分(蟲體)用打濕的脫脂棉包裹，以保濕。蟲草的子實體下方放置一滅菌的載玻片，蟲草菌核部分用小玻片墊起，以使可孕部分不要直接接觸載玻片，其距離約0.5cm左右。然后將培養(yǎng)皿放置于20°C ±0.5°C的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待蟬花孢子彈射于載玻片上時，在孢子周圍滴加剛?cè)芑腜DA培養(yǎng)基少許，移出玻片，置于另一滅菌的培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)，待長出菌絲后用接種針挑取少量菌絲轉(zhuǎn)另一平皿(SDAY培養(yǎng)基)培養(yǎng)(同上)，直至長出單一的純化的菌落為止。并經(jīng)形態(tài)學或分子生物學方法驗證，該菌株為蝴花蟲草(Isaria cicadae Miquel)無性型。
[0096]對照實施例
[0097]斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)方法及基本培養(yǎng)基同實施例1，但培養(yǎng)基有以下改動:
[0098]液體培養(yǎng)基:SAAY培養(yǎng)基；不加入梓檬酸鎂；
[0099]固體培養(yǎng)基:小麥培養(yǎng)基，不加入梓檬酸鎂。
[0100]其培養(yǎng)的蟬花孢梗束鎂元素含量為59.2mg/100g。
【主權(quán)項】
1.一種富鎂蟬花的人工培養(yǎng)方法，該方法包括如下步驟: 步驟1，蟬花菌種在液體培養(yǎng)基中進行擴增； 步驟2，將步驟I擴增后的菌種接種到固體培養(yǎng)基中進行固體培養(yǎng)； 步驟3，對孢梗束進行采收； 其特征在于，在步驟2所述固體培養(yǎng)基中加入鎂鹽，其加入量為7?15%。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，固體培養(yǎng)基中鎂鹽的加入量為7?11%。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟I所述液體培養(yǎng)基加入鎂鹽，其加入量為I?3%。4.如權(quán)利要求1?3任一所述的方法，其特征在于，所述鎂鹽為檸檬酸鎂、醋酸鎂、硫酸鎂、氯化鎂中的任意一種。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述鎂鹽為檸檬酸鎂。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2接種量為15%?30%。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2固體培養(yǎng)過程中，在菌絲體生長階段采用遮光培養(yǎng)；從孢梗束始發(fā)至采收階段采用光照培養(yǎng)。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基為谷物培養(yǎng)基；所述谷物為小麥、玉米、大米、小米、黃豆粉、蕎麥、大麥、燕麥、糙米、粳米中的任意一種或幾種。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基為小麥培養(yǎng)基或蕎麥培養(yǎng)基。10.如權(quán)利要求1?9任一所述方法培養(yǎng)的富鎂蟬花。
【文檔編號】A01G1/04GK105993584SQ201510562439
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年9月7日
【發(fā)明人】王玉芹, 紀偉, 胡建峰, 董瓊, 陳奇超, 彭國杰, 陸小芳, 許靜潔, 張忠亮, 路文遙, 孫長勝
【申請人】浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司