一種抗刺激隱核蟲卵形鯧鲹苗種的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗刺激隱核蟲卵形鯧鲹苗種的生產(chǎn)方法，屬于抗病性魚苗生產(chǎn)領域，具體為抗刺激隱核蟲魚苗生產(chǎn)領域。首次采用變溫感染和變溫養(yǎng)殖的方式來生產(chǎn)抗病性的卵形鯧鲹苗種，感染時的水溫與感染后10天內(nèi)的養(yǎng)殖水溫保持一定溫差，從而增強刺激隱核蟲活幼蟲的免疫效果，進而與輪換養(yǎng)殖結合，獲得了有效免疫保護期較長的抗刺激隱核蟲卵形鯧鲹苗種，免疫后第8個月還具有52％的相對保護率，第9個月仍有28％的相對保護率。
【專利說明】
一種抗刺激隱核蟲卵形鯧鰺苗種的生產(chǎn)方法
技術領域
[0001 ]本技術涉及一種抗刺激隱核蟲卵形鯧鰺苗種的生產(chǎn)方法，屬于抗病性魚苗生產(chǎn)領 域，具體為抗刺激隱核蟲魚苗生產(chǎn)領域。
【背景技術】
[0002] 卵形錯鰺(Trachinotus ovatus)，屬鰺科、錯鰺屬，是暖水性中上層魚類，具有洄 游和群居習性，其生長速度快、食性簡單、肉質鮮美，目前已成為中國華南沿海重要養(yǎng)殖品 種。
[0003] 刺激隱核蟲病俗稱海水魚白點病，是由一種海水魚類專性寄生纖毛蟲----刺激隱 核蟲（Cryptocaryon irritans)引起的致死性寄生蟲?。–olorni and Burgess，1997)。近 年來，刺激隱核蟲病已經(jīng)成為我國危害最嚴重的寄生蟲病之一，給海水漁業(yè)造成了巨大的 危害(Luo et al.，2008)，被列為國家《一、二、三類動物疫病病種名錄》中唯一的水生動物 二類疫病(農(nóng)業(yè)部，2008)。刺激隱核蟲的宿主范圍很廣泛，除軟骨魚類對刺激隱核蟲有較強 抵抗力外，海水硬骨魚類普遍能被刺激隱核蟲感染，其中卵形鯧鰺也是刺激隱核蟲感染的 對象之一。
[0004] 由于刺激隱核蟲生活史的復雜性，使得該病的防控非常困難。目前生產(chǎn)上主要采 用藥物防治如福爾馬林、硫酸銅、吖啶黃、孔雀綠、亞甲基蘭、喹林派、甲硝噠唑、高錳酸鉀、 氯化鈉、磺胺噻唑、咲喃唑酮和青霉素等（Colorni and Burgess，1997;蔡澤平等，2001; Noritaka et al.，2001;Noritaka et al.，2003;黃瑋等，2004)，然而這些方法由于存諸多 缺陷，如效果不穩(wěn)定、破壞養(yǎng)殖環(huán)境、危害食品安全、實施不便等，很難達到理想的效果。
[0005] C〇l〇rni(1987)提議用不同的物理方法防治刺激隱核蟲病，其中一種方法是將魚 在2個水族箱中進行輪換飼養(yǎng)，空置的水族箱進行干燥和清潔處理。這種方法很有效，但是 他沒有給出具體的操作方法，特別是沒有給出不同溫度下輪換的頻率和總共需要的時間這 兩個關鍵數(shù)據(jù)。張團委(2012)測定了卵形鯧鰺和斜帶石斑魚在不同溫度下感染刺激隱核蟲 的輪換頻率和輪換周期，但是沒有測定這種方法是否會誘發(fā)海水魚產(chǎn)生獲得性免疫保護。
[0006] 目前研究證實，海水魚類對刺激隱核蟲感染會產(chǎn)生獲得性免疫保護，疫苗接種可 能成為防治刺激隱核蟲病的有效方法(Yoshinaga et al，1997;Yambot et al，2006;Luo et al，2007;Hatanaka and Hirazawa，2008)。近年來研究者開展了一些刺激隱核蟲免疫防 治的基礎研究和應用研究，發(fā)現(xiàn)用刺激隱核蟲幼蟲經(jīng)體表感染海水魚如斜帶石斑魚、卵形 鯧鰺等，可以達到80%以上的免疫保護率(Luo et al，2007;但學明等，2008;Yoshinaga et al，1997)，但是這些實驗的有效免疫保護期最長只能達到3個月，且沒有詳細研究不同溫度 對海水魚獲得性免疫保護力的影響。
[0007] 在實際生產(chǎn)過程中，迫切需要一種有效免疫保護期較長的卵形鯧鰺苗種，為滿足 此需要，
【申請人】經(jīng)多次試驗和嘗試，摸索出了一種有效免疫保護期較長的、抗刺激隱核蟲卵 形鯧鰺苗種的生產(chǎn)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明旨在克服抗刺激隱核蟲的卵形鯧鰺苗種免疫保護期過短、不適應工業(yè)化養(yǎng) 殖生產(chǎn)等缺點，提供了一種實用性較強的抗刺激隱核蟲卵形鯧鰺苗種的生產(chǎn)方法。
[0009] 本發(fā)明將采用獨特的變溫感染和輪換養(yǎng)殖方法，培育出抗刺激隱核蟲感染的卵形 鯧鰺苗種，這種卵形鯧鰺苗對刺激隱核蟲的免疫保護力要達到8個月以上，免疫后第8個月 還具有52 %的相對保護率，第9個月仍有28 %的相對保護率。
[0010] 本發(fā)明的獨特之處在于，首次采用變溫感染和變溫養(yǎng)殖的方式來生產(chǎn)抗病性的石 斑魚苗種，感染時的水溫與感染后10天內(nèi)的養(yǎng)殖水溫保持一定溫差，從而增強刺激隱核蟲 活幼蟲的免疫效果，進而與輪換養(yǎng)殖結合，獲得了有效免疫保護期較長的抗刺激隱核蟲卵 形鯧鰺苗種。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)勢在于，解決了一直困擾養(yǎng)殖戶的海水魚類苗種免疫保護期短的技術 問題，采用獨創(chuàng)性的感染養(yǎng)殖方式，生產(chǎn)出了有效免疫保護期長達8個月的抗刺激隱核蟲卵 形鯧鰺苗種，適用于養(yǎng)殖廠及養(yǎng)殖戶的卵形鯧鰺健康養(yǎng)殖，可減免海水白點病所帶來的巨 大損失，大大提高漁民的養(yǎng)殖效益。
[0012] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0013] 1.刺激隱核蟲活幼蟲的收集和濃度計算
[0014]利用專門的刺激隱核蟲傳代系統(tǒng)對刺激隱核蟲進行傳代和收集，其傳代宿主為卵 形鯧鰺，采集發(fā)育良好的刺激隱核蟲包囊，置于消過毒的干凈燒杯中孵化，孵化用水為高壓 滅菌的、加入適量青霉素和鏈霉素的自然海水;收集孵出2小時內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲液，充 分混勻后取50yL蟲液，加10yL甲醛將幼蟲殺死，在顯微鏡下計數(shù)，記算出幼蟲液的活蟲濃 度。
[0015] 2.卵形鯧鰺苗種馴養(yǎng)、感染
[0016] 購置12g左右的卵形鯧鰺苗種，感染前2周對魚苗進行試養(yǎng)馴化，直至其進食、活動 正常，在整個養(yǎng)殖過程中，飼養(yǎng)用水用600目的濾網(wǎng)過濾，其鹽度在30%。左右，pH為8左右，溶 氧量在5.6mg/L以上;將卵形鯧鰺苗種分為對照組和實驗組(第1-9組)共十個小組，實驗組 每組魚苗用孵出2小時內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲感染，感染時水溫第1-3組為24°C、第4-6組為27 °C、第7-9組為30°C，感染用水量為1L海水/尾魚，感染劑量為3000個幼蟲/尾魚;感染6小時 后分別把魚苗放入不同的輪養(yǎng)池中，其中第1、4、7組水溫控制在24°C，第2、5、8組水溫控制 在27°C，第3、6、9組水溫控制在30°C ;對照組不進行刺激隱核蟲感染，養(yǎng)殖水溫為27°C。輪養(yǎng) 池長40米，寬1.5米，高1米，池中間用密封隔板將養(yǎng)殖池一分為二，保證兩側水不互通，感染 后的魚苗全部放置在池的一側，加入終濃度為2ppm的聚維酮碘溶液(有效碘含量為10 % )預 防繼發(fā)感染。具體分組情況見下表：
[0017]

[0018] 3、感染后卵形鯧鰺苗種的輪換養(yǎng)殖
[0019] 為了保證卵形鯧鰺苗種不被脫落的刺激隱核蟲包囊孵出的幼蟲再次感染，每2天 要將苗種置換到干凈的池中養(yǎng)殖，對照組魚種按同樣方法換池。具體方法為:將輪養(yǎng)池中間 的密封隔板拔出，采用誘食和驅趕方法將全部魚苗集中到池的另一側，插上密封隔板，加入 終濃度為2ppm的聚維酮碘溶液(有效碘含量為10%)預防繼發(fā)感染。排凈原來養(yǎng)魚一側的海 水，加入30cm深的淡水，浸泡8小時，即可殺滅所有粘附于池底的刺激隱核蟲包囊，刷洗后排 凈淡水，加注干凈海水待下一次使用。按上述方法輪換養(yǎng)殖5次，魚體上的刺激隱核蟲全部 脫落，整個輪換養(yǎng)殖過程均保持以上的控溫方式。此后將免疫過的魚苗全部放入干凈的養(yǎng) 殖池中養(yǎng)殖，不必控溫，保持自然水溫。
[0020] 4、致死劑量的測定和有效免疫保護期的測定
[0021] 卵形鯧鰺致死劑量的測定在攻毒前兩周進行。從空白對照組隨機取50尾魚，分為 10組，每組5尾，在塑料桶內(nèi)分開喂養(yǎng)。在幼蟲脫包高峰期，收集和計數(shù)2小時內(nèi)脫包的活躍 幼蟲，分別用設定好的劑量梯度感染10組魚，感染用水量為1L海水/尾魚。統(tǒng)計一周內(nèi)各組 魚的死亡數(shù)，能使5尾卵形鯧鰺全部死亡的最低感染劑量就是該魚的刺激隱核蟲致死劑量。 [0022]攻毒:每30天從對照組和每組免疫過的魚苗中各取50尾魚，用致死劑量的刺激隱 核蟲幼蟲攻毒。攻毒時空白對照組和實驗組混養(yǎng)在一起，海水用量仍為每尾魚1L，同時用致 死劑量的幼蟲進行感染攻毒，統(tǒng)計各個實驗組7天內(nèi)實驗魚的死亡情況，計算免疫9個月內(nèi) 的相對保護率，刺激隱核蟲攻毒后實驗魚的相對保護率(RPS)，RPS =(對照組死亡率-免疫 組死亡率)/對照組死亡率X 100%。
[0023]
[0024] 結果發(fā)現(xiàn)：與沒有免疫過的對照組相比，免疫過的卵形鯧鰺苗種死亡率有顯著降 低，其中第8組(30 °C感染，27°C養(yǎng)殖)有效免疫保護期最長，免疫后第8個月還具有52%的相 對保護率，第9個月仍有28 %的相對保護率。因此，30 °C感染，27 °C養(yǎng)殖的方法能讓卵形鯧鰺 獲得最長的有效免疫保護期，可以采取該方法來生產(chǎn)抗刺激隱核蟲的卵形鯧鰺苗種。
[0025] 本發(fā)明的優(yōu)點和效果：1、感染和輪換養(yǎng)殖操作簡單易行，且不損傷魚體，感染時無 需撈取魚苗，輪換養(yǎng)殖時也只需要將池中間的密封隔板拔出，采用誘食和驅趕方法就可把 全部魚苗集中到池的另一側，此方法對魚體無任何損傷，且簡單易行。2.采用獨特的變溫感 染和輪換養(yǎng)殖方法能讓卵形鯧鰺獲得最長的有效免疫保護期，采用30°C感染，27°C養(yǎng)殖的 方法能讓卵形鯧鰺在免疫后第8個月還具有52%的相對保護率，第9個月仍有28%的相對保 護率。此方法產(chǎn)生的有效免疫保護期比以前任何報道的方法都要長。
【具體實施方式】
[0026] 1.刺激隱核蟲活幼蟲的收集和濃度計算
[0027] 利用專門的刺激隱核蟲傳代系統(tǒng)對刺激隱核蟲進行傳代和收集，其傳代宿主為卵 形鯧鰺，采集發(fā)育良好的刺激隱核蟲包囊，置于消過毒的干凈燒杯中孵化，孵化用水為高壓 滅菌的、加入適量青霉素和鏈霉素的自然海水;收集孵出2小時內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲液，充 分混勻后取50yL蟲液，加10yL甲醛將幼蟲殺死，在顯微鏡下計數(shù)，記算出幼蟲液的活蟲濃 度。
[0028] 2.卵形鯧鰺苗種馴養(yǎng)、感染
[0029]購置12g左右的卵形鯧鰺苗種，感染前2周對魚苗進行試養(yǎng)馴化，直至其進食、活動 正常，在整個養(yǎng)殖過程中，飼養(yǎng)用水用600目的濾網(wǎng)過濾，其鹽度在30%。左右，pH為8左右，溶 氧量在5.6mg/L以上;將卵形鯧鰺苗種分為對照組和實驗組(第1-9組)共十個小組，實驗組 每組魚苗用孵出2小時內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲感染，感染時水溫第1-3組為24°C、第4-6組為27 °C、第7-9組為30°C，感染用水量為1L海水/尾魚，感染劑量為3000幼蟲/尾魚;感染6小時后 分別把魚苗放入不同的輪養(yǎng)池中，其中第1、4、7組水溫控制在24°C，第2、5、8組水溫控制在 27°C，第3、6、9組水溫控制在30°C ;對照組不進行刺激隱核蟲感染，養(yǎng)殖水溫為27°C。輪養(yǎng)池 長40米，寬1.5米，高1米，池中間用密封隔板將養(yǎng)殖池一分為二，保證兩側水不互通，感染后 的魚苗全部放置在池的一側，加入終濃度為2ppm的聚維酮碘溶液(有效碘含量為10% )預防 繼發(fā)感染。具體分組情況見下表：
[0030]
[0031] 3、感染后卵形鯧鰺苗種的輪換養(yǎng)殖
[0032]為了保證卵形鯧鰺苗種不被脫落的刺激隱核蟲包囊孵出的幼蟲再次感染，每2天 要將苗種置換到干凈的池中養(yǎng)殖，對照組魚種按同樣方法換池。具體方法為:將輪養(yǎng)池中間 的密封隔板拔出，采用誘食和驅趕方法將全部魚苗集中到池的另一側，插上密封隔板，加入 終濃度為2ppm的聚維酮碘溶液(有效碘含量為10% )預防繼發(fā)感染。排凈原來養(yǎng)魚一側的 海水，加入30cm深的淡水，浸泡8小時，即可殺滅所有粘附于池底的刺激隱核蟲包囊，刷洗后 排凈淡水，加注干凈海水待下一次使用。按上述方法輪換養(yǎng)殖5次，魚體上的刺激隱核蟲全 部脫落，整個輪換養(yǎng)殖過程均保持以上的控溫方式。此后將免疫過的魚苗全部放入干凈的 養(yǎng)殖池中養(yǎng)殖，不必控溫，保持自然水溫。
[0033] 4、致死劑量的測定和有效免疫保護期的測定
[0034]卵形鯧鰺致死劑量的測定在攻毒前兩周進行。從空白對照組隨機取50尾魚，分為 10組，每組5尾，在塑料桶內(nèi)分開喂養(yǎng)。在幼蟲脫包高峰期，收集和計數(shù)2小時內(nèi)脫包的活躍 幼蟲，分別用設定好的劑量梯度感染10組魚，感染用水量為1L海水/尾魚。統(tǒng)計一周內(nèi)各組 魚的死亡數(shù)，能使5尾卵形鯧鰺全部死亡的最低感染劑量就是該魚的刺激隱核蟲致死劑量。 [0035]攻毒:每30天從對照組和每組免疫過的魚苗中各取50尾魚，用致死劑量的刺激隱 核蟲幼蟲攻毒。攻毒時空白對照組和實驗組混養(yǎng)在一起，海水用量仍為每尾魚1L，同時用致 死劑量的幼蟲進行感染攻毒，統(tǒng)計各個實驗組7天內(nèi)實驗魚的死亡情況，計算免疫9個月內(nèi) 的相對保護率，刺激隱核蟲攻毒后實驗魚的相對保護率(RPS)，RPS =(對照組死亡率-免疫 組死亡率)/對照組死亡率X 100%。
[0036]
[0037] 結果發(fā)現(xiàn)：與沒有免疫過的對照組相比，免疫過的卵形鯧鰺苗種死亡率有顯著降 低，其中第8組(30 °C感染，27°C養(yǎng)殖)有效免疫保護期最長，免疫后第8個月還具有52%的相 對保護率，第9個月仍有28 %的相對保護率。因此，30 °C感染，27 °C養(yǎng)殖的方法能讓卵形鯧鰺 獲得最長的有效免疫保護期，可以采取該方法來生產(chǎn)抗刺激隱核蟲的卵形鯧鰺苗種。
【主權項】
1. 一種抗刺激隱核蟲卵形鯧鰺苗種的生產(chǎn)方法，包括以下四個步驟： (1) 刺激隱核蟲活幼蟲的收集和濃度計算 利用專門的刺激隱核蟲傳代系統(tǒng)對刺激隱核蟲進行傳代和收集，其傳代宿主為卵形鯧 鰺，采集發(fā)育良好的刺激隱核蟲包囊，置于消過毒的干凈燒杯中孵化，孵化用水為高壓滅菌 的、加入適量青霉素和鏈霉素的自然海水;收集孵出2小時內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲液，充分混 勻后取50yL蟲液，加10yL甲醛將幼蟲殺死，在顯微鏡下計數(shù)，記算出幼蟲液的活蟲濃度。 (2) 卵形鯧鰺苗種馴養(yǎng)、感染 購置12g左右的卵形鯧鰺苗種，感染前2周對魚苗進行試養(yǎng)馴化，直至其進食、活動正 常，在整個養(yǎng)殖過程中，飼養(yǎng)用水用600目的濾網(wǎng)過濾，其鹽度在30%。左右，pH為8左右，溶氧 量在5.6mg/L以上;將卵形鯧鰺苗種分為對照組和實驗組(第1-9組)共十個小組，實驗組每 組魚苗用孵出2小時內(nèi)的刺激隱核蟲幼蟲感染，感染時水溫第1-3組為24°C、第4-6組為27 °C、第7-9組為30°C，感染用水量為1L海水/尾魚，感染劑量為3000個幼蟲/尾魚;感染6小時 后分別把魚苗放入不同的輪養(yǎng)池中，其中第1、4、7組水溫控制在24°C，第2、5、8組水溫控制 在27°C，第3、6、9組水溫控制在30°C ;對照組不進行刺激隱核蟲感染，養(yǎng)殖水溫為27°C。輪養(yǎng) 池長40米，寬1.5米，高1米，池中間用密封隔板將養(yǎng)殖池一分為二，保證兩側水不互通，感染 后的魚苗全部放置在池的一側，加入終濃度為2ppm的聚維酮碘溶液(有效碘含量為10 % )預 防繼發(fā)感染。 (3) 感染后卵形鯧鰺苗種的輪換養(yǎng)殖 為了保證卵形鯧鰺苗種不被脫落的刺激隱核蟲包囊孵出的幼蟲再次感染，每2天要將 苗種置換到干凈的池中養(yǎng)殖，對照組魚種按同樣方法換池;具體方法為:將輪養(yǎng)池中間的密 封隔板拔出，采用誘食和驅趕方法將全部魚苗集中到池的另一側，插上密封隔板，加入終 濃度為2ppm的聚維酮碘溶液(有效碘含量為10%)預防繼發(fā)感染;排凈原來養(yǎng)魚一側的海 水，加入30cm深的淡水，浸泡8小時，即可殺滅所有粘附于池底的刺激隱核蟲包囊，刷洗后排 凈淡水，加注干凈海水待下一次使用；按上述方法輪換養(yǎng)殖5次，魚體上的刺激隱核蟲全部 脫落，整個輪換養(yǎng)殖過程均保持以上的控溫方式;此后將免疫過的魚苗全部放入干凈的養(yǎng) 殖池中養(yǎng)殖，不必控溫，保持自然水溫。 (4) 致死劑量的測定和有效免疫保護期的測定 卵形鯧鰺致死劑量的測定在攻毒前兩周進行，從空白對照組隨機取50尾魚，分為10組， 每組5尾，在塑料桶內(nèi)分開喂養(yǎng)。在幼蟲脫包高峰期，收集和計數(shù)2小時內(nèi)脫包的活躍幼蟲， 分別用設定好的劑量梯度感染10組魚，感染用水量為1L海水/尾魚。統(tǒng)計一周內(nèi)各組魚的死 亡數(shù)，能使5尾卵形鯧鰺全部死亡的最低感染劑量就是該魚的刺激隱核蟲致死劑量； 攻毒:每30天從對照組和每組免疫過的魚苗中各取50尾魚，用致死劑量的刺激隱核蟲 幼蟲攻毒。攻毒時空白對照組和實驗組混養(yǎng)在一起，海水用量仍為每尾魚1L，同時用致死劑 量的幼蟲進行感染攻毒，統(tǒng)計各個實驗組7天內(nèi)實驗魚的死亡情況，計算免疫9個月內(nèi)的相 對保護率，刺激隱核蟲攻毒后實驗魚的相對保護率(RPS)，RPS=(對照組死亡率-免疫組死 亡率)/對照組死亡率X 100% ; 最后，根據(jù)有效免疫保護期的測定結果，選擇能讓卵形鯧鰺獲得最長有效免疫保護期 的變溫感染、養(yǎng)殖方法，來生產(chǎn)抗刺激隱核蟲的卵形鯧鰺苗種;采用該方法可生產(chǎn)出免疫保 護力高達8個月以上的抗刺激隱核蟲的卵形鯧鰺苗種。
【文檔編號】A01K61/00GK105994021SQ201610236553
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年4月8日
【發(fā)明人】但學明, 李安興, 李言偉, 莫澤權
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學, 中山大學