一種液基薄層細胞保存液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種液基薄層細胞保存液及其制備方法，所述液基薄層細胞保存液由以下組分組成：KCl1％?3％；KH2PO41％?3％；Na2HPO40.1％?1％；EDTA?2Na0.01％?0.1％；乙二醇5％?10％；dd H2O70％?77.79％；異丙醇15％?20％；甲醛0.1％?1％。本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果：采用KCl、KH2PO4和Na2HPO4混合體系，調(diào)節(jié)液基薄層細胞保存液內(nèi)Na+、K+濃度以保持細胞固定時細胞內(nèi)外合理的滲透壓，同時形成中性的緩沖體系，能固定正常和病變后的宮頸脫落細胞形態(tài)和大小，提高細胞保存的完整性和可靠性，其次，通過乙二醇和異丙醇組成的滲透性防凍劑，在細胞低溫保存時防止液基細胞保存液內(nèi)的水分結(jié)冰，最后，通過采用較低濃度的甲醛，在固定細胞的同時與EDTA?2Na聯(lián)合提高液基薄層細胞保存液的殺菌性能，提高安全性。
【專利說明】
一種液基薄層細胞保存液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及宮頸細胞病理檢測領(lǐng)域，特別涉及一種液基薄層細胞保存液及其制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 液基細胞保存液是液基細胞學檢測技術(shù)主要耗材。液基薄層細胞制片檢查系統(tǒng)處 理技術(shù)誕生于1991年，率先應(yīng)用于婦科細胞學檢查，國內(nèi)從2001年開始作液基細胞學篩查 宮頸癌的研究，使該項技術(shù)得到迅速發(fā)展。液基細胞保存液在婦科細胞學檢查中，一般采用 將樣品細胞固定在溶液中，即終止任何正在進行的生化反應(yīng)，增加樣品的機械強度和穩(wěn)定 性，盡可能以接近生物材料的天然狀態(tài)來保存樣品，用于檢驗或者分析。
[0003] 公開號為CN105409925A的中國專利《一種液基細胞保存液》公開了一種液基細胞 保存液，涉及一種病理檢驗，尤其是對人體的子宮頸粘液、痰液、尿液、漿膜腔積液、氣管粘 液等細胞病理檢驗時使用的液基細胞保存液。該液基細胞保存液是由醇類、磷酸鈉緩沖液、 乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉0.08 % -0.12 %、氯化鉀、甲醛、二硫蘇糖醇、醋酸鈣、醋酸鎂等配 制而成。
[0004] 但是該液基細胞保存液存在以下缺點：磷酸鈉緩沖液與醋酸鈣、醋酸鎂發(fā)生化學 反應(yīng)后生成磷酸鎂磷酸鈣沉淀和醋酸鈉、醋酸，磷酸鈉緩沖液形成的中性緩沖系統(tǒng)被破壞， 化學反應(yīng)后形成的醋酸和醋酸鈉組成新的酸性的緩沖系統(tǒng)，醋酸具有腐蝕性，使細胞病理 檢測中的子宮頸粘液等樣品中的紅細胞在酸性和腐蝕性的環(huán)境下破裂，破裂的紅細胞釋放 內(nèi)容物如血紅蛋白等，會對后續(xù)的分析和檢測產(chǎn)生不良影響，例如血紅蛋白沉積后會妨礙 梅格吉染色、免疫細胞化學檢測等等

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種液基薄層細胞保存液，具有穩(wěn)定溶液緩沖體系，細胞形 態(tài)完整性好的效果。
[0006] 本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：一種液基薄層細胞保存 液，以質(zhì)量百分比計，所述液基薄層細胞保存液由以下成分組成 KC1 1%-3%.; ΚΗ,ΡΟ, 1%-3%; Na,HP〇4 0. ΕΓ/ΓΑ-2Na 0.01%-0.1%;. 乙二醇 5%-10%; dd Η,Ο 70%-77. 79%;; 異丙醇 15%-20%; 甲醛 0. 1%-1%。
[0008]細胞，是能進行獨立繁殖的有膜包圍的生物體的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，其一般由 質(zhì)膜、細胞質(zhì)和核（或擬核）構(gòu)成。細胞內(nèi)的主要陽離子是Κ+和Na+，當將細胞置于外環(huán)境中 時，細胞內(nèi)、外的K+和Na+的存在一定的濃度差，這將導致細胞內(nèi)、外的壓力不平衡，使得細胞 內(nèi)的水分外流或細胞外的溶液進入細胞內(nèi)，這兩種情況均會造成細胞膜破裂且細胞無法保 持其原始狀態(tài)，影響檢測結(jié)果。本申請采用KC1、KH 2P〇4和Na2HP〇4混合體系來調(diào)節(jié)，本申請的 一種液基細胞保存液中的K+和Na+濃度，平衡細胞內(nèi)外的K+和Na+濃度，從而平衡細胞內(nèi)外的 壓力。首先，通過KC1和KH 2P〇4對本申請的一種液基細胞保存液中的可溶性K+進行補充，以增 加細胞外的K+濃度來與細胞內(nèi)主要陽離子K+平衡;其次，KH 2P〇4和Na2HP〇4組成的緩沖系統(tǒng)， 可用于調(diào)節(jié)本申請的一種液基細胞保存液的PH，有利于穩(wěn)定平衡細胞內(nèi)、外的壓力，其中本 申請的緩沖系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機理為：當本申請的一種液基細胞保存液固定細胞時，pH值過高時， 多余的堿就會與磷酸二氫根離子形成磷酸氫根離子，降低溶液的pH值；當pH值過低時，磷酸 氫根離子就會與酸中的氫離子形成磷酸二氫根離子，提高溶液的pH值，有助于保持溶液恒 定的pH值，使細胞不會在細胞固定中因 pH變化而破裂;綜上，通過KC1、KH2P〇4和Na2HP〇4的組 合作用，將細胞置于本申請中的一種液基細胞保存液后，細胞處于合理的滲透性狀態(tài)，既不 會大量吸水而破裂，也不會失去水分而收縮，能避免滲透壓造成細胞膜、細胞質(zhì)膜和細胞核 膜的破裂，從而避免細胞破裂，保持細胞的正常形態(tài)，進一步提高細胞檢測結(jié)果的可靠性。
[0009] 檢測用細胞保持完整是細胞檢測結(jié)果可靠性的前提，本申請通過乙二醇、異丙醇 和甲醛的聯(lián)合作用來實現(xiàn)對細胞的固定，其作用過程為：當樣品細胞剛放入液基細胞保存 液，在細胞未失活前，乙二醇、異丙醇和甲醛與樣品細胞接觸，首先，甲醛與細胞膜上蛋白質(zhì) 的氨基發(fā)生反應(yīng)，對細胞大小形態(tài)進行固定，使得后期作用時細胞大小不會發(fā)生收縮(如醇 作用于細胞后細胞存在收縮）的情況，保持細胞完整性;其次，乙二醇和異丙醇擴散到細胞 質(zhì)液內(nèi)，對細胞進行固定，使細胞失活固定時保持在正常的狀態(tài);綜上，通過乙二醇、異丙醇 和甲醛的組合作用，細胞得到固定且固定后的細胞完整；另外，甲醛可以與抗凝聚機EDTA-2Na相聯(lián)合，在固定細胞的同時防止細胞發(fā)生凝聚，進一步提高細胞檢測的操作可行性和結(jié) 果可靠性。
[0010] 本申請的一種液基細胞保存液還具有較好的抑菌效果：本申請采用O.lwt%-lwt%的甲醛，甲醛兼具有良好的抗菌性能，可以減少外加抗菌劑的使用;革蘭氏陰性菌的 肽聚糖層位于細胞內(nèi)壁層，其外覆蓋大量的脂多糖，EDTA-2Na與甲醛聯(lián)合作用后，EDTA-2Na 與細胞表面的脂多糖之間鹽橋二價陽離子鰲合，使細菌的細胞膜失去穩(wěn)定性，達到增強液 基細胞保存液殺菌性能的作用，可以提尚安全性。
[0011] 本發(fā)明的進一步設(shè)置為：所述液基薄層細胞保存液中Κ Η 2 P 0 4的質(zhì)量百分比為 lwt%_l .5wt%，Na2HP〇4的質(zhì)量百分比為0.8wt%_lwt%。
[0012]宮頸粘液中正常的pH為7.0-8.2，偏弱堿性，但是病變后的宮頸粘液pH降低，變成 酸性。在用本申請的一種液基薄層細胞保存液對宮頸粘液內(nèi)的細胞進行保存時，KH2P〇4溶于 水后電離出K+和H2PO4-，Na 2HP04溶于水后電離出NA+和HP〇42-，KH2P〇4的質(zhì)量百分比高于 Na2HP〇4的質(zhì)量百分比，使本申請的液基薄層保存液pH在6-7之間，偏弱酸性，病變后酸性的 宮頸粘液內(nèi)脫落細胞進入弱酸性的液基薄層保存液中時，脫落細胞所處的環(huán)境pH不會變化 較大，不會從酸性環(huán)境直接過渡到堿性環(huán)境，避免細胞在固定時pH發(fā)生較大變化而破裂，進 一步提尚細胞固定的完整性和可靠性。
[0013]本發(fā)明的進一步設(shè)置為：所述液基薄層細胞保存液內(nèi)甲醛的質(zhì)量百分比為 0. lwt%-〇.8wt% 〇
[0014] 甲醛是易揮發(fā)的刺激性氣體，具有毒性、致突變性、生殖毒性和致癌性，人對甲醛 的嗅覺閾通常是0.06-0.07mg/m3,長期、低濃度接觸甲醛會引起頭痛、頭暈、乏力、感覺障 礙、免疫力降低，并可出現(xiàn)瞌睡、記憶力減退或神經(jīng)衰弱、精神抑郁，本申請的一種液基薄層 細胞保存液采用較低濃度的甲醛含量，質(zhì)量百分比為〇. lwt %-0.8wt %，使本申請的液基薄 層細胞保存液內(nèi)的甲醛僅具有刺激性，不會對人員健康產(chǎn)生影響，進一步提高安全性。
[0015] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種液基薄層細胞保存液的制備方法，包括如下步 驟：
[0016] a)將配方量的Na2HP〇4、KH2P〇4、KCl、EDTA-2Na溶解于dd H20中形成溶液a;
[0017] b)將步驟a)獲得的溶液a攪拌均勻，得到溶液b;
[0018] c)向步驟b)獲得的溶液b中加入配方量的乙二醇、異丙醇，攪拌均勻，得到溶液c;
[0019] d)向步驟c)獲得的溶液中加入配方量的甲醛，攪拌均勾；
[0020] 以上各步驟都是在常溫，濕度<90%RH下進行。
[0021] 綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果:采用KC1、KH2P〇4和Na2HP〇4混合體系，調(diào)節(jié)液 基薄層細胞保存液內(nèi)Na+、K+濃度以保持細胞固定時細胞內(nèi)外合理的滲透壓，同時形成中性 的緩沖體系，既能固定處于弱堿性環(huán)境下的正常宮頸脫落細胞形態(tài)和大小，又能固定病變 后處于酸性環(huán)境下的宮頸脫落細胞形態(tài)和大小，其次，通過乙二醇和異丙醇組成的滲透性 防凍劑，在細胞低溫保存時防止液基細胞保存液內(nèi)的水分結(jié)冰，最后，通過采用較低濃度的 甲醛，在固定細胞的同時與EDTA-2Na聯(lián)合提高液基薄層細胞保存液的殺菌性能，提高安全 性。
【具體實施方式】
[0022]具體實施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員 在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻的修改，但只要在本發(fā) 明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護。
[0023]實施例1: 一種液基薄層細胞保存液，其由如下方法制備得到：
[0024] 在常溫（25°C )，濕度彡90%RH下，按質(zhì)量份稱取1份KH2P〇4、1份Na2HP〇4、1份KC1、1 份EDTA-2Na放入電攪拌桶內(nèi)，再用量筒量取75.9份dd H20加入電攪拌桶內(nèi)，開啟電源以 1500rpm攪拌2小時;再用量筒配合移液器量取5份乙二醇、15份異丙醇加入電攪拌桶內(nèi)，攪 拌30分鐘;再用量筒配合移液器量取0.1份甲醛加入溶液內(nèi)，蓋上筒蓋、攪拌30分鐘。
[0025] 實施例2: -種液基薄層細胞保存液，與實施例1的不同之處在于，按質(zhì)量份，組分 含量為KC13份;KH2P〇43份;Na 2HP〇4〇. 1份;EDTA-2Na0.0 1份；乙二醇 10份；dd H20 62.89份；異 丙醇20份；甲醛1份。
[0026] 實施例3: -種液基薄層細胞保存液，與實施例1的不同之處在于，按質(zhì)量份，組分 含量為KC12份;KH2POU . 2份;Na2HP〇4〇. 9份;EDTA-2NaO. 1份；乙二醇5份;dd H2075.3份;異丙 醇15份；甲醛0.5份。
[0027]實施例4: 一種液基薄層細胞保存液，與實施例3的不同之處在于，按質(zhì)量份，EDTA-2他的份數(shù)為1份，(1(1!120 74.4份。
[0028]對比例1:與實施例1的不同之處在于，KH2P〇4更換為醋酸，Na2HP〇4更換為醋酸鈉。 [0029] 對比例2:與實施例1的不同之處在于，按質(zhì)量份，甲醛為0份，dd H20 76份。
[0030] 對比例3:與實施例3的不同之處在于，按質(zhì)量份，EDTA-2Na含量為0份，dd H20 76.2份。
[0031] 采集一份宮頸分泌物樣品，均等分為7份，每份lg，分別浸入實施例1、實施例2、實 施例3、對比例1、對比例2、對比例3、對比例4所述的15ml的液基薄層細胞保存液內(nèi)進行處 理，再將獲得的液體制備成細胞懸液，將制備的細胞懸液進行過濾離心，再將過濾離心后的 液體分成兩份，一份用作細胞完整性實驗，另一份進行抗菌性實驗。
[0032]試驗1細胞形態(tài)完整性測試試驗
[0033]試驗儀器:實驗儀器:復(fù)式雙筒顯微鏡（帶油鏡）、Motic數(shù)碼互動系統(tǒng)、擦鏡紙、蓋 玻片、載玻片、鑷子、記號筆、小片濾紙、吸頭。
[0034] 其他材料:Motic校準片。
[0035]試驗材料:過濾離心處理后的宮頸細胞懸液lml。
[0036]試驗步驟：1)在一干凈的載玻片上滴10微升宮頸細胞懸液，涂布開，加蓋玻片，用 同樣方法制備10塊待檢玻片。
[0037] 2)將motic校準片置于載物臺上，以0.15mm黑點對準通光孔，物鏡調(diào)至40倍鏡下， 調(diào)節(jié)旋鈕至電腦屏幕上出現(xiàn)邊緣清晰的黑色圓點。
[0038] 3)點擊工具欄上"動態(tài)測量"，在屏幕左側(cè)出現(xiàn)工作框。在"校準"下選擇圓直徑 600，物鏡倍數(shù)40 X，然后點擊"校準"框。
[0039] 4)取下校準片，換上待測標本。在40倍鏡下調(diào)節(jié)清楚后，觀察細胞形態(tài)，是否破損、 凝集等。
[0040] 5)在40倍鏡下調(diào)節(jié)清楚后，以動態(tài)測量工具中選擇適當?shù)墓ぞ?，在屏幕上點擊，便 可測定細胞的直徑或面積等數(shù)據(jù)。
[0041 ] 在表1中列出試驗結(jié)果。
[0042] 表 1
[0043]
[0044] 試驗2抗菌性能測試試驗
[0045] 1)用吸管吸取5ml宮頸細胞懸液于試管內(nèi)，再加入45ml滅菌生理鹽水，形成稀釋 液。
[0046] 2)向5個滅菌的平皿內(nèi)加入lml稀釋液，再將涼至46°C營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約 15ml，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻。
[0047] 3)待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，取出計算平板內(nèi)菌落 數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升樣品所含菌落總數(shù)。
[0048] 在表2中列出試驗結(jié)果。
[0049] 表 2
[0050]
【主權(quán)項】
1. 一種液基薄層細胞保存液，其特征在于：以質(zhì)量百分比計，所述液基薄層細胞保存液 由以下成分組成 KCl 1%-3%; KH2PO4 1%-3%; Na5HPO4 0. EDTA-2Na 0.01%-0.1%; 乙二醇 5%-10%; CldH2O 70%-77. 79%; 異丙醇 15%-20%; 甲醛 0. 1%-H2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液基薄層細胞保存液，其特征在于:所述液基薄層細胞保 存液中KH2PO4的質(zhì)量百分比為Iwt %-1 · 5wt %，Na2HP〇4的質(zhì)量百分比為0 · 8wt %-Iwt %。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種液基薄層細胞保存液，其特征在于:所述液基薄層細胞保 存液內(nèi)甲醛的質(zhì)量百分比為0.1 wt %-0.8wt %。4. 一種如權(quán)利要求1所述的液基薄層細胞緩沖液的制備方法，其特征在于： a) 將配方量的Na2HPO4、KH2P〇4、KCl、EDTA-2Na溶解于dd H2O中形成溶液a; b) 將步驟a)獲得的溶液a攪拌均勻，得到溶液b; c) 向步驟b)獲得的溶液b中加入配方量的乙二醇、異丙醇，攪拌均勻，得到溶液c; d) 向步驟c)獲得的溶液c中加入配方量的甲醛，攪拌均勻； 以上各步驟都是在常溫，濕度<90 % RH下進行。
【文檔編號】A01N1/02GK105994252SQ201610466138
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月22日
【發(fā)明人】王云皓, 吳屹豪
【申請人】杭州海世嘉生物科技有限公司