油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育油菜種間及遠(yuǎn)緣雜交材料的方法
【專利摘要】本發(fā)明油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育油菜種間及遠(yuǎn)緣雜交材料的方法，包括：1）油菜種間及遠(yuǎn)緣材料的染色體數(shù)目調(diào)查，確定基因組大??；2）根據(jù)油菜種間及遠(yuǎn)緣材料的染色體數(shù)目或基因組大小確定雜交的父母本位置；3）在花期，人工去雄進(jìn)行種間或遠(yuǎn)緣雜交；4)對雜交后不易獲得種子的遠(yuǎn)緣雜交后代采取胚挽救的形式獲得F1植株；5）用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系對種間及遠(yuǎn)緣雜交F1代授粉；6）誘導(dǎo)后代的染色體數(shù)目觀察、遺傳穩(wěn)定性、結(jié)實性鑒定；7）誘導(dǎo)穩(wěn)定后代用于油菜育種材料轉(zhuǎn)育。本發(fā)明方法可在油菜3個栽培種種間雜交及遠(yuǎn)緣雜交中靈活運用，克服種間雜交和遠(yuǎn)緣雜交F1自交不結(jié)實或自交不親和性現(xiàn)象，提高油菜育種效率，降低人力、物力成本。
【專利說明】
油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育油菜種間及遠(yuǎn)緣雜交材料的方法
[0001 ]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明與農(nóng)業(yè)有關(guān)，特別與油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育油菜種間及遠(yuǎn)緣雜交材料的方法 有關(guān)。
[0002]
【背景技術(shù)】： 油菜是我國主要的油料作物，屬于十字花科，蕓薹屬植物，包括3個栽培種，甘藍(lán)型油菜 (jSrassica fiapus，蕓苔(aa，n=10)與甘藍(lán)(cc，n=9)通過自然種間雜交后雙二倍化進(jìn)化而來 的一種復(fù)合種，根據(jù)染色體來源判斷為四倍體，2n=38);白菜型油菜(jSrassia caspesiris h包括原產(chǎn)中國的蕓苔和油白菜。中國又稱小白菜、矮油菜、甜油菜等。染色體組為aa，n= 10,根據(jù)來源染色體組來源判斷為二倍體，2n=20，） ;芥菜型油菜(Brassica juncea，，由蕓 薹(aa，n=10)和黑芥(bb，n=8)通過自然種間雜交后雙二倍化進(jìn)化而來的一個復(fù)合種，根據(jù) 染色體來源判斷為四倍體，2n=36)。與油菜近緣的物種，包括甘藍(lán)、花菜(花椰菜）、青菜、榨 菜、白菜、黑芥、埃塞俄比亞芥、白芥等，同屬十字花科不同屬的植物包括諸葛菜、紫羅蘭、蘿 卜、板藍(lán)根、蘿卜甘藍(lán)、瑪卡等物種。
[0003] 近年來的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，作物的種間或亞種間雜種優(yōu)勢更為突出。因此，為進(jìn)一步 提高油菜單位面積產(chǎn)量，擴(kuò)大雜種優(yōu)勢利用資源很有必要。同時，油菜中的病害也越來越 多，自身的基因無法實現(xiàn)抗病效果，需要從種間或近緣以及遠(yuǎn)緣植物中通過有性雜交得形 式加以利用。如近年來我國上江上游及中游地區(qū)十字花科作物中出現(xiàn)的嚴(yán)重病害根腫病泛 濫成災(zāi)，在常規(guī)的油菜、甘藍(lán)、蘿卜、白菜、青菜、花菜中都出現(xiàn)大面積的減產(chǎn)或絕收，且沒有 找到抗病基因，相應(yīng)的抗病育種無法開展，化學(xué)藥劑處理效果并不明顯。最近的研究發(fā)現(xiàn)在 大白菜和蘿卜甘藍(lán)型中發(fā)現(xiàn)了對根腫病具有明顯抗病效果的基因。開展油菜抗病育種首先 要將這些基因或基因家族轉(zhuǎn)移到油菜中，因此，油菜的遠(yuǎn)緣雜交就必須開展，而油菜與蘿卜 甘藍(lán)及大白菜雜交，F(xiàn)i不易獲得自交種子，且轉(zhuǎn)育抗病基因資源的周期相當(dāng)漫長。同時，油 菜3個栽培種間也有部分優(yōu)秀基因資源，如果將3個油菜栽培種進(jìn)行種間雜交，將野生或地 方品種優(yōu)良基因到轉(zhuǎn)育推廣油菜品種中，再選育基因型穩(wěn)定的遺傳后代，需要10-20年的 時間，其難度可想而知。因為油菜種間及遠(yuǎn)緣雜交染色體數(shù)目和來源不同，存在嚴(yán)重的基因 隔離現(xiàn)象，相互進(jìn)行種間、遠(yuǎn)緣雜交不容易獲得遺傳穩(wěn)定的后代，給油菜基因交換、轉(zhuǎn)育有 利基因到生產(chǎn)品種帶來較大困難。通常會出現(xiàn)F1自交結(jié)實差或不結(jié)實等現(xiàn)象，只能通過回 交或開放授粉的形式獲得后代，且后代分離嚴(yán)重，很難獲得穩(wěn)定遺傳的株系，同時也會引入 更多的非目標(biāo)性狀基因，對目標(biāo)性狀的定向選擇難度加大，選育周期延長。
[0004]目前，在油菜中還未有誘導(dǎo)系或雙單倍體誘導(dǎo)系的報道。所謂"誘導(dǎo)系"是指，用該 植物作為父本用其花粉對同類植株授粉，能誘導(dǎo)同類植株(母本)產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)，如產(chǎn)生 單倍體、雙單倍體(DH系)等。在植物中運用誘導(dǎo)系進(jìn)行新品種選育最多的是玉米，但玉米中 的誘導(dǎo)系也只是單倍體誘導(dǎo)系。最早出現(xiàn)的玉米單倍體誘導(dǎo)系為stock6,該誘導(dǎo)系只能誘 導(dǎo)玉米產(chǎn)生單倍體，然后單倍體植株再進(jìn)行人工染色體加倍形成純合二倍體(雙單倍體）， 且誘導(dǎo)效率較低，一般誘導(dǎo)效率在10%以下（以收獲種子中獲得單倍體數(shù)計算）。
【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的目的為了提供一種能快速、有效，只需3代(2年或3年)獲得穩(wěn)定純合系株系， 提高了油菜資源創(chuàng)新的效率和途徑的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育油菜種間及遠(yuǎn)緣雜交材料 的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是這樣來實現(xiàn)的： 本發(fā)明油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育油菜種間及遠(yuǎn)緣雜交材料的方法，包括如下具體步 驟： 1) 對油菜種間及遠(yuǎn)緣材料通過植物根尖染色體觀察，進(jìn)行染色體數(shù)目調(diào)查或通過流氏 細(xì)胞儀確定基因組大??； 2) 將具有目標(biāo)性狀的甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜或油菜近緣(甘藍(lán)、白菜、黑 芥、埃塞俄比亞芥等）、遠(yuǎn)緣(諸葛菜、蘿卜、板藍(lán)根、蘿卜甘藍(lán)等十字花科植物)材料兩兩雜交、 聚合雜交或回交;根據(jù)上述步驟1)確定雜交過程中基因組小的材料作父本，染色體數(shù)目大 或基因組大的材料作母本； 3) 上述步驟2)中確定的母本材料在花期進(jìn)行人工去雄，并套袋隔離，人工去雄2-4天 后，取上述步驟2)中確定的父本給去雄母本進(jìn)行人工授粉，授粉后套袋隔離，對遠(yuǎn)緣雜交采 取授粉后10-20天進(jìn)行實驗室胚挽救處理，保證獲得遠(yuǎn)緣雜交h植株； 4) 對上述步驟3)中雜交后代、聚合雜交后代、回交后代以及胚挽救材料，在初花期對花 蕾進(jìn)行人工去雄，為保證獲得誘導(dǎo)后代，去雄數(shù)目在100個花蕾以上，并套袋隔離； 5) 用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系花粉對上述步驟4)中去雄后2-4天植株進(jìn)行人工授粉，并套 袋隔離，收獲其授粉后結(jié)實種子； 6) 對上述步驟5)獲得種子進(jìn)行種植，苗期利用流式細(xì)胞儀鑒定倍性，淘汰多倍體、單倍 體或具有油菜雙單倍體誘導(dǎo)系顯性性狀特征植株，選擇正常育性、二倍體或四倍體植株，單 株套袋自交； 7) 上述步驟6)為獲得單株自交種子，在不清楚染色體數(shù)目及油菜類型的情況下，采用 蕾期，剝蕾強(qiáng)制自交的方式盡可能的獲得自交種子； 8) 上述步驟7)中單株自交種子(二倍體或四倍體)進(jìn)行株系種植，調(diào)查株系形態(tài)一致 性、結(jié)實性，并通過分子標(biāo)記(SSR或SRAP)鑒定株系一致性及穩(wěn)定性； 9) 上述步驟8)中穩(wěn)定株系觀察染色體數(shù)目及染色體行為是否出現(xiàn)異常，獲得的穩(wěn)定遺 傳及結(jié)實性好的種間、遠(yuǎn)緣雜交植株，根據(jù)目標(biāo)性狀(如高含油、抗逆性好、豐產(chǎn)性強(qiáng)、品質(zhì) 優(yōu)良、適應(yīng)性好等特點)進(jìn)入新一輪材料選擇或直接形成油菜雜交育種親本材料或品系等； 10) 上述步驟9)穩(wěn)定株系根據(jù)染色體數(shù)目（2n=38，2n=20，2n=36)和外型判斷為甘藍(lán)型 油菜、芥菜型油菜、白菜型油菜，這些穩(wěn)定株系直接與之對應(yīng)的油菜類型的不育類型進(jìn)行測 交，選育恢復(fù)系、保持系； 11) 上述步驟10)中獲得的穩(wěn)定的白菜型油菜品系需要株系內(nèi)群體授粉的方式獲得。
[0006] 本發(fā)明方法在3個栽培油菜種種間雜交以及近緣、遠(yuǎn)緣雜交轉(zhuǎn)育優(yōu)良基因到推廣 油菜品系及品種中，提高栽培油菜的產(chǎn)量、抗病、抗逆等特性。采用本發(fā)明獲得油菜種間雜 交、遠(yuǎn)緣雜交穩(wěn)定后代借助了油菜雙單倍體誘導(dǎo)系能誘導(dǎo)油菜及近緣屬種母體植株在FIR 發(fā)生孤雌生殖，在^代形成穩(wěn)定的雙單倍體個體，F(xiàn) 3代進(jìn)行穩(wěn)定性、一致性鑒定，獲得穩(wěn)定遺 傳后代。
[0007] 上述油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育方法，包括如下步驟； (1)選育具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系： ① 將兩個油菜親本材料雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色 體加倍獲得加倍后的Fi代植株； ② 加倍后的h代植株進(jìn)行自交或強(qiáng)制自交獲得內(nèi)代，對F2代進(jìn)行田間種植觀察，并鑒定 每個單株的育性，選擇可育后代自交獲得F 3代，對F3代進(jìn)行純合度鑒定，通過形態(tài)、細(xì)胞學(xué)以 及分子標(biāo)記鑒定，對后代DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，電泳觀察每個特異引物擴(kuò)增下單株的 DNA帶型及條帶數(shù)目，顯示每個單株都是兩個親本的雜交后代，每個單株之間分子標(biāo)記圖譜 一致，說明這些單株是純合系一一早代穩(wěn)定系； ③ 獲得的早代穩(wěn)定系與至少10個油菜常規(guī)純合穩(wěn)定系進(jìn)行正反交，F(xiàn)i代、F2R鑒定早 代穩(wěn)定系的遺傳特性，即是否有孤雌生殖特性;上述正反交，如有Fi分離，^代出現(xiàn)部分穩(wěn)定 株系，對應(yīng)的早代穩(wěn)定系是具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系； (2) 選育攜帶顯性遺傳性狀、具有孤雌遺傳特性且倍性遺傳穩(wěn)定的多倍體油菜： ① 具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交(如顯性矮桿、紫葉、 花葉、黃葉、高芥酸等性狀），得到雜交?:代種子，上述雜交子在培養(yǎng)基上用染色體加倍 誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍，得到加倍后的帶顯性性狀的^植株； ② 對加倍的帶顯性性狀的Fi植株，通過顯微觀察或流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色體倍性鑒定， 選擇帶顯性性狀的多倍體的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍體植株、以及不帶顯性性狀加 倍植株，帶顯性性狀的多倍體的植株主要是倍性遺傳穩(wěn)定、結(jié)實性好、具有孤雌生殖遺傳特 性、帶顯性性狀（如顯性矮桿、紫葉、花葉、黃葉、高芥酸等性狀）的六倍體或八倍體油菜植 株； (3) 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系鑒定及誘導(dǎo)能力測定： ① 倍性遺傳穩(wěn)定、具有孤雌生殖遺傳特性、帶顯性性狀的多倍體植株中的顯性性狀能 去除測交后代中產(chǎn)生的雜交株，如果測交后代中出現(xiàn)顯性性狀植株、或非整倍體植株，說明 該植株是多倍體植株和母本雜交產(chǎn)生的，去除該植株； ② 上述單株測交后代如果出現(xiàn)全不育、為正常倍性即二倍體或四倍體油菜、且不帶顯 性性狀，說明該測交后代對應(yīng)的父本基因未進(jìn)入測交后代中，顯性多倍體植株為油菜雙單 倍體誘導(dǎo)系； 上述方法中獲得油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育是將兩個親本材料雜交FiR種子或具有孤 雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交得到的雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上 用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍，具體方法如下： 1) 用純度為75%酒精進(jìn)行種子表面消毒25-40秒，用0.1%升汞消毒12-17分鐘，然后用 無菌水將種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在 第一培養(yǎng)基上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度23-25%，白天光照12-16小時， 光照強(qiáng)度2000-3000勒克斯，夜晚暗培養(yǎng)8-12小時，待植株長到1 一2片真葉時，從下胚軸 處剪下植株繼續(xù)在第二培養(yǎng)基上生長； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?-7天，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基用自來水沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15-30分鐘后移栽到溫室中，溫室 溫度16QC-25QC，相對濕度60-80%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤 0.5-1.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 30-70mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤 0.5-lmg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 20-40mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α一蔡乙酸 0.03-0.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 5-20mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的浸泡緩沖液由以及下配比的組分組成： 水 1L 易?；蚩寺?0.6-1.2g α一萘乙酸 0.5-lmg。
[0008] 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系能直接誘導(dǎo)油菜產(chǎn)生雙單倍體后代，無需進(jìn)行人工染色體加 倍來獲得純合系;且誘導(dǎo)效率高，最高可達(dá)1〇〇%，一般的誘導(dǎo)效率都在50%以上。雙單倍體誘 導(dǎo)系誘導(dǎo)母體植株產(chǎn)生雙單倍體的主要原理是:誘導(dǎo)系能誘導(dǎo)母體植株，大孢子生殖細(xì)胞 (卵細(xì)胞)產(chǎn)生孤雌生殖效應(yīng)，且卵細(xì)胞能進(jìn)行染色體加倍，即卵細(xì)胞孤雌生殖產(chǎn)生的后代 就雙單倍體。 上述的染色體加倍誘導(dǎo)劑采用秋水仙素、氟樂靈、氨磺樂靈中的至少一種。
[0009] 本發(fā)明方法可以快速(3代）、高效獲得油菜育種上或基礎(chǔ)研究中具有應(yīng)用價值的 油菜種間、遠(yuǎn)緣雜交穩(wěn)定后代，克服雜種Fi無法自交的結(jié)實的現(xiàn)象;且本方法應(yīng)用范圍廣， 不僅適用于油菜種間雜交也適用于油菜遠(yuǎn)緣雜交后代的選育，為油菜遺傳育種、抗病育種 資、雜交優(yōu)勢利用奠定堅實基礎(chǔ)。
[0010] 本發(fā)明方法可以快速用于油菜種間、遠(yuǎn)緣雜交專于油菜育種資源新材料?？梢栽? 年或3代的時間內(nèi)獲得種間雜交或遠(yuǎn)緣雜交穩(wěn)定株系，大大節(jié)約油菜資源創(chuàng)新、抗病、抗逆 育種時間和周期，提高育種效率。
[0011] 本發(fā)明方法油菜雙單倍體誘導(dǎo)系(六倍體或八倍體植株)的基本原理是:誘導(dǎo)系具 有孤雌生殖誘導(dǎo)基因，誘導(dǎo)系作父本時，誘導(dǎo)系染色體(或基因）沒有與母體植株染色體融 合，而是誘導(dǎo)母體植株（即卵細(xì)胞)產(chǎn)生孤雌生殖效應(yīng)，且母體植株卵細(xì)胞染色體自身加倍 形成雙單倍體。
[0012] 本發(fā)明方法具有以下優(yōu)點： 1、 該方法可以在油菜3個栽培種種間雜交及遠(yuǎn)緣雜交后代中應(yīng)用，覆蓋整個油菜及近 緣屬種作物，應(yīng)用范圍廣； 2、 本方法可以克服油菜種間雜交及遠(yuǎn)緣雜交h自交不結(jié)實或自交不親和現(xiàn)象； 3、 本方法直接獲得穩(wěn)定遺傳的油菜種間雜交或遠(yuǎn)緣雜交后代，F(xiàn)i代無需開放授粉或回 交轉(zhuǎn)育等措施，減少優(yōu)良基因的轉(zhuǎn)育時間； 4、 本方法可以高效、快速，在3代(2-3年），獲得穩(wěn)定純合的油菜種間雜交或遠(yuǎn)緣雜交 新材料； 5、 本方法可直接誘導(dǎo)油菜種間雜交及遠(yuǎn)緣雜交F1獲得穩(wěn)定的二倍體株系，無需進(jìn)行人 工染色體加倍，可一步形成穩(wěn)定后代。
[0013]【附圖說明】： 圖1為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育油菜種間及遠(yuǎn)緣雜交新材料的流程圖。
[0014] 圖2為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育流程圖。
[0015] 圖3為獲得油菜早代穩(wěn)定系的方法流程圖。
[0016] 圖4為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3560選育流程圖。
[0017]圖5為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3380選育流程圖。
[0018]圖6為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y4958的選育流程圖。
[0019] 圖7為油菜早代穩(wěn)定系P3-2選育流程圖。
[0020] 圖8為甘白雜交(甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜)種間雜交后代新品系XB -16的選育。
[0021] 圖9為甘芥雜交(甘藍(lán)型油菜與芥菜型油菜)種間雜交后代新品系XJ-3的選育。 [0022]圖10為甘藍(lán)型油菜與諸葛菜遠(yuǎn)緣雜交后代新品系GZG-6的選育。
[0023]圖11為甘藍(lán)型油菜與蘿卜甘藍(lán)遠(yuǎn)緣雜交后代新品系GLG -11的選育。
[0024]圖12為P3-2四倍體油菜根尖染色體倍性鑒定圖。
[0025]圖13為P3-2四倍體流式細(xì)胞倍性鑒定圖。
[0026]圖14為Y3380流式細(xì)胞倍性鑒定圖。
[0027]圖15為為Y3560流式細(xì)胞倍性鑒定圖。
[0028]圖16為Y4958流式細(xì)胞倍性鑒定圖。
[0029]【具體實施方式】： 實施例1: 參見圖1、圖2、圖6、圖8,甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜雜交轉(zhuǎn)育優(yōu)良基因到甘藍(lán)型油菜中 擴(kuò)大甘藍(lán)型油菜的基因資源是甘藍(lán)型油菜資源創(chuàng)新、新材料創(chuàng)制的主要途徑。甘藍(lán)型油菜 蓉B0464與白菜型油菜雅安黃YH種間雜交，期望將YH中的早熟、高含油、黃籽基因?qū)敫仕{(lán) 型油菜中。用甘藍(lán)型油菜蓉B0464作母本，白菜型油菜雅安黃YH作父本進(jìn)行雜交獲得雜交 花期剝蕾去雄，用本
【申請人】獲得的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y4958作父本進(jìn)行授粉誘導(dǎo)， F 2代(誘導(dǎo)后代)單株種植，并進(jìn)行流式細(xì)胞檢測、選育性正常、倍性（四倍體)正常、無誘導(dǎo) 系顯性性狀(花葉)植株套袋自交，F(xiàn)3代按株系種植，鑒定株系內(nèi)性狀一致性和穩(wěn)定性，選育 出一個株系內(nèi)遺傳穩(wěn)定的種間雜交后代新品系XB -16(四倍體，2n=38)，該品系含油率高 (49%)、褐黃籽、熟期較蓉B0464提早15天，但芥酸含量較高，還需要與雙低甘藍(lán)型油菜進(jìn)行 新一輪雜交選育才能在生產(chǎn)上運用。
[0030] 本實施例中，油菜雙單倍體誘導(dǎo)系是通過以下方法獲得的： 參見圖2、圖3、圖4、圖12、圖13、圖15,由本
【申請人】獲得的甘藍(lán)型油菜四倍體早代穩(wěn)定系 P3-2，與20個純合甘藍(lán)型四倍體油菜正反交，3個正反交^代出現(xiàn)分離，且這3個組合F2代出 現(xiàn)穩(wěn)定株系，說明P3-2具有孤雌生殖遺傳特性。用P3-2與高芥酸、矮桿油菜4247正反交 (矮桿、高芥酸為顯性性狀），然后將雜交^代種子進(jìn)行染色體加倍，加倍后代用流式細(xì)胞儀 鑒定或根尖顯微鏡觀察鑒定為顯示矮桿八倍體植株，該植株定名為Y3560。
[0031] 參見圖2、圖3、圖5、圖12、圖13、圖14,由本
【申請人】獲得的甘藍(lán)型油菜四倍體早代穩(wěn) 定系P3-2，與20個純合甘藍(lán)型四倍體油菜正反交，3個正反交^代出現(xiàn)分離，且這3個組合F 2 代出現(xiàn)穩(wěn)定株系，說明P3-2具有孤雌生殖遺傳特性。用P3-2與四倍體甘藍(lán)型矮桿油菜 D3-5正反交(矮桿為顯性性狀），然后將雜交種子進(jìn)行染色體加倍，加倍后代用流式細(xì) 胞儀鑒定或根尖顯微鏡觀察鑒定為顯示矮桿八倍體植株，該植株定名為Y3380。
[0032]參見圖2、圖3、圖6、圖12、圖13、圖16,由本
【申請人】獲得的甘藍(lán)型油菜四倍體早代穩(wěn) 定系P3-2，與20個純合甘藍(lán)型四倍體油菜正反交，3個正反交^代出現(xiàn)分離，且這3個組合F2 代出現(xiàn)穩(wěn)定株系，說明P3-2具有孤雌生殖遺傳特性。用P3-2與白菜型花葉油菜08nl雜交 (花葉為顯性性狀），然后將雜交FHf種子進(jìn)行染色體加倍，加倍后代用流式細(xì)胞儀鑒定或 根尖顯微鏡觀察鑒定為顯示矮桿六倍體植株，該植株定名為Y4958。
[0033]本實施例中將P3-2與矮桿油菜D3-5雜交Fi、P3-2與矮桿、高芥酸油菜4247雜交 Fi以及P3-2與白菜型花葉油菜08nl雜交Fi種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進(jìn)行人工染色體加 倍的具體方法如下： 1) 用純度為75%酒精進(jìn)行種子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分鐘，然后用無菌水將 種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第一培養(yǎng) 基(染色體加倍誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度250C，白天光照16小時，光照強(qiáng)度 2000勒克斯，晚上暗培養(yǎng)8小時，待長到1 一2片真葉時，將植株從下胚軸剪下繼續(xù)在第二培 養(yǎng)基上生長； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基）中進(jìn)行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?天后，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15分鐘后移栽到溫室中，溫室溫度250C，相對 濕度60%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤(6BA) 0.5mg 秋水仙素 50mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0。
[0034] MS培養(yǎng)基由Murashige和Skoog發(fā)明，簡寫為MS，其配方參見附表1。
[0035]上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤(6BA) 0.5mg 秋水仙素 30mg 鹿糖 30g 瓊脂 8g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0。
[0036]上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α-萘乙酸 0.03mg 秋水仙素 20mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0。
[0037] 上述的浸泡緩沖液由以下配比的組分組成： 水 1L 易保或克露 〇.6g α -萘乙酸 0.5mg。
[0038] 參見圖2、圖5、圖14,用Y3380作父本，與甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系(0464A)測交，測 交后代50株，全為高桿，且全為四倍體油菜，其中49株為全不育，1株半不育，且形態(tài)特征與 0464A完全相同。同時用P3-2與矮桿油菜D3-5雜交F!(非加倍株)做父本與0464A測交作為 對照驗證，測交后代102株，出現(xiàn)矮桿62株、高桿40株、且育性分離較大，出現(xiàn)全可育73株、半 不育20株、全不育9株。說明Y3380中的基因并未進(jìn)入測交株，測交后代為0464A孤雌生殖而 來，誘導(dǎo)率98%。用Y3380做父本與甘藍(lán)型油菜3954去雄聚合雜交(3954SFi，由中雙11與CAX 雜交而來），聚合雜交后代h分離，每個Fi自交，收獲Fi自交株45個。種植F2代株系45個，出現(xiàn) 穩(wěn)定株系45個，穩(wěn)定株系出現(xiàn)比列100%，誘導(dǎo)率100%。
[0039] 用Y3380做父本與甘藍(lán)型油菜3968去雄聚合雜交(3968SFi，由中雙11與1365雜交 而來），聚合雜交后代h分離，每個h自交，收獲Fi自交株52個。種植F2代株系52個，出現(xiàn)穩(wěn)定 株系28個，穩(wěn)定株系出現(xiàn)比例53.85%，誘導(dǎo)率53.85%。
[0040]用Y3380做父本與甘藍(lán)型油菜中雙11(常規(guī)品種，純合系）去雄雜交，獲得雜交?:植 株70株，70ftFi形態(tài)與中雙11完全相同，且每個單株自交后F2代未發(fā)生分離，為穩(wěn)定株系，與 中雙11形態(tài)也完全相同，說明F!代就為純系。即Y3380與中雙11雜交過程，誘導(dǎo)中雙11發(fā)生 了孤雌生殖，所產(chǎn)生的FiS孤雌生殖自交，是純合系，因此Fi穩(wěn)定、F 2也穩(wěn)定，且與中雙11形 態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率100%。
[00411同樣用Y3380做父本與白菜型油菜雅安黃油菜YH(二倍體油菜，2 η =20)去雄雜 交，獲得雜交Fi植株98株，97株?1形態(tài)與ΥΗ完全相同，且每個單株自交后F2R形態(tài)都為二倍 體、外形與YH-致，說明Y3380與YH雜交過程，誘導(dǎo)YH發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的^為孤雌生 殖自交，且與YH形態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率98.9%。最終，顯性矮桿八倍體植株Y3380確定為油 菜雙單倍體誘導(dǎo)系。
[0042]參見圖2、圖4、圖15,用Y3560作父本，與甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系(0464A)測交，測 交后代80株，全為高桿，且76為四倍體油菜、2株為二倍體、2株為八倍體;其中76株四倍體植 株為全不育，4株半不育，且形態(tài)特征與0464A完全相同。同時用P3-2與矮桿、高芥酸油菜 4247雜交F!(非加倍株）做父本與0464A測交作為對照驗證，測交后代153株，出現(xiàn)矮桿102 株、高桿51株、且育性分離較大，出現(xiàn)全可育65株、半不育35株、全不育53株。說明Y3560中的 基因并未進(jìn)入測交株，測交后代為0464A孤雌生殖而來，誘導(dǎo)率95%。
[0043]用Y3560做父本與白菜型油菜雅安黃油菜YH(二倍體油菜，2 η =20)去雄雜交，獲 得雜交F:植株145株，143株?1形態(tài)與ΥΗ完全相同，且每個單株自交后F2代形態(tài)都為二倍體、 外形與YH-致，說明Y3560與YH雜交過程，誘導(dǎo)YH發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的Fi為孤雌生殖 自交，且與YH形態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率98.6%。
[0044]同樣用Y3560做父本與芥菜型油菜GW(四倍體油菜，2 η =36)去雄雜交，獲得雜交 Fi植株124株，123株&形態(tài)與GW完全相同，且每個單株自交后F2代形態(tài)都為四倍體、外形與 YH-致，說明Y3560與GW雜交過程，誘導(dǎo)GW發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的FiS孤雌生殖自交，且 與GW形態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率99.2%。最終，顯性矮桿八倍體植株Y3560確定為油菜雙單倍 體誘導(dǎo)系。
[0045]參加圖2、圖6、圖16,用Y4958作父本，與甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系(0068A)測交，測 交后代112株，全為高桿，且全為四倍體油菜，其中108株為全不育，4株半不育，且形態(tài)特征 與0068A完全相同。同時用P3-2與白菜型花葉油菜08nl雜交F!(非加倍株)做父本與0068A 測交作為對照驗證，測交后代89株，出現(xiàn)常葉植株59株、花葉植株30株、且育性分尚較大，出 現(xiàn)全可育45株、半不育20株、全不育24株。說明Y4958中的基因并未進(jìn)入測交株，測交后代為 0068A孤雌生殖而來，誘導(dǎo)率96.4%。
[0046]用Y4958做父本與白菜型油菜雅安黃油菜YH(二倍體油菜，2 η =20)去雄雜交，獲 得雜交F:植株88株，88株?1形態(tài)與ΥΗ完全相同，且每個單株自交后F2代形態(tài)都為二倍體、外 形與YH-致，說明Y4959與YH雜交過程，誘導(dǎo)YH發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的Fi為孤雌生殖自 交，且與YH形態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率100%。
[0047]用Y4958做父本與芥菜型油菜GW(四倍體油菜，2 η = 36)去雄雜交，獲得雜交 株75株，75株&形態(tài)與GW完全相同，且每個單株自交后F2代形態(tài)都為四倍體、外形與GW-致， 說明Y4958與GW雜交過程，誘導(dǎo)GW發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的FiS孤雌生殖自交，且與GW形 態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率100%。
[0048]同樣Y4958做父本與核不育GMS不育系3306測交，測交后代159株，且全為四倍體油 菜，其中108株為全不育，4株半不育，且形態(tài)特征與0068A完全相同。同時用P3-2與白菜型 花葉油菜08nl雜交h(非加倍株)做父本與0068A測交作為對照驗證，測交后代89株，出現(xiàn)常 葉植株59株、花葉植株30株、且育性分尚較大，出現(xiàn)全可育45株、半不育20株、全不育24株。 說明Y4958中的基因并未進(jìn)入測交株，測交后代為0068A孤雌生殖而來，誘導(dǎo)率96.4%。
[0049]最終，顯性花葉六倍體植株Y4958確定為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系。
[0050] 參見圖3、圖7、圖12、圖13,獲得早代穩(wěn)定系P3-2方法如下： 甘藍(lán)型油菜F009(四倍體，染色體2n=38)與白菜型油菜YH(二倍體，雅安黃油菜，染色體 2n=20)剝蕾進(jìn)行人工去雄雜交獲得h代雜交種子。^代雜交種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進(jìn) 行人工染色體加倍。對加倍后的FHf植株進(jìn)行自交(或強(qiáng)制自交)獲得^代，對F 2代進(jìn)行田間 種植觀察、育性鑒定即通過醋酸洋紅對花粉染色，判斷花粉育性，出現(xiàn)三種情況（1、單倍體 植株，花粉極少，且育性極低；2、多倍體植株完全不育，花器官發(fā)育受阻，不能正常的開花， 無花粉;3、正?？捎闹仓?，花粉量多，花粉育性95%以上）。對? 2代正?？捎龁沃赀M(jìn)行自交 獲得F3代。對F3代進(jìn)行純合度鑒定，種植F3代單株株系，32%的可育株系單株植株整齊一致， 開花結(jié)實正常。對整齊一致株系進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，染色體條數(shù)一致(38條），染色體形態(tài)未出 現(xiàn)異常。SSR分子標(biāo)記，通過DNA聚合酶鏈反應(yīng)，電泳觀察每個特異引物擴(kuò)增下單株DNA帶型， 顯示每個單株都是H)09與YH的雜交后代，且每個單株DNA擴(kuò)增條帶數(shù)目及帶型一致，可以判 斷這些株系為純合系，即早代穩(wěn)定系。將其中1個葉片較大、無裂葉、葉片著生緊湊、含油率 55%的甘藍(lán)型(染色體38條)油菜早代穩(wěn)定系定名為P3-2。
[0051] 本實施例中將F1代雜交種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進(jìn)行人工染色體加倍的具體 方法如下： 1) 用純度為75%酒精進(jìn)行種子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分鐘，然后用無菌水將 種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第一培養(yǎng) 基(染色體加倍誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度250C，白天光照16小時，光照強(qiáng)度 2000勒克斯，晚上暗培養(yǎng)8小時，待長到1 一2片真葉時，將植株從下胚軸剪下繼續(xù)在第二培 養(yǎng)基上生長； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基）中進(jìn)行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?天后，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15分鐘后移栽到溫室中，溫室溫度250C，相對 濕度60%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤(6BA) 0.5mg 秋水仙素 30mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0。
[0052] MS培養(yǎng)基由Murashige和Skoog發(fā)明，簡寫為MS，其配方參見附表1。
[0053]上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤(6BA) 0.5mg 秋水仙素 20mg 鹿糖 30g 瓊脂 8g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0。
[0054] 上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α-萘乙酸 0.03mg 秋水仙素 5mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0。
[0055] 上述的浸泡緩沖液由以下配比的組分組成： 水 1L 易保或克露 〇.6g α -萘乙酸 0.5mg。
[0056] 附表1 MS培養(yǎng)基成分配方
實施例2: 參見圖1、圖2、圖6、圖9,甘藍(lán)型油菜與芥菜型油菜雜交轉(zhuǎn)育優(yōu)良基因到甘藍(lán)型油菜中 擴(kuò)大甘藍(lán)型油菜的基因資源也是甘藍(lán)型油菜資源創(chuàng)新、新材料創(chuàng)制的主要途徑之一。用甘 藍(lán)型油菜蓉B0464作母本，紫色芥菜型油菜ZJ作父本進(jìn)行雜交獲得雜交代花期剝蕾去 雄，用本
【申請人】獲得的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y4958作父本進(jìn)行授粉誘導(dǎo)，內(nèi)代(誘導(dǎo)后代)單 株種植，并進(jìn)行流式細(xì)胞檢測、選育性正常、倍性（四倍體)正常、無誘導(dǎo)系顯性性狀(花葉） 植株套袋自交，F(xiàn)3代按株系種植，鑒定株系內(nèi)性狀一致性和穩(wěn)定性，選育出一個株系內(nèi)遺傳 穩(wěn)定的種間雜交后代新品系XJ-3 (四倍體，2n=38)，該品系紫色葉片、含油率高(45 % )、褐 黃籽、熟期較蓉B0464相當(dāng)、抗倒性、抗病性好，芥酸含量較高，還需要與雙低甘藍(lán)型油菜進(jìn) 行新一輪雜交選育才能在雙低油菜品種選育中運用，但該品系為紫色葉片可以與綠色葉片 油菜一起種植，在田間形成圖案，便于拓展油菜的旅游觀光功能，促進(jìn)鄉(xiāng)村旅游。
[0057] 實施例3: 參見圖1、圖2、圖5、圖10,甘藍(lán)型油菜與諸葛菜雜交轉(zhuǎn)育優(yōu)良基因到甘藍(lán)型油菜中擴(kuò)大 甘藍(lán)型油菜的基因資源是甘藍(lán)型油菜資源創(chuàng)新、新材料創(chuàng)制的主要途徑。甘藍(lán)型油菜蓉 B0068與諸葛菜遠(yuǎn)緣雜交，期望將諸葛菜中的早熟、高亞油酸、亞麻酸、紫花性狀導(dǎo)入甘藍(lán)型 油菜中。由于甘藍(lán)型油菜染色體2n=38條，諸葛菜染色體2n=24,因此用甘藍(lán)型油菜B0068作 母本更容易獲得雜交F:種子。對雜交后獲得FHf，初花期剝蕾去雄，用本
【申請人】獲得的油菜 雙單倍體誘導(dǎo)系Y3380作父本進(jìn)行授粉誘導(dǎo)，^代(誘導(dǎo)后代)單株種植，并進(jìn)行流式細(xì)胞檢 測、選育性正常、倍性正常、無誘導(dǎo)系顯性性狀(矮桿)植株套袋自交，內(nèi)代按株系種植，鑒定 株系內(nèi)性狀一致性和穩(wěn)定性，選育出一個株系內(nèi)遺傳穩(wěn)定的遠(yuǎn)緣雜交后代新品系GZG-6 (四倍體，2n=38)，該品系含油率高(45 % )、褐黃籽、熟期較蓉B0068提早3天，亞油酸、亞麻酸 含量提高8%，花色仍為黃花。
[0058] 實施例4: 參見圖1、圖2、圖4、圖11，甘藍(lán)型油菜與蘿卜甘藍(lán)雜交轉(zhuǎn)育，抗根腫病基因到甘藍(lán)型油菜 中，提高甘藍(lán)型油菜的抗根腫病能力。甘藍(lán)型油菜蓉C4809與蘿卜甘藍(lán)遠(yuǎn)緣雜交，期望將蘿卜 甘藍(lán)的白花、抗根腫病基因轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜中。由于甘藍(lán)型油菜染色體2n=38條，蘿卜甘藍(lán) 染色體2n=28,因此用甘藍(lán)型油菜C4809作母本更容易獲得雜交?!種子。用蘿卜甘藍(lán)與甘藍(lán)型 油菜C4809授粉，授粉后15天取子房回實驗室進(jìn)行胚挽救處理，將子房消毒處理，接種在含 有B5培養(yǎng)基+6BA( lmg/L)+NAA(0.2mg/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-40天。待小苗長出后，在生根 培養(yǎng)基(MS+NAA(0.005mg/L)上生根，后移栽到大田中。對胚挽救獲得的雜交?!代植株，初花 期剝蕾去雄，用本
【申請人】獲得的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3560作父本進(jìn)行授粉誘導(dǎo)，^代(誘 導(dǎo)后代)單株種植，并進(jìn)行流式細(xì)胞檢測、選育性正常、倍性正常、無誘導(dǎo)系顯性性狀(矮桿） 植株套袋自交，F(xiàn) 3代按株系種植，鑒定株系內(nèi)性狀一致性和穩(wěn)定性，選育出一個株系內(nèi)遺傳 穩(wěn)定的遠(yuǎn)緣雜交后代新品系GLG- 11 (2n=38)，該品系含油率高(41 % )、黑籽、純白花、抗根 腫病能力較蓉C4809強(qiáng)70%以上，抗性還需進(jìn)一步提高。
[0059] 本實施例2、實施例3、實施例4中的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系的選育方法同實施例1。
[0060] 上述實施例是對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述 主題的范圍僅限于上述實施例。凡基于上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1.油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育油菜種間及遠(yuǎn)緣雜交材料的方法，包括以下步驟 1) 對油菜種間及遠(yuǎn)緣材料通過植物根尖染色體觀察，進(jìn)行染色體數(shù)目調(diào)查或通過流氏 細(xì)胞儀確定基因組大小； 2) 將具有目標(biāo)性狀的甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜或油菜近緣、遠(yuǎn)緣材料兩兩 雜交、聚合雜交或回交； 根據(jù)上述步驟1)確定雜交過程中基因組小的材料作父本，基因組大的材料作母本； 3) 上述步驟2)中確定的母本材料在花期進(jìn)行人工去雄，并套袋隔離，人工去雄2-4天 后，取上述步驟2)中確定的父本給去雄母本進(jìn)行人工授粉，授粉后套袋隔離，對遠(yuǎn)緣雜交采 取授粉后10-20天進(jìn)行實驗室胚挽救處理，保證獲得遠(yuǎn)緣雜交h植株； 4) 對上述步驟3)中雜交后代、聚合雜交后代、回交后代以及胚挽救材料，在初花期對花 蕾進(jìn)行人工去雄，為保證獲得誘導(dǎo)后代，去雄數(shù)目在100個花蕾以上，并套袋隔離； 5) 用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系花粉對上述步驟4)中去雄后2-4天植株進(jìn)行人工授粉，并套 袋隔離，收獲其授粉后結(jié)實種子； 6) 對上述步驟5)獲得種子進(jìn)行種植，苗期利用流式細(xì)胞儀鑒定倍性，淘汰多倍體、單倍 體或具有油菜雙單倍體誘導(dǎo)系顯性性狀特征植株，選擇正常育性、二倍體或四倍體植株，單 株套袋自交； 7) 上述步驟6)為獲得單株自交種子，在不清楚染色體數(shù)目及油菜類型的情況下，采用 蕾期剝蕾強(qiáng)制自交的方式盡可能的獲得自交種子； 8) 上述步驟7)中單株自交種子即二倍體或四倍體種子進(jìn)行株系種植，調(diào)查株系形態(tài)一 致性、結(jié)實性，并通過分子標(biāo)記鑒定株系一致性及穩(wěn)定性； 9) 上述步驟8)中穩(wěn)定株系觀察染色體數(shù)目及染色體行為是否出現(xiàn)異常，獲得的穩(wěn)定遺 傳及結(jié)實性好的種間、遠(yuǎn)緣雜交植株，根據(jù)目標(biāo)性狀進(jìn)入新一輪材料選擇或直接形成油菜 雜交育種親本材料或品系； 10) 上述步驟9)穩(wěn)定株系根據(jù)染色體數(shù)目和外型判斷為甘藍(lán)型油菜、芥菜型油菜、白菜 型油菜，這些穩(wěn)定株系直接與之對應(yīng)的油菜類型的不育類型進(jìn)行測交，選育恢復(fù)系、保持 系； 11) 上述步驟10)中獲得的穩(wěn)定的白菜型油菜品系需要株系內(nèi)群體授粉的方式獲得； 上述油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育方法，包括如下步驟： (1)選育具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系： ① 將兩個油菜親本材料雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體 加倍獲得加倍后的Fi代植株； ② 加倍后的Fi代植株進(jìn)行自交或強(qiáng)制自交獲得內(nèi)代，對F2代進(jìn)行田間種植觀察，并鑒定 每個單株的育性，選擇可育后代自交獲得F 3代，對F3代進(jìn)行純合度鑒定，通過形態(tài)、細(xì)胞學(xué)以 及分子標(biāo)記鑒定，對后代DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，電泳觀察每個特異引物擴(kuò)增下單株的 DNA帶型及條帶數(shù)目，顯示每個單株都是兩個親本的雜交后代，每個單株之間分子標(biāo)記圖譜 一致，說明這些單株是純合系一一早代穩(wěn)定系； ③ 獲得的早代穩(wěn)定系與至少10個油菜常規(guī)純合穩(wěn)定系進(jìn)行正反交，F(xiàn)i代、F2代鑒定早代 穩(wěn)定系的遺傳特性，即是否有孤雌生殖特性;上述正反交，如有Fi分離，F(xiàn) 2代出現(xiàn)部分穩(wěn)定株 系，對應(yīng)的早代穩(wěn)定系是具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系； (2)選育攜帶顯性遺傳性狀、具有孤雌遺傳特性且倍性遺傳穩(wěn)定的多倍體油菜： ① 具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交，得到雜交^代種子， 雜交^種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍，得到加倍后的帶顯性性 狀的Fi植株； ② 對加倍的帶顯性性狀的Fi植株，通過顯微觀察或流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色體倍性鑒定，選 擇帶顯性性狀的多倍體的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍體植株、以及不帶顯性性狀加倍 植株，帶顯性性狀的多倍體的植株，主要是倍性遺傳穩(wěn)定、結(jié)實性好、具有孤雌生殖遺傳特 性、帶顯性性狀的六倍體或八倍體油菜植株； 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系鑒定及誘導(dǎo)能力測定： ① 倍性遺傳穩(wěn)定、具有孤雌生殖遺傳特性、帶顯性性狀的多倍體植株中的顯性性狀能 去除測交后代中產(chǎn)生的雜交株，如果測交后代中出現(xiàn)顯性性狀植株、或非整倍體植株，說明 該植株是多倍體植株和母本雜交產(chǎn)生的，去除該植株； ② 上述單株測交后代如果出現(xiàn)全不育、為正常倍性即二倍體或四倍體油菜、且不帶顯 性性狀，說明該測交后代對應(yīng)的父本基因未進(jìn)入測交后代中，顯性多倍體植株為油菜雙單 倍體誘導(dǎo)系。2.如權(quán)利要求1所述的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育油菜種間及遠(yuǎn)緣雜交材料的方法，其 特征在于關(guān)鍵在于油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育是將兩個親本材料雜交Fi代種子或具有孤雌 生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交得到的雜交?:代種子在培養(yǎng)基上用 染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍，具體方法如下： 1) 用純度為75%酒精進(jìn)行種子表面消毒25-40秒，用0.1%升汞消毒12-17分鐘，然后用 無菌水將種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在 第一培養(yǎng)基上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度23-25叱，白天光照12-16小時，光 照強(qiáng)度2000-3000勒克斯，夜晚暗培養(yǎng)8-12小時，待植株長到1 一2片真葉時，從下胚軸處 剪下植株繼續(xù)在第二培養(yǎng)基上生長； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?-7天，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基用自來水沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15-30分鐘后移栽到溫室中，溫室 溫度16 QC-25QC，相對濕度60-80%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤 0.5-1.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 30-70mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤 0.5-lmg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 20-40mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α一蔡乙酸 0.03-0.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 5-20mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的浸泡緩沖液由以及下配比的組分組成： 水 1L 易?；蚩寺?0.6-1.2g α一蔡乙酸 0.5-lmg3.如權(quán)利要求1或2所述的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育油菜種間及遠(yuǎn)緣雜交材料的方法， 其特征在于染色體加倍誘導(dǎo)劑采用秋水仙素、氟樂靈、氨磺樂靈中的至少一種。
【文檔編號】A01H1/02GK106035066SQ201610458208
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】付紹紅, 楊進(jìn), 王繼勝, 鄒瓊, 陶蘭蓉, 康澤明, 李云, 唐蓉, 殷麗琴
【申請人】成都市農(nóng)林科學(xué)院