油菜雙單倍體誘導系選育芥菜型油菜品種及材料的方法
【專利摘要】本發(fā)明油菜雙單倍體誘導系選育芥菜型油菜品種及材料的方法，包括：1）確定芥菜型油菜品種及材料選育的目標性狀；2）將至少2個具有目標性狀的芥菜型油菜雜交、聚合雜交或回交。3）用油菜雙單倍體誘導系對雜交、聚合雜交或回交后代授粉；4）鑒定誘導后代遺傳穩(wěn)定性,并按株系自交繁殖；5）誘導穩(wěn)定后代株系產(chǎn)量、抗性、品質(zhì)性狀鑒定；6）根據(jù)產(chǎn)量、品質(zhì)性狀、抗性，確定穩(wěn)定株系形成芥菜型油菜常規(guī)品種；7）誘導后代遺傳穩(wěn)定株系形成芥菜型油菜新品系并與芥菜型油菜不育系測交，形成保持系或恢復系，或進入下一輪品種及材料選育過程。本發(fā)明方法能大大提高芥菜型油菜雜交品種或常規(guī)品種的選育速度和效率，降低人力物力。
【專利說明】
油菜雙單倍體誘導系選育芥菜型油菜品種及材料的方法
[0001 ]
技術領域： 本發(fā)明與農(nóng)業(yè)有關，特別與油菜雙單倍體誘導系選育芥菜型油菜品種及材料的方法有 關。
[0002]
【背景技術】： 油菜是我國主要的油料作物，包括3個栽培種，甘藍型油菜(jSrassica /ja/ws，蕓苔(aa， n=10)與甘藍(cc，n=9)通過自然種間雜交后雙二倍化進化而來的一種復合種，根據(jù)染色體 來源判斷為四倍體，2n=38);白菜型油菜(jSrassia caspesiris 包括原產(chǎn)中國的蕓苔和 油白菜。中國又稱小白菜、矮油菜、甜油菜等。染色體組為aa，n=10,根據(jù)來源染色體組來源 判斷為二倍體，2n=20,）；芥菜型油菜(Brassica juncea，，由蕓薹(aa，n=10)和黑芥(bb，n= 8)通過自然種間雜交后雙二倍化進化而來的一個復合種，根據(jù)染色體來源判斷為四倍體， 2n=36)。芥菜型油菜具有耐貧瘠、黃籽、高含油等優(yōu)點，適合在山區(qū)、土地貧瘠地區(qū)種植，且 一些研究發(fā)現(xiàn)芥菜型油菜具有富集土壤重金屬的特性。目前，推廣的芥菜型油菜多為常規(guī) 品種，雜交品種由于不育系、恢復系選育困難不宜實現(xiàn)三系配套。
[0003] 芥菜型油菜新品種選育，首先是選育新的自交系或遺傳穩(wěn)定的純合株系一純合系 (自交系），如這些純合株系在抗性、產(chǎn)量、品質(zhì)等要求上滿足生產(chǎn)需要，通過區(qū)域試驗最后 審定為新的芥菜型油菜新品種(常規(guī)品種）。其次，純合株系與不育系測交，判斷恢保關系， 如果是恢復系與不育系雜交測配新的雜交品種，如果是保持系與不育系測配，選育具有該 保持系特性的新的不育系，如果穩(wěn)定株系不恢不保(測配后代不能完全恢復育性或不能完 全保持高度不育），也不能形成生產(chǎn)上使用的常規(guī)品種，這樣的純合株系要么淘汰，要么與 其他保持系或恢復系雜交進入下一輪育種材料選育。正常情況下通過常規(guī)的人工雜交選育 一個常規(guī)芥菜型油菜品種需要6-7代的時間，如果選育雜交品種，需要培育穩(wěn)定的不育系、 保持系、恢復系，芥菜型油菜新品種選育時間更長，10-20年。常規(guī)芥菜型油菜新品系選育 是通過兩個或多個遺傳背景不同的品系雜交、聚合雜交或回交形成雜交內(nèi)代(或回交代， 根據(jù)目標性狀的選擇要求可進行多代回交形成BC2、BC3……等等），回交后代或Fi代自交 形成F 2代，F(xiàn)2代再選擇優(yōu)良單株自交形成F3代，F(xiàn)3再選單株自交，一直到F 6-F7代才能獲得穩(wěn) 定的油菜新品系，以1年1代計算，所花時間大概在7-8年的時間，通過異地加代也需要4年 左右的時間。
[0004]目前，在油菜中還未有誘導系或雙單倍體誘導系的報道。所謂"誘導系"是指，用該 植物作為父本用其花粉對同類植株授粉，能誘導同類植株(母本)產(chǎn)生相應的效應，如產(chǎn)生 單倍體、雙單倍體(DH系)等。在植物中運用誘導系進行新品種選育最多的是玉米，但玉米中 的誘導系也只是單倍體誘導系。最早出現(xiàn)的玉米單倍體誘導系為stock6,該誘導系只能誘 導玉米產(chǎn)生單倍體，然后單倍體植株再進行人工染色體加倍形成純合二倍體(雙單倍體）， 且誘導效率較低，一般誘導效率在10%以下（以收獲種子中獲得單倍體數(shù)計算）。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的目的為了提供一種能快速、有效，只需3代(2年或3年)獲得穩(wěn)定純合的芥菜型 油菜株系，提高芥菜型油菜選育新材料、常規(guī)油菜品種、以及雜種優(yōu)勢利用的效率，使芥菜 型油菜雜交育種更為便捷高效的油菜雙單倍體選育芥菜型油菜品種及材料的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是這樣來實現(xiàn)的： 本發(fā)明油菜雙單倍體誘導系選育芥菜型油菜品種及材料的方法，包括如下步驟： 1) 確定芥菜型油菜品種選育的目標性狀要求，如高含油、抗倒伏、抗低溫、黃籽，早熟、 耐貧瘠、高富集重金屬等性狀，將至少2個具有目標性狀的芥菜型油菜與其他芥菜型油菜雜 交或聚合雜交，根據(jù)目標性狀要求進行回交或多代回交，形成回交后代； 2) 對上述步驟1)中雜交后代、聚合雜交后代或回交后代，在花期，對花蕾進行人工去 雄，并套袋隔離； 3) 用油菜雙單倍體誘導系花粉對上述步驟2)中去雄后2-4天植株進行人工授粉，并套 袋隔離，收獲其誘導后代種子； 4) 對上述步驟3)中獲得誘導后代種子進行單株種植，苗期利用流式細胞儀鑒定倍性， 淘汰多倍體、單倍體或具有油菜雙單倍體誘導系顯性性狀特征植株，選擇正常育性、外型像 芥菜型油菜的四倍體植株，單株套袋自交； 5) 上述步驟4)中單株自交種子進行株系種植，調(diào)查株系形態(tài)一致性，并通過分子標記 (SSR或SRAP)鑒定株系一致性及穩(wěn)定性； 6) 上述步驟5)中穩(wěn)定株系進行產(chǎn)量潛力、抗性、品質(zhì)性狀鑒定，產(chǎn)量、品質(zhì)性狀、抗性達 到生產(chǎn)需求的穩(wěn)定株系，形成芥菜型油菜常規(guī)品種。
[0007] 7)上述步驟5)中形成的新品系與芥菜型油菜細胞質(zhì)不育系或細胞核不育系測交， 根據(jù)測交后代的育性，測交后代全可育其測交父本為恢復系，測交后代全不育其測交父本 為保持系； 8)上述步驟7)中確定測交父本為恢復系與對應不育系統(tǒng)的不育系測配，選育芥菜型油 菜雜交組合或品種;上述步驟7)中確定測交父本為保持系與對應不育系統(tǒng)的不育系多代回 交，選育與該保持系基因型一致的新芥菜型油菜不育系； 采用本發(fā)明方法獲得芥菜型油菜穩(wěn)定遺傳后代借助了油菜雙單倍體誘導系能誘導母 體植株在發(fā)生孤雌生殖，在F2R形成穩(wěn)定的雙單倍體個體，F(xiàn)3代進行穩(wěn)定性、一致性鑒 定，獲得穩(wěn)定遺傳后代； 上述步驟3)中油菜雙單倍體誘導系選育方法，包括如下步驟： (1) 選育具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系： ① 將兩個油菜親本材料雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導劑進行人工染色 體加倍獲得加倍后的Fi代植株； ② 加倍后的h代植株進行自交或強制自交獲得內(nèi)代，對F2代進行田間種植觀察，并鑒定 每個單株的育性，選擇可育后代自交獲得F3代，對F3代進行純合度鑒定，通過形態(tài)、細胞學以 及分子標記鑒定，對后代DNA進行聚合酶鏈反應擴增，電泳觀察每個特異引物擴增下單株的 DNA帶型及條帶數(shù)目，顯示每個單株都是兩個親本的雜交后代，每個單株之間分子標記圖譜 一致，說明這些單株是純合系---早代穩(wěn)定系； ③ 獲得的早代穩(wěn)定系與至少10個油菜常規(guī)純合穩(wěn)定系進行正反交，F(xiàn)i代、F2R鑒定早 代穩(wěn)定系的遺傳特性，即是否有孤雌生殖特性;上述正反交，如有Fi分離，^代出現(xiàn)部分穩(wěn)定 株系，對應的早代穩(wěn)定系是具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系； (2) 選育攜帶顯性遺傳性狀、具有孤雌遺傳特性且倍性遺傳穩(wěn)定的多倍體油菜： ① 具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交(如顯性矮桿、紫葉、 花葉、黃葉、高芥酸等性狀），得到雜交?:代種子。上述雜交Fi#子在培養(yǎng)基上用染色體加倍 誘導劑進行人工染色體加倍，得到加倍后的帶顯性性狀的^值株； ② 對加倍的帶顯性性狀的Fi植株，通過顯微觀察或流式細胞儀進行染色體倍性鑒定， 選擇帶顯性性狀的多倍體的h代植株，淘汰非正常加倍株、非整倍體植株、以及不帶顯性性 狀加倍植株;帶顯性性狀的多倍體Fi代植株主要是倍性遺傳穩(wěn)定、結實性好、具有孤雌生殖 遺傳特性、帶顯性性狀(如顯性矮桿、紫葉、花葉、黃葉、高芥酸等性狀)的六倍體或八倍體油 菜植株； (3)油菜雙單倍體誘導系鑒定及誘導能力測定： ① 倍性遺傳穩(wěn)定、具有孤雌生殖遺傳特性、帶顯性性狀的多倍體植株中的顯性性狀能 去除測交后代中產(chǎn)生的雜交株，如果測交后代中出現(xiàn)顯性性狀植株、或非整倍體植株，說明 該植株是多倍體植株和母本雜交產(chǎn)生的，去除該植株； ② 上述單株測交后代如果出現(xiàn)全不育、為正常倍性(二倍體或四倍體)油菜、且不帶顯 性性狀，說明該測交后代對應的父本基因未進入測交后代中，顯性多倍體植株為油菜雙單 倍體誘導系。
[0008]上述方法中獲得油菜雙單倍體誘導系是將兩個親本材料雜交FHt種子或具有孤 雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交得到的雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上 用染色體加倍誘導劑進行人工染色體加倍，具體方法如下： 1) 用純度為75%酒精進行種子表面消毒25-40秒，用0.1%升汞消毒12-17分鐘，然后用 無菌水將種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在 第一培養(yǎng)基上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度23-25%，白天光照12-16小時， 光照強度2000-3000勒克斯，夜晚暗培養(yǎng)8-12小時，待植株長到1 一2片真葉時，從下胚軸 處剪下植株繼續(xù)在第二培養(yǎng)基上生長； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側芽分化后，將側芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫煉苗3-7天，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基用自來水沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15-30分鐘后移栽到溫室中，溫室 溫度16 QC-25QC，相對濕度60-80%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： -MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤 0.5-1.5mg 染色體加倍誘導劑 30-70mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤 0.5-lmg 染色體加倍誘導劑 20-40mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α一蔡乙酸 0.03-0.5mg 染色體加倍誘導劑 5-20mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的浸泡緩沖液由以及下配比的組分組成： 水 1L 易?；蚩寺?0.6-1.2g α一萘乙酸 0.5-lmg。
[0009] 油菜雙單倍體誘導系能直接誘導油菜產(chǎn)生雙單倍體后代，無需進行人工染色體加 倍來獲得純合系;且誘導效率高，最高可達1〇〇%，一般的誘導效率都在50%以上。雙單倍體誘 導系誘導母體植株產(chǎn)生雙單倍體的主要原理是:誘導系能誘導母體植株，大孢子生殖細胞 (卵細胞)產(chǎn)生孤雌生殖效應，且卵細胞能進行染色體加倍，即卵細胞孤雌生殖產(chǎn)生的后代 就雙單倍體。本發(fā)明是油菜雙單倍體誘導系選育芥菜型油菜新材料及品種的方法，對芥菜 型油菜品種選育、育種材料、育種資源創(chuàng)新具有積極的促進作用。該專利方法可以快速(3 代）、高效獲得育種上有應用價值的芥菜型油菜材料及常規(guī)品種，對芥菜型油菜開展雜交品 種選育也具有積極的促進作用。
[0010] 上述的染色體加倍誘導劑采用秋水仙素、氟樂靈、氨磺樂靈中的至少一種。
[0011] 以上描述的方法可以快速用于芥菜型油菜新材料及品種選育，特別是芥菜型油菜 恢復系、保持系材料的快速選育，以及芥菜型油菜常規(guī)品種的快速選育。可以在2年或3代的 時間內(nèi)獲得上述材料或品種，大大節(jié)約芥菜型油菜的育種時間，提高育種效率。
[0012] 上述油菜雙單倍體誘導系(六倍體或八倍體植株)的基本原理是:誘導系具有孤雌 生殖誘導基因，誘導系作父本時，誘導系染色體(或基因）沒有與母體植株染色體融合，而是 誘導母體植株（g卩卵細胞)產(chǎn)生孤雌生殖效應，且母體植株卵細胞染色體自身加倍形成雙單 倍體。
[0013]本發(fā)明具有以下優(yōu)點： 1、該方法可快速(2年或3代)選育芥菜型油菜雜交種親本材料(恢復系、保持系），極大 地提高了芥菜型油菜雜交品種選育速度和效率。
[0014] 2、該方法可快速(2年或3代)選育芥菜型油菜常規(guī)品種，極大地提高了芥菜型油菜 品種選育速度和效率。
[0015] 3、該方法可運用于芥菜型油菜，特別是雜交品種選育的不同雜種優(yōu)勢利用途徑。 芥菜型油菜細胞質(zhì)不育系統(tǒng)(CMS)，芥菜型油菜核不育系統(tǒng)(GMS)均可應用。
[0016] 4、油菜雙單倍體誘導系直接誘導母體植株產(chǎn)生雙單倍體，無需進行人工染色體加 倍，可一步形成穩(wěn)定后代。
[0017]【附圖說明】： 圖1為利用油菜雙單倍體誘導系選育芥菜型油菜品種及材料流程圖。
[0018] 圖2為油菜雙單倍體誘導系選育流程圖。
[0019] 圖3為獲得油菜早代穩(wěn)定系的方法流程圖。
[0020] 圖4為油菜雙單倍體誘導系Y3560選育流程圖。
[0021]圖5為油菜雙單倍體誘導系Y4958的選育流程圖。
[0022] 圖6為油菜早代穩(wěn)定系P3-2選育流程圖。
[0023] 圖7為芥菜型油菜新品系GS-5的選育流程圖。
[0024]圖8為芥菜型油菜新品系GZ-8的選育流程圖。
[0025] 圖9為P3-2四倍體油菜根尖染色體倍性鑒定圖。
[0026] 圖10為P3-2四倍體油菜流式細胞倍性鑒定圖。
[0027]圖11為為Y3560流式細胞倍性鑒定圖。
[0028]圖12為Y4958流式細胞倍性鑒定圖。
[0029]【具體實施方式】： 實施例1: 參見圖1、圖2、圖5、圖7,芥菜型油菜狗尾巴GW(四川山區(qū)地方品種，四倍體，2n = 36)具 有黃籽、抗病、抗倒、含油率高(45%)、植株緊湊、耐土壤貧瘠等特性，但植株高(2.5米以上）， 熟期較晚；另外一個芥菜型油菜掃把芥SBJ(成都金堂地方品種，四倍體，2n = 36)具有生育 期短、早熟、分枝多、株高較矮（150cm左右）、耐土壤貧瘠等特點，但含有率低(35-38%)，褐 色籽粒、株體纖細蓬松不緊湊。為了選育株型更好、植株高度適中（160-170cm)、黃籽粒、生 育期短、早熟、高含油、耐土壤貧瘠芥菜性油菜品系，將上述兩個地方品種去雄雜交，F(xiàn)Hf 花期剝蕾去雄，用本
【申請人】獲得的油菜雙單倍體誘導系Y4958作父本進行授粉誘導，F(xiàn) 2R (誘導后代)單株種植，并進行流式細胞檢測、選育性正常、倍性（四倍體)正常、無誘導系顯 性性狀(花葉）植株套袋自交，F(xiàn) 3代按株系種植，鑒定株系內(nèi)性狀一致性和穩(wěn)定性，選育出 一個遺傳穩(wěn)定、含油率45%、株高165cm、熟期較早、黃籽粒、分枝多而2緊湊的芥菜型油菜新 品系GS-5。
[0030] 上述油菜雙單倍體誘導系是通過以下方法獲得的： 參見圖2、圖4、圖9、圖10、圖11，由本
【申請人】獲得的甘藍型油菜四倍體早代穩(wěn)定系P3- 2，與20個純合甘藍型四倍體油菜正反交，3個正反交^代出現(xiàn)分離，且這3個組合^代出現(xiàn)穩(wěn) 定株系，說明P3-2具有孤雌生殖遺傳特性。用P3-2與高芥酸、矮桿油菜4247正反交(矮桿、 高芥酸為顯性性狀），然后將雜交FiR種子進行染色體加倍，加倍后代用流式細胞儀鑒定或 根尖顯微鏡觀察鑒定為顯示矮桿八倍體植株，該植株定名為Y3560。
[0031] 參見圖2、圖5、圖9、圖10、圖12,由本
【申請人】獲得的甘藍型油菜四倍體早代穩(wěn)定系 P3-2，與20個純合甘藍型四倍體油菜正反交，3個正反交^代出現(xiàn)分離，且這3個組合F 2代出 現(xiàn)穩(wěn)定株系，說明P3-2具有孤雌生殖遺傳特性。用P3-2與白菜型花葉油菜08nl雜交(花葉 為顯性性狀），然后將雜交^代種子進行染色體加倍，加倍后代用流式細胞儀鑒定或根尖顯 微鏡觀察鑒定為顯示矮桿六倍體植株，該植株定名為Y4958。
[0032]本實施例中將P3-2與矮桿、高芥酸油菜4247雜交F!以及P3-2與白菜型花葉油菜 08nl雜交F :種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進行人工染色體加倍的具體方法如下： 1) 用純度為75%酒精進行種子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分鐘，然后用無菌水將 種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第一培養(yǎng) 基(染色體加倍誘導培養(yǎng)基)上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度250C，白天光照16小時，光照強度 2000勒克斯，晚上暗培養(yǎng)8小時，待長到1 一2片真葉時，將植株從下胚軸剪下繼續(xù)在第二培 養(yǎng)基上生長； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側芽分化后，將側芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基）中進行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫煉苗3天后，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15分鐘后移栽到溫室中，溫室溫度250C，相對 濕度60%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： -MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤(6BA) 0.5mg 秋水仙素 50mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， MS培養(yǎng)基由Murashige和Skoog發(fā)明，簡寫為MS，其配方參見附表1， 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤(6BA) 0.5mg 秋水仙素 30mg 鹿糖 30g 瓊脂 8g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α-萘乙酸 0.03mg 秋水仙素 20mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的浸泡緩沖液由以下配比的組分組成： 水 1L 易?；蚩寺?〇.6g α -萘乙酸 0.5mg。
[0033]參見圖2、圖4、圖11，用Y3560作父本，與甘藍型油菜細胞質(zhì)不育系(0464A)測交，測 交后代80株，全為高桿，且76為四倍體油菜、2株為二倍體、2株為八倍體;其中76株四倍體植 株為全不育，4株半不育，且形態(tài)特征與0464A完全相同。同時用P3-2與矮桿、高芥酸油菜 4247雜交F!(非加倍株）做父本與0464A測交作為對照驗證，測交后代153株，出現(xiàn)矮桿102 株、高桿51株、且育性分離較大，出現(xiàn)全可育65株、半不育35株、全不育53株。說明Y3560中的 基因并未進入測交株，測交后代為0464A孤雌生殖而來，誘導率95%。
[0034]用Y3560做父本與白菜型油菜雅安黃油菜YH(二倍體油菜，2n = 20)去雄雜交，獲得 雜交Fi植株145株，143株?1形態(tài)與YH完全相同，且每個單株自交后F2代形態(tài)都為二倍體、外 形與YH-致，說明Y3560與YH雜交過程，誘導YH發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的Fi為孤雌生殖自 交，且與YH形態(tài)完全相同，該誘導率98.6%。
[0035]同樣用Y3560做父本與芥菜型油菜GW(四倍體油菜，2n = 36)去雄雜交，獲得雜交F! 植株124株，123株?1形態(tài)與GW完全相同，且每個單株自交后F2代形態(tài)都為四倍體、外形與YH 一致，說明Y3560與GW雜交過程，誘導GW發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的^為孤雌生殖自交，且與 GW形態(tài)完全相同，該誘導率99.2%。最終，顯性矮桿八倍體植株Y3560確定為油菜雙單倍體誘 導系。
[0036]參加圖2、圖5、圖12,用Y4958作父本，與甘藍型油菜細胞質(zhì)不育系(0068A)測交，測 交后代112株，全為高桿，且全為四倍體油菜，其中108株為全不育，4株半不育，且形態(tài)特征 與0068A完全相同。同時用P3-2與白菜型花葉油菜08nl雜交F!(非加倍株)做父本與0068A 測交作為對照驗證，測交后代89株，出現(xiàn)常葉植株59株、花葉植株30株、且育性分尚較大，出 現(xiàn)全可育45株、半不育20株、全不育24株。說明Y4958中的基因并未進入測交株，測交后代為 0068A孤雌生殖而來，誘導率96.4%。
[0037]用Y4958做父本與白菜型油菜雅安黃油菜YH(二倍體油菜，2n = 20)去雄雜交，獲得 雜交Fi植株88株，88株?1形態(tài)與YH完全相同，且每個單株自交后F2代形態(tài)都為二倍體、外形 與YH-致，說明Y4959與YH雜交過程，誘導YH發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的h為孤雌生殖自交， 且與YH形態(tài)完全相同，該誘導率100%。
[0038]用Y4958做父本與芥菜型油菜GW(四倍體油菜，2n = 36)去雄雜交，獲得雜交F!植株 75株，75株&形態(tài)與GW完全相同，且每個單株自交后F2代形態(tài)都為四倍體、外形與GW-致，說 明Y4958與GW雜交過程，誘導GW發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的FiS孤雌生殖自交，且與GW形態(tài) 完全相同，該誘導率100%。
[0039]同樣Y4958做父本與核不育G MS不育系3306測交，測交后代159株，且全為四倍 體油菜，其中108株為全不育，4株半不育，且形態(tài)特征與0068A完全相同。同時用P3-2與白 菜型花葉油菜08nl雜交h(非加倍株)做父本與0068A測交作為對照驗證，測交后代89株，出 現(xiàn)常葉植株59株、花葉植株30株、且育性分尚較大，出現(xiàn)全可育45株、半不育20株、全不育24 株。說明Y4958中的基因并未進入測交株，測交后代為0068A孤雌生殖而來，誘導率96.4%。 [0040]最終，顯性花葉六倍體植株Y4958確定為油菜雙單倍體誘導系。
[0041 ] 參見圖3、圖6、圖9、圖10,獲得早代穩(wěn)定系P3-2方法如下： 甘藍型油菜F009(四倍體，染色體2n=38)與白菜型油菜YH(二倍體，雅安黃油菜，染色體 2n=20)剝蕾進行人工去雄雜交獲得h代雜交種子。^代雜交種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進 行人工染色體加倍。對加倍后的FHf植株進行自交(或強制自交)獲得^代，對F 2代進行田間 種植觀察、育性鑒定即通過醋酸洋紅對花粉染色，判斷花粉育性，出現(xiàn)三種情況（1、單倍體 植株，花粉極少，且育性極低；2、多倍體植株完全不育，花器官發(fā)育受阻，不能正常的開花， 無花粉;3、正?？捎闹仓?，花粉量多，花粉育性95%以上）。對?2代正常可育單株進行自交 獲得F3代。對F3代進行純合度鑒定，種植F3代單株株系，32%的可育株系單株植株整齊一致， 開花結實正常。對整齊一致株系進行細胞學鑒定，染色體條數(shù)一致(38條），染色體形態(tài)未出 現(xiàn)異常。SSR分子標記，通過DNA聚合酶鏈反應，電泳觀察每個特異引物擴增下單株DNA帶型， 顯示每個單株都是H)09與YH的雜交后代，且每個單株DNA擴增條帶數(shù)目及帶型一致，可以判 斷這些株系為純合系，即早代穩(wěn)定系。將其中1個葉片較大、無裂葉、葉片著生緊湊、含油率 55%的甘藍型(染色體38條)油菜早代穩(wěn)定系定名為P3-2。
[0042] 本實施例中將F1代雜交種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進行人工染色體加倍的具體 方法如下： 1) 用純度為75%酒精進行種子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分鐘，然后用無菌水將 種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第一培養(yǎng) 基(染色體加倍誘導培養(yǎng)基)上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度250C，白天光照16小時，光照強度 2000勒克斯，晚上暗培養(yǎng)8小時，待長到1 一2片真葉時，將植株從下胚軸剪下繼續(xù)在第二培 養(yǎng)基上生長； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側芽分化后，將側芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基）中進行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫煉苗3天后，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15分鐘后移栽到溫室中，溫室溫度250C，相對 濕度60%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： -MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤(6B A) 0.5mg 秋水仙素 30mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， MS培養(yǎng)基由Murashige和Skoog發(fā)明，簡寫為MS，其配方參見附表1。
[0043] 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤(6BA) 0.5mg 秋水仙素 20mg 鹿糖 30g 瓊脂 8g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α-萘乙酸 0.03mg 秋水仙素 5mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的浸泡緩沖液由以下配比的組分組成： 水 1L 易?；蚩寺?〇.6g α -萘乙酸 0.5mg。
[0044]附表1 MS培養(yǎng)基成分配方
實施例2: 參見圖1、圖2、圖4、圖8,紫色芥菜型油菜ZJ，葉片紫色(具有很強的觀賞性），但生育 期長，植株高240CM左右，種皮褐色，生產(chǎn)上除了觀賞產(chǎn)量性狀較差。芥菜型油菜掃把芥SBJ (成都金堂地方品種，四倍體，2n = 36)具有生育期短、早熟、分枝多、株高較矮（150cm左右）、 耐土壤貧瘠等特點，具有較好的農(nóng)藝經(jīng)濟性狀。為了選育株型更好、植株高度適中（160- 180cm)、生育期短、早熟、耐土壤貧瘠紫色葉片芥菜性油菜品系，將上述兩個地方品種去雄 雜交，F(xiàn)Hf花期剝蕾去雄，用本
【申請人】獲得的油菜雙單倍體誘導系Y3560作父本進行授粉 誘導，卩 2代(誘導后代)單株種植，并進行流式細胞檢測、選育性正常、倍性（四倍體)正常、無 誘導系顯性性狀(矮桿)植株套袋自交，F(xiàn) 3代按株系種植，鑒定株系內(nèi)性狀一致性和穩(wěn)定 性，選育出一個遺傳穩(wěn)定、含油率40%、株高168cm左右、熟期較早、分枝多而且緊湊的紫色葉 片芥菜型油菜新品系GZ-8。
[0045] 本實施例2中油菜雙單倍體誘導系選育方法同實施例1。
[0046] 本發(fā)明能快速選育芥菜型油菜常規(guī)品種或雜交育種新材料，特別是對芥菜型油菜 恢復系、保持系的選育中具有巨大的應用潛力，最快3代(2年），獲得遺傳穩(wěn)定的芥菜型油菜 細胞質(zhì)不育CMS恢復系和保持系，可4代(2-4年)形成芥菜型雜交油菜新組合(新品種），也 可最快3代獲得芥菜型油菜核不育GMS恢復系。本發(fā)明也能快速選育芥菜型油菜常規(guī)品種，3 代選育具有生產(chǎn)潛力的常規(guī)芥菜型油菜品種。
[0047]上述實施例是對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步說明，但不應將此理解為本發(fā)明上述 主題的范圍僅限于上述實施例。凡基于上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的額范圍。
【主權項】
1.油菜雙單倍體誘導系選育芥菜型油菜品種及材料的方法，包括以下步驟： 1) 確定芥菜型油菜品種選育的目標性狀要求，將至少2個具有目標性狀的芥菜型油菜 與其他芥菜型油菜雜交或聚合雜交，根據(jù)目標性狀要求進行回交或多代回交，形成回交后 代； 2) 對上述步驟1)中雜交后代、聚合雜交后代或回交后代，在花期，對花蕾進行人工去 雄，并套袋隔離； 3) 用油菜雙單倍體誘導系花粉對上述步驟2)中去雄后2-4天植株進行人工授粉，并套 袋隔離，收獲其誘導后代種子； 4) 對上述步驟3)中獲得誘導后代種子進行單株種植，苗期利用流式細胞儀鑒定倍性， 淘汰多倍體、單倍體或具有油菜雙單倍體誘導系顯性性狀特征植株，選擇正常育性、外型像 芥菜型油菜的四倍體植株，單株套袋自交； 5) 上述步驟4)中單株自交種子進行株系種植，調(diào)查株系形態(tài)一致性，并通過分子標記 鑒定株系一致性及穩(wěn)定性； 6) 上述步驟5)中穩(wěn)定株系進行產(chǎn)量潛力、抗性、品質(zhì)性狀鑒定，產(chǎn)量、品質(zhì)性狀、抗性達 到生產(chǎn)需求的穩(wěn)定株系，形成芥菜型油菜常規(guī)品種； 7) 上述步驟5)中形成的新品系與芥菜型油菜細胞質(zhì)不育系或細胞核不育系測交，根據(jù) 測交后代的育性，測交后代全可育其測交父本為恢復系，測交后代全不育其測交父本為保 持系； 8) 上述步驟7)中確定測交父本為恢復系與對應不育系統(tǒng)的不育系測配，選育芥菜型油 菜雜交組合或品種;上述步驟7)中確定測交父本為保持系與對應不育系統(tǒng)的不育系多代回 交，選育與該保持系基因型一致的新芥菜型油菜不育系； 上述步驟3 )中油菜雙單倍體誘導系選育方法，包括如下步驟： (1) 選育具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系： ① 將兩個油菜親本材料雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導劑進行人工染色體 加倍獲得加倍后的Fi代植株； ② 加倍后的Fi代植株進行自交或強制自交獲得內(nèi)代，對F2代進行田間種植觀察，并鑒定 每個單株的育性，選擇可育后代自交獲得F3代，對F3代進行純合度鑒定，通過形態(tài)、細胞學以 及分子標記鑒定，對后代DNA進行聚合酶鏈反應擴增，電泳觀察每個特異引物擴增下單株的 DNA帶型及條帶數(shù)目，顯示每個單株都是兩個親本的雜交后代，每個單株之間分子標記圖譜 一致，說明這些單株是純合系---早代穩(wěn)定系； ③ 獲得的早代穩(wěn)定系與至少10個油菜常規(guī)純合穩(wěn)定系進行正反交，F(xiàn)i代、F2代鑒定早代 穩(wěn)定系的遺傳特性，即是否有孤雌生殖特性;上述正反交，如有Fi分離，F(xiàn) 2代出現(xiàn)部分穩(wěn)定株 系，對應的早代穩(wěn)定系是具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系； (2) 選育攜帶顯性遺傳性狀、具有孤雌遺傳特性且倍性遺傳穩(wěn)定的多倍體油菜： ① 具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交得到雜交FHf種子， 雜交^種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導劑進行人工染色體加倍，得到加倍后的帶顯性性 狀的Fi代植株； ② 對加倍的帶顯性性狀的Fi代植株，通過顯微觀察或流式細胞儀進行染色體倍性鑒定， 選擇帶顯性性狀的多倍體的Fi代植株，淘汰非正常加倍株、非整倍體植株、以及不帶顯性性 狀加倍植株;帶顯性性狀的多倍體的^代植株是倍性遺傳穩(wěn)定、結實性好、具有孤雌生殖遺 傳特性、帶顯性性狀的六倍體或八倍體油菜植株； 油菜雙單倍體誘導系鑒定及誘導能力測定： ① 倍性遺傳穩(wěn)定、具有孤雌生殖遺傳特性、帶顯性性狀的多倍體植株中的顯性性狀能 去除測交后代中產(chǎn)生的雜交株，如果測交后代中出現(xiàn)顯性性狀植株、或非整倍體植株，說明 該植株是多倍體植株和母本雜交產(chǎn)生的，去除該植株； ② 上述單株測交后代如果出現(xiàn)全不育、為正常倍性即二倍體或四倍體油菜、且不帶顯 性性狀，說明該測交后代對應的父本基因未進入測交后代中，顯性多倍體植株為油菜雙單 倍體誘導系。2.如權利要求1所述的中油菜雙單倍體誘導系選育芥菜型油菜品種及材料的方法，其 特征在于在于油菜雙單倍體誘導系選育是將兩個親本材料雜交FHf種子或具有孤雌生殖 遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交得到的雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色 體加倍誘導劑進行人工染色體加倍，具體方法如下： 1) 用純度為75%酒精進行種子表面消毒25-40秒，用0.1%升汞消毒12-17分鐘，然后用 無菌水將種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在 第一培養(yǎng)基上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度23-25叱，白天光照12-16小時，光 照強度2000-3000勒克斯，夜晚暗培養(yǎng)8-12小時，待植株長到1 一2片真葉時，從下胚軸處 剪下植株繼續(xù)在第二培養(yǎng)基上生長； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側芽分化后，將側芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫煉苗3-7天，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基用自來水沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15-30分鐘后移栽到溫室中，溫室 溫度16 QC-25QC，相對濕度60-80%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： -MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤 0.5-1.5mg 染色體加倍誘導劑 30-70mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6-芐基腺嘌呤 0.5-lmg 染色體加倍誘導劑 20-40mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L a一蔡乙酸 0.03-0.5mg 染色體加倍誘導劑 5-20mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的浸泡緩沖液由以及下配比的組分組成： 水 1L 易保或克露 0.6-1.2g a一萘乙酸 0.5-lmg〇3.如權利要求1或2所述的油菜雙單倍體誘導系選育芥菜型油菜品種及材料的方法，其 特征在于染色體加倍誘導劑采用秋水仙素、氟樂靈、氨磺樂靈中的至少一種。
【文檔編號】A01H1/02GK106035068SQ201610458263
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】付紹紅, 楊進, 王繼勝, 李云, 鄒瓊, 陶蘭蓉, 康澤明, 唐蓉
【申請人】成都市農(nóng)林科學院