一種用于防治煙草細菌病害的復合菌劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于防治煙草細菌病害的復合菌劑，該菌劑由生防細菌A和生防細菌B按照1～2:1～2的體積比混合而成，其中：生防細菌A的保藏編號為CGMCC No.10603，生防細菌B的保藏編號為CGMCC No.11541。本發(fā)明復合菌劑中的生防細菌A和B是共生的，可以同時穩(wěn)定的存在于復合菌劑中，不僅對煙草病害的生物防控提供技術保障，同時能夠有效的減少化學農藥使用量，對環(huán)境具有保護作用。應用本發(fā)明提供的復合菌劑可以有效地抑制煙草野火病和角斑病菌的生長，野火病的抑菌圈可達25mm，角斑病的抑菌圈可達28mm。CGMCC No. 1060320150311CGMCC No. 1154120151021
【專利說明】
一種用于防治煙草細菌病害的復合菌劑
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種可以兼防煙草野火病和角斑病的復合菌劑。
【背景技術】
[0002] 近年來，煙草的病蟲害危害日益嚴重，野火病和角斑病是煙草的主要細菌病害，不 僅發(fā)生時期早，發(fā)生面廣，而且由于天氣原因時常相伴發(fā)生，嚴重危害煙株葉片，影響煙葉 質量，已造成巨大的經(jīng)濟損失。生物防治具有無污染、無公害且長效等優(yōu)點，由于針對煙草 野火病和角斑病的生防菌報道不多，致使能夠同時抑制這兩種病害的復合菌劑更是很少。
[0003] 目前常用的防治措施主要有：1、加強田間管理，促進煙株快速生長，使煙株節(jié)間 高，煙田空氣流通，光照充足，抗病力強。2、及時打底葉，減少菌源，增加光照。3、藥劑防治： 使用DT殺菌劑400倍液或鏈霉素200PPM進行葉面噴灑。這些方法不僅費時費力，而且傳統(tǒng)的 化學殺菌劑雖然可以適當控制煙草野火病和角斑病的危害，但卻易使病菌產(chǎn)生抗性，不利 于煙草病害的長久防治。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種用于防治煙草細菌病害的復合菌劑，該菌劑可以同時防 治煙草兩種病害，不但節(jié)省時間，而且抑菌效果明顯。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0006] -種用于防治煙草細菌病害的復合菌劑，由生防細菌A(CGMCC No. 10603)和生防 細菌B (CGMCC No. 11541)按照1~2:1~2的體積比混合而成。
[0007] 本發(fā)明中，所述生防細菌A的菌數(shù)為5.55 X 109個/mL，生防細菌B的菌數(shù)為6.95 X 109f/mL。
[0008] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0009] 1、復合菌劑中的生防細菌A和B是共生的，可以同時穩(wěn)定的存在于復合菌劑中，應 用本發(fā)明提供的復合菌劑可以有效地抑制煙草野火病和角斑病菌的生長，野火病的抑菌圈 可達25mm，角斑病的抑菌圈可達28_。
[0010] 2、本發(fā)明提供的復合菌劑不僅對煙草病害的生物防控提供技術保障，也對生物農 藥的發(fā)展起推動作用。同時能夠有效的減少化學農藥使用量，對環(huán)境具有保護作用。
[0011] 3、本發(fā)明屬于生物防治，具有無污染、無公害、長效等特點，在可持續(xù)農業(yè)模式中 占有十分重要的地位。
[0012] 保藏信息：
[0013] 生防細菌A:
[0014] 分類命名:枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis);
[0015] 保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
[0016] 保藏編號:CGMCC No.10603;
[0017]保藏日期：2015年3月11日；
[0018] 保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰路1號院3號。
[0019] 生防細菌B:
[0020] 分類命名：甲基營養(yǎng)型芽抱桿菌(Bacillus methylotrophicus);
[0021] 保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
[0022] 保藏編號：CGMCC No.11541;
[0023] 保藏日期：2015年10月21日；
[0024] 保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰路1號院3號。
【附圖說明】
[0025]圖1為生防細菌B的菌體形態(tài)；
[0026]圖2為生防細菌B的菌落形態(tài)；
[0027]圖3為生防細菌B的16s rRNA系統(tǒng)進化樹；
[0028]圖4為生防細菌B的gyrB基因系統(tǒng)進化樹；
[0029] 圖5為生防細菌B對煙草角斑病菌的抑制結果；
[0030] 圖6為不同配比的復合菌劑對野火病菌的抑菌作用；
[0031] 圖7為不同配比的復合菌劑對角斑病菌的抑菌作用。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合附圖對本發(fā)明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本 發(fā)明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋 在本發(fā)明的保護范圍中。
[0033] 本發(fā)明以煙草野火病和角斑病兩種病原菌為研究對象，分別篩選到相應的生防細 菌八(0610：如.10603)和生防細菌8(0610：如.11541) ;并將兩種生防細菌以不同比例進行 混合，研究復合菌劑的抑菌情況，找到最優(yōu)組合，最終確定了一種可以兼防煙草野火病和角 斑病的復合菌劑及最優(yōu)比例。具體內容如下：
[0034] 一、生防細菌B的篩選鑒定：
[0035] 生防細菌B為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)WSWGH-10,是從 黑龍江省鶴崗地區(qū)冬季凍土中分離篩選得到。篩選按以下方法進行:取5g凍土解凍后研碎， 放入含有50ml無菌水的三角瓶中，10°C震蕩3h，用無菌水稀釋至10- 7,分別取10-5、10-6和10一7 稀疏度的菌液0.1ml涂布在LB平板上，10°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3~7d，挑單菌落劃線轉接新 的LB平板，10°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3~7d。以大豆根腐病菌為指示菌，采用對峙培養(yǎng)方法篩 選生防菌株，即可獲得生防細菌B。
[0036]對菌株進行形態(tài)、培養(yǎng)特性和生理生化特性鑒定，具體步驟如下:將低溫培養(yǎng)24小 時的菌體進行革蘭氏染色后在400倍顯微鏡下觀察菌體大小;將菌液倍比稀釋后涂布在LB 培養(yǎng)基平板上，觀察菌落形態(tài)和顏色;將菌株進行氧化酶，接觸酶，葡萄糖發(fā)酵，V. P，M. R，淀 粉水解、尿素酶、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、吲哚產(chǎn)生、明膠液化和石蕊牛奶試驗，結果表 明該菌株為革蘭氏陽性好氧菌，桿狀，有芽孢，大小為0.2~0.5 X 1.0~1.5μηι(圖1);菌落白 色圓形，皺褶（圖2);能夠利用葡萄糖;氧化酶、接觸酶、M.R、明膠液化、淀粉水解、檸檬酸鹽 利用、硝酸鹽還原、吲哚產(chǎn)生和石蕊牛奶均為陽性，V.P和尿素酶陰性。生長溫度范圍6~30 °C，最適生長溫度20°C。
[0037] 對菌株進行16S rDNA序列分析和看家基因 gyrB分析:取lmL菌液離心收集菌體，用 細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN BI0TECH)提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，分別 以16SrDNA通用引物和芽孢桿菌gyrB基因通用引物進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝 膠電泳，將特異DNA條帶進行測序，在GenBank中進行同源序列比對，用Mega 5.0軟件構建系 統(tǒng)發(fā)育樹（圖3~4)，結果與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的16S rDNA序列和gyrB基因同源性為 99%，結合形態(tài)、培養(yǎng)特性和生理生化特性，鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus〇
[0038] 二、生防細菌B的抑菌譜測定：
[0039] 采用抑菌圈法測定菌株對引起煙草細菌性病害的病原菌(角斑病菌)的抑制情況， 取0. lml病原細菌涂布于LB平板上，在中心放滅菌鋼圈，在鋼圈中加入0.05ml生防菌液，10 °C培養(yǎng)7d，觀察有無抑菌圈，結果在鋼圈周圍有抑菌圈，說明生防細菌B能夠抑制該病原細 菌生長(圖5)。
[0040] 三、生防細菌A、B的培養(yǎng):挑取生防細菌菌株單菌落分別接于5mL試管中，于30°C、 170r/min振蕩器中培養(yǎng)70h。
[00411四、野火病與角斑病病原菌的培養(yǎng):將病原菌以2%的接種量分別取100yL接于5mL LB試管中，30°C、170r/min振蕩器中培養(yǎng)16h。
[0042] 五、復合菌劑制備及抑菌實驗:兩種生防菌液按1:1、2:1、1:2的比例進行混合備 用。分別取l〇〇yL病原菌菌液均勻涂滿于LB培養(yǎng)基平板上，然后取滅菌后的牛津杯置于各平 板中，并在其中加入不同比例的混合菌液各l〇〇yL。設未加生防菌液的為對照，重復3次，于 30 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天對病原菌生長情況進行觀察，測量抑菌圈大小。
[0043] 六、結論:從表1、表2、圖6和圖7可以得出，無論是針對煙草野火病菌還是角斑病 菌，三種配比組合的抑菌作用均較強，其中生防細菌A、B以2:1配比而得的復合菌劑抑菌效 果最明顯，因此最優(yōu)比例為2:1。
[0044] 表1不同配比的復合菌劑對野火病菌的抑菌作用：（抑菌圈大小單位:mm)
[0045]
[0046] 表2不同配比的復合菌劑對角斑病菌的抑菌作用：（抑菌圈大小單位:mm)
[0047]
【主權項】
1. 一種用于防治煙草細菌病害的復合菌劑，其特征在于所述復合菌劑由生防細菌A和 生防細菌B按照1~2 : 1~2的體積比混合而成，其中：生防細菌A的保藏編號為C G M C C No. 10603，生防細菌Β的保藏編號為CGMCC No. 11541。2. 根據(jù)權利要求1所述的用于防治煙草細菌病害的復合菌劑，其特征在于所述生防細 菌A和生防細菌B的體積比為1:1。3. 根據(jù)權利要求1所述的用于防治煙草細菌病害的復合菌劑，其特征在于所述生防細 菌A和生防細菌B的體積比為2:1。4. 根據(jù)權利要求1所述的用于防治煙草細菌病害的復合菌劑，其特征在于所述生防細 菌A和生防細菌B的體積比為1: 2。5. 根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的用于防治煙草細菌病害的復合菌劑，其特征在于所述 生防細菌A的菌數(shù)為5.55 X 109個/mL。6. 根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的用于防治煙草細菌病害的復合菌劑，其特征在于所述 生防細菌B的菌數(shù)為6.95 X 109個/mL。
【文檔編號】A01P1/00GK106035378SQ201610317207
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】劉宇帥, 李晶, 張淑梅, 曹旭, 胡基華, 姜威, 孟利強, 陳靜宇
【申請人】黑龍江省科學院微生物研究所