一種羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法，包括如下步驟：S1、無(wú)菌基體的預(yù)處理：選擇羌活萌發(fā)的根芽，經(jīng)滅菌、消毒處理，得到無(wú)菌基體；S2、簇生芽培養(yǎng)：將無(wú)菌基體接種到初增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行第一階段培養(yǎng)；再接種到繼代增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，從而在根芽切口出培育出簇生芽；S3、簇生苗培養(yǎng)：將簇生芽接種于胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)簇生芽20?30天，得到簇生苗；S4、生根培養(yǎng)：將簇生苗仔細(xì)分株，并接種到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20?26天，得到根系完整的獨(dú)立羌活小苗。所述方法通過(guò)特定的培養(yǎng)步驟和特定技術(shù)特征的綜合選擇與協(xié)同促進(jìn)效果，可對(duì)羌活進(jìn)行快速繁殖，滿足大規(guī)模種植的需求，具有良好的應(yīng)用前景和潛力。
【專利說(shuō)明】
_種憲活的組織培養(yǎng)繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及羌活的一種繁殖方法，更具體而言，涉及一種羌活的組織培養(yǎng)繁殖方 法，屬于藥用植物繁殖領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 弟活（拉丁學(xué)名：Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang)，是一種傘形科、 羌活屬的藥物植物，是我國(guó)特有的名貴藥材。羌活屬于高寒植物，在我國(guó)主要分布在四川、 青海、甘肅和西藏等地的2500-3700米的高海拔區(qū)域，對(duì)于生長(zhǎng)環(huán)境有著嚴(yán)格的要求和依 賴。
[0003] 經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，羌活的根、莖中含有大量的藥學(xué)活性成分，主要為揮發(fā)油、香豆素 類化合物、糖類等化合物。很早以前，我國(guó)即使用羌活入藥，主要用來(lái)治療感冒、傷風(fēng)、頭疼、 風(fēng)濕、麻痹、關(guān)節(jié)酸疼、浮腫、各種瘡毒等，是一種較為名貴的中藥。
[0004] 正是有羌活的如此顯著藥物活性，對(duì)其需求量也越來(lái)越大，價(jià)格也日益上漲。但與 此相對(duì)應(yīng)的是，由于羌活的野生供應(yīng)量很小，導(dǎo)致一方面其供應(yīng)量嚴(yán)重落后于需求量，無(wú)法 滿足正常的需求;另一方面，由于價(jià)格的上漲，導(dǎo)致野生羌活資源遭到過(guò)度濫采，接近枯竭， 使羌活野生資源遭到嚴(yán)重的、難以恢復(fù)的破壞，使正常的自然環(huán)境和野生資源受到過(guò)度破 壞，難以正?；謴?fù)。
[0005] 正是基于人工繁殖、人種種植、保護(hù)野生資源等考慮，人們對(duì)于羌活的繁殖進(jìn)行了 大量的研究，取得了一定的成果。
[0006] 但另一個(gè)方面，羌活具有胚形態(tài)后熟特定和生理后熟特性，這導(dǎo)致人工繁殖和培 育具有極大的難度，存在發(fā)芽率低、重復(fù)性差等諸多缺陷。
[0007] 因此，采用羌活種子進(jìn)行培育和繁殖，雖然能夠在一定程度上縮短自然環(huán)境下的 后熟時(shí)間，但時(shí)間仍然較長(zhǎng)，對(duì)于滿足大規(guī)模終止仍存在困難。
[0008] 為了克服這些缺陷，人們對(duì)于羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法進(jìn)行了大量研究，并取得 了一定的成果，例如：
[0009] CN1918972B公開(kāi)了一種羌活組織培養(yǎng)繁殖方法，以羌活萌發(fā)的根芽為外植體，經(jīng) 消毒處理、接種誘導(dǎo)形成愈傷組織后，再經(jīng)愈傷組織增殖、芽誘導(dǎo)和根誘導(dǎo)，形成完整植株 小苗，將完整小苗移栽到育苗基質(zhì)中，長(zhǎng)成正常羌活植株，所用基本培養(yǎng)基均為以MS培養(yǎng)基 為基礎(chǔ)，輔以6-糠基腺嘌呤、6-芐基腺嘌呤、2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、蔗糖和活性炭等成 分;所述方法克服了羌活育苗周期太長(zhǎng)、繁殖系數(shù)低的問(wèn)題，可進(jìn)行工廠化快速育苗，以適 應(yīng)市場(chǎng)對(duì)羌活的需求。
[0010] CN102657085A公開(kāi)了一種寬葉羌活組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，該方法包括以下 步驟:1、外植體的選擇和消毒處理：以寬葉羌活的根芽為外植體，經(jīng)浸泡滅菌、沖洗，即得消 毒后的外植體單芽；2、外植體接種:將消毒后的外植體單芽接種在誘導(dǎo)芽分化培養(yǎng)基上形 成2-3個(gè)叢生芽;3、繼代增殖培養(yǎng):將2-3個(gè)叢生芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基上形成寬葉羌活 叢生苗;4、生根誘導(dǎo)：將寬葉羌活叢生苗分株后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成完整再生小 苗;5、育苗基質(zhì)消毒;6、植株移栽:將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗 后即長(zhǎng)成正常寬葉羌活植株。該方法克服了寬葉羌活育苗周期過(guò)長(zhǎng)、繁殖系數(shù)低的問(wèn)題，易 于操作、可進(jìn)行工廠化快速育苗。
[0011] CN102657087A公開(kāi)了一種羌活組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，該方法包括以下步 驟:1、外植體的選擇和消毒處理：以羌活的幼葉為外植體，經(jīng)浸泡滅菌、沖洗，即得消毒后的 外植體;2、外植體接種:將消毒后的外植體切塊，接種在形成愈傷組織;3、愈傷組織增殖:將 愈傷組織接種進(jìn)行增殖，形成致密的愈傷組織;4、愈傷組織的芽誘導(dǎo):將致密的愈傷組織接 種形成叢生羌活苗;5、生根誘導(dǎo)：將叢生羌活苗分株后接種培養(yǎng)，得完整再生小苗;6、育苗 基質(zhì)消毒;7、植株移栽:將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長(zhǎng)成正 常羌活植株。所述方法克服了羌活育苗周期過(guò)長(zhǎng)、繁殖系數(shù)低的問(wèn)題，易于操作、可進(jìn)行工 廠化快速育苗。
[0012] 如上所述，現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)了羌活的多種組織培養(yǎng)繁殖方法，但對(duì)于新型的組織 培養(yǎng)繁殖方法，仍存在繼續(xù)研究的必要和需求，這正是本發(fā)明得以完成的動(dòng)力所在和基礎(chǔ) 所倚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 為了尋求羌活的新型組織培養(yǎng)繁殖方法，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的深入研究，在付 出了創(chuàng)造性勞動(dòng)后，從而完成了本發(fā)明。
[0014] 具體而言，本發(fā)明涉及一種羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法，所述方法包括如下步驟：
[0015] S1:無(wú)菌基體的預(yù)處理
[0016] 選擇羌活萌發(fā)的根芽，并經(jīng)滅菌、消毒處理，得到無(wú)菌基體；
[0017] S2:簇生芽培養(yǎng)
[0018] 將所述無(wú)菌基體接種到初增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行第一階段培養(yǎng);然后再接種到繼代 增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，從而在根芽切口出培育出簇生芽；
[0019] S3:簇生苗培養(yǎng)
[0020] 將所述簇生芽接種于胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)簇生芽20-30天，從而得到簇生 苗；
[0021] S4:生根培養(yǎng)
[0022]將簇生苗仔細(xì)分株，并接種到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20-26天，得到根系完整的獨(dú)立 弟活小苗。
[0023] 在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，所述步驟S1具體如下：選擇羌活萌發(fā)的 嫩根芽，流水沖洗干凈，并剪成l-2cm長(zhǎng)的片段;將所述片段用質(zhì)量百分比濃度為75%的酒 精消毒20-30秒，然后浸泡于質(zhì)量百分比濃度為0.05%的高錳酸鉀水溶液中2-4分鐘，最后 撈出，用無(wú)菌水沖洗4-5次，得到無(wú)菌基體。
[0024] 在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，所述步驟S2具體如下：
[0025] S2-1:將所述無(wú)菌基體接種到初增殖培養(yǎng)基中，在溫度為16±2°C下，紫外光照射 1-2小時(shí)，然后以2000-25001UX的光照強(qiáng)度照射8-10小時(shí)，最后恢復(fù)暗期;如此循環(huán)處理15-20天，完成第一階段培養(yǎng)，得到初增殖基體；
[0026] S2-2:完成第一階段培養(yǎng)后，將初增殖基體接種到繼代增殖培養(yǎng)基中，將溫度升高 至25±1°C，并按照以一天為周期、以小時(shí)計(jì)的明期(L):暗期(D) = 13-17:7-ll交替進(jìn)行光 照和停止光照，光照時(shí)的光照強(qiáng)度為2900-31001UX;如此循環(huán)處理10-15天，完成第二階段 培養(yǎng)，得到簇生芽。
[0027] 在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，在所述步驟S2-1中，所述初增殖培養(yǎng)基 的pH值為5.5，且每1000ml所述初增殖培養(yǎng)基包含如下含量的各種組分:2，4，5-三氯苯氧乙 酸0.5mg、6-節(jié)氨基腺噪呤0.5-2mg、赤霉素 l-2mg、無(wú)機(jī)物混合液50ml、微量元素水溶液 20ml、鹽酸吡咳醇20_30mg、梓檬酸8-14mg、L_脯氨酸10_15mg、乙二醇5_9mg、鹿糖8_12mg和 瓊脂3_4g。
[0028] 其中，優(yōu)選6-芐氨基腺嘌呤與2,4,5_三氯苯氧乙酸的質(zhì)量比優(yōu)選為2-3:1，最優(yōu)選 為2.5:1。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，6-芐氨基腺嘌呤與2,4,5_三氯苯氧乙酸的比例關(guān)系能夠顯著影響最 后的組織培養(yǎng)結(jié)果，當(dāng)6-芐氨基腺嘌呤與2,4,5_三氯苯氧乙酸的質(zhì)量比為2.5:1時(shí)，能夠取 得最好的技術(shù)效果，這是令人意想不到的。
[0029]其中，所述無(wú)機(jī)物混合液是將 10g K2HP〇4 · 3H20、5g MgCl2、6g NaH2P〇4、2g NH4C1、 3g NH4N03、4g硼酸和3.5g KI加入到1000ml蒸餾水中攪拌溶解而得到的。從中量取50ml，即 為1000ml上述初增殖培養(yǎng)基中所包含的50ml無(wú)機(jī)物混合液。
[0030]其中，所述微量元素水溶液是將4g鉬酸鈉、2g硫酸鋅、3g硝酸銅、4g氯化鈣、2g氯化 鈷、7g氯化錳、5g氯化亞鐵、2g氯化鐵和3g氯化鋁溶解于1000ml蒸餾水中而得到的。從中量 取20ml，即為1000ml上述初增殖培養(yǎng)基中所包含的20ml微量元素水溶液。
[0031 ]其中，所述初增殖培養(yǎng)基例如可通過(guò)將上述各種組分加入到適量雙蒸水中進(jìn)行充 分混合，然后用雙蒸水定容并調(diào)節(jié)pH值為5.5而得到，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)具備的常規(guī)操 作能力，在此不再進(jìn)行詳細(xì)描述(其它的多個(gè)培養(yǎng)基的pH值也均是類似的調(diào)節(jié)而得到，這些 都是組織培養(yǎng)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)手段，不再進(jìn)行分別的詳細(xì)描述）。
[0032]在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，在所述步驟S2-1中，溫度為16±2°C，例 如可為 14°C、16°C 或 18°C。
[0033]在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，在所述步驟S2-1中，紫外光照射1-2小 時(shí)，例如可為1小時(shí)、1.5小時(shí)或2小時(shí)。
[0034]在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，在所述步驟S2-1中，光照強(qiáng)度為2000-25001ux，例如可為 20001ux、21001ux、22001ux、23001ux、24001uxS25001ux。
[0035] 在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，在所述步驟S2-1中，在2000-25001ux光 照強(qiáng)度下照射8-10小時(shí)，例如8小時(shí)、9小時(shí)或10小時(shí)。
[0036] 在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，在所述步驟S2-2中，所述繼代增殖培養(yǎng) 基是以1/21^培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加有維生素(：0.8-1.41^/1、瓊脂1-2 8/1、麥芽糖5-8g/L和復(fù)合生長(zhǎng)素0.4-0.8mg/L而得到的培養(yǎng)基，且其pH值為5.8。
[0037]其中，所述復(fù)合生長(zhǎng)素為質(zhì)量比3-5:1的6-氨基腺嘌呤與2,4_表油菜素內(nèi)酯的混 合物。
[0038]其中，所述1/2MS培養(yǎng)基為公知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，也即將常規(guī)的MS培養(yǎng)基中的大量元 素濃度減少一半后而得到的培養(yǎng)基(下同）。
[0039]在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，在所述步驟S2-2中，完成第一階段培養(yǎng) 后，將初增殖基體接種到繼代增殖培養(yǎng)基中，將溫度升高至25±1°C，例如升高至24°C、25°C 或 26°C。
[0040] 在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，在所述步驟S2-2中，按照以一天為周期， 以小時(shí)計(jì)的明期(L):暗期(D) = 13-17:7-11，例如可為13:11、14:10、15:9、16:8或17:7,最 優(yōu)選明期(L):暗期(D) = 15:9。
[0041] 在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，在所述步驟S2-2中，光照強(qiáng)度為2900-31001ux，例如可為 29001ux、30001ux 或 31001ux。
[0042] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)如此的兩個(gè)階段培養(yǎng)，尤其是步驟S2-1中的紫外光照射和步驟 S2-2中的升溫、明期(L)與暗期(D)的時(shí)間比以及特定復(fù)合生長(zhǎng)素等的使用和協(xié)同等，可以 取得優(yōu)異的技術(shù)效果。
[0043] 通過(guò)步驟S2的培養(yǎng)后，在根芽切口出可以誘導(dǎo)分化出簇生的淡黃色嫩芽，實(shí)現(xiàn)了 根芽組織的誘導(dǎo)增殖。
[0044] 在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，所述步驟S3中，每1000ml所述胚芽誘導(dǎo) 培養(yǎng)基包含如下含量的各種組分:異戊烯基腺嘌呤2_4mg、吲哚-3-丁酸3-3.5mg、乙二胺四 乙酸二鈉 l〇-15mg、肌醇8-10mg、蛋白胨5-8mg、無(wú)機(jī)物混合液40ml、微量元素水溶液25ml、白 砂糖2-38、煙酸1-211^和瓊脂1-28，且所述胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的?!1值為5.6。
[0045] 其中，所述無(wú)機(jī)物混合液和微量元素水溶液均為步驟S2(更具體為步驟S2-1)中的 相應(yīng)無(wú)機(jī)物混合液和微量元素水溶液，無(wú)非量取的體積不同而已，在此不再進(jìn)行重復(fù)描述。 [0046]在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，所述步驟S3中，培養(yǎng)溫度為25±1°C。其 它環(huán)境如濕度、光照等等均為自然環(huán)境，在此不再進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0047]經(jīng)過(guò)上述步驟S3的培養(yǎng)后，便可以得到簇生、密集的羌活小苗，從而可繼續(xù)進(jìn)行后 續(xù)的操作處理。
[0048]在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，所述步驟S4中，所述生根培養(yǎng)基是以1/ 2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加有氯吡苯脲0 · 4-0 · 8mg/L、萘乙酸0 · 1-0 · 3mg/L、瓊脂2-4g/ 1^蔗糖10-158/1、多效唑0.1-0.21^/1而得到的培養(yǎng)基，且所述生根培養(yǎng)基的?!1值為5.2。 [0049]在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，所述步驟S4中，培養(yǎng)溫度為20±2°C。其 它環(huán)境如濕度、光照等等均為自然環(huán)境，在此不再進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0050] 當(dāng)?shù)玫姜?dú)立羌活小苗后，便可進(jìn)行移栽。移栽的技術(shù)屬于非常公知的常規(guī)知識(shí)，例 如可根據(jù)【背景技術(shù)】中引用的CN1918972A中公開(kāi)的移栽技術(shù)進(jìn)行操作，在此不再進(jìn)行詳細(xì)描 述。
[0051] 在本發(fā)明的羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法中，所使用的多個(gè)培養(yǎng)基可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn) 行滅菌、消毒處理，以保證其無(wú)菌、無(wú)毒的清潔性，這些處理都是組織培養(yǎng)領(lǐng)域中的常規(guī)技 術(shù)手段，在此不再進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0052]如上所述，本發(fā)明提供了一種羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法，通過(guò)上述步驟S1-S4的處 理，可以對(duì)羌活進(jìn)行快速繁殖，經(jīng)過(guò)如此組織培養(yǎng)方法(尤其是其中多個(gè)技術(shù)特征的限定和 綜合協(xié)同作用），可得到具有株數(shù)多、發(fā)根數(shù)高、健康良好等諸多優(yōu)異特點(diǎn)的羌活幼苗，滿足 了大規(guī)模種植的需求，具有良好的應(yīng)用前景和潛力。
【具體實(shí)施方式】
[0053]下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但這些例舉性實(shí)施方式的用途和 目的僅用來(lái)例舉本發(fā)明，并非對(duì)本發(fā)明的實(shí)際保護(hù)范圍構(gòu)成任何形式的任何限定，更非將 本發(fā)明的保護(hù)范圍局限于此。
[0054] 制備例1:無(wú)機(jī)物混合液的制備
[0055] 將 10g K2HPO4 · 3H20、5g MgCl2、6g NaH2P〇4、2g NH4Cl、3g NH4N03、4g硼酸和3.5g KI加入到1000ml蒸餾水中攪拌溶解，從而得到無(wú)機(jī)物混合液。
[0056]制備例2:微量元素水溶液的制備
[0057]將4g鉬酸鈉、2g硫酸鋅、3g硝酸銅、4g氯化|丐、2g氯化鈷、7g氯化猛、5g氯化亞鐵、2g 氯化鐵和3g氯化鋁溶解于1000ml蒸餾水中，從而得到微量元素水溶液。
[0058]制備例3:初增殖培養(yǎng)基的制備
[0059] 分別取2，4，5-三氯苯氧乙酸0.5mg、6-芐氨基腺嘌呤1.25mg( 即6-芐氨基腺嘌呤與 2，4，5-三氯苯氧乙酸的質(zhì)量比為2.5:1)、赤霉素1.5mg、制備例1得到的無(wú)機(jī)物混合液50ml、 制備例2得到的微量元素水溶液20ml、鹽酸吡哆醇25mg、檸檬酸1 lmg、L-脯氨酸12mg、乙二醇 7mg、鹿糖10mg和瓊脂3.5g，將這些組分先加入到適量(例如500ml)雙蒸水中進(jìn)行充分混合， 然后用雙蒸水定容至l〇〇〇ml同時(shí)調(diào)節(jié)pH值為5.5,從而得到初增殖培養(yǎng)基，將其命名為CZZ。 [0060]制備例3-1至3-6:初增殖培養(yǎng)基的制備
[0061 ] 除分別將6-芐氨基腺嘌呤用量替換為0 · 5mg、0 · 75mg、lmg、1 · 5mg、1 · 75mg和2mg外， 其它操作均不變，從而重復(fù)實(shí)施了制備例3,順次得到制備例3-l、3-2、3-3、3-4、3-5和3-6， 將得到的初增殖培養(yǎng)基順次命名為CZZ1、CZZ2、CZZ3、CZZ4、CZZ5和CZZ6。
[0062]制備例4:繼代增殖培養(yǎng)基的制備
[0063]以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加維生素 C l.lmg/L、瓊脂1.5g/L、麥芽糖6.5g/L 和復(fù)合生長(zhǎng)素(為質(zhì)量比4:1的6-氨基腺嘌呤與2，4_表油菜素內(nèi)酯的混合物)0.6mg/L，并調(diào) 節(jié)pH值為5.8，從而得到繼代增殖培養(yǎng)基，將其命名為JDZZ。
[0064]制備例5:胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備
[0065]分別取異戊烯基腺嘌呤3mg、吲哚-3-丁酸3.2mg、乙二胺四乙酸二鈉12mg、肌醇 9mg、蛋白胨6.5mg、制備例1的無(wú)機(jī)物混合液40ml、制備例2的微量元素水溶液25ml、白砂糖 2.5g、煙酸1.5mg和瓊脂1.5g，將這些組分先加入到適量(例如500ml)雙蒸水中進(jìn)行充分混 合，然后用雙蒸水定容至l〇〇〇ml同時(shí)調(diào)節(jié)pH值為5.6,從而得到胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將其命名 為PYYD〇
[0066]制備例6:生根培養(yǎng)基的制備
[0067]以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加氯吡苯脲0 · 6mg/L、萘乙酸0 · 2mg/L、瓊脂3g/ L、蔗糖13g/L、多效唑0.15mg/L，并調(diào)節(jié)pH值為5.2，從而得到生根培養(yǎng)基，將其命名為56。 [0068]除非另有規(guī)定和說(shuō)明，否則在下面的所有實(shí)施例中使用的各個(gè)培養(yǎng)基均是上述相 應(yīng)制備例中得到的相應(yīng)培養(yǎng)基。
[0069]實(shí)施例1:明期(L)與暗期(D)的比例考察 [0070] S1:無(wú)菌基體的預(yù)處理
[0071]選擇羌活萌發(fā)的嫩根芽，流水沖洗干凈，并剪成1.5cm長(zhǎng)的片段;將所述片段用質(zhì) 量百分比濃度為75%的酒精消毒25秒，然后浸泡于質(zhì)量百分比濃度為0.05%的高錳酸鉀水 溶液中3分鐘，最后撈出，用無(wú)菌水沖洗4-5次，得到無(wú)菌基體；
[0072] S2:簇生芽培養(yǎng)
[0073] S2-1:將所述無(wú)菌基體接種到初增殖培養(yǎng)基CZZ中，在溫度為16°C下，紫外光照射 1.5小時(shí)，然后以22001UX的光照強(qiáng)度照射9小時(shí)，最后恢復(fù)暗期；如此循環(huán)處理18天，完成第 一階段培養(yǎng)，得到初增殖基體；
[0074] S2-2:完成第一階段培養(yǎng)后，將初增殖基體接種到繼代增殖培養(yǎng)基JDZZ中，將溫度 升高至25°C，并按照下表1中所示的以一天為周期、以小時(shí)計(jì)的明期(L)與暗期(D)的比例交 替進(jìn)行光照和停止光照，光照時(shí)的光照強(qiáng)度為30001UX;如此循環(huán)處理13天，完成第二階段 培養(yǎng)，得到簇生芽；
[0075] S3:簇生苗培養(yǎng)
[0076]將所述簇生芽接種于胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基PYYD中，繼續(xù)在25°C下培養(yǎng)簇生芽25天，從 而得到簇生苗；
[0077] S4:生根培養(yǎng)
[0078]將簇生苗仔細(xì)分株，并接種到生根培養(yǎng)基SG中，繼續(xù)在20°C下培養(yǎng)23天，得到根系 完整的獨(dú)立羌活小苗。
[0079] 其中，在步驟S2-2中的明期(L)與暗期(D)的比例見(jiàn)下表1中所示，其中發(fā)明人發(fā)現(xiàn) 當(dāng)以小時(shí)計(jì)的明期(L)與暗期(D)的比例為15:9時(shí)，能夠最終得到最大數(shù)量的根系完整的獨(dú) 立羌活小苗，將步驟S1中10條1.5cm長(zhǎng)的無(wú)菌基體在明期(L)與暗期(D)的比例為15:9條件 下得到的所有獨(dú)立羌活小苗數(shù)量進(jìn)行平均，得到每條無(wú)菌基體所繁殖出的平均獨(dú)立羌活小 苗(平均為24.6棵）。為了更直觀地進(jìn)行對(duì)比，將其作為基準(zhǔn)率100,其它明期(L)與暗期(D) 比下得到的每條無(wú)菌基體（以10條的總數(shù)量進(jìn)行平均取值)所繁殖出的平均獨(dú)立羌活小苗 數(shù)量與其進(jìn)行對(duì)比，從而可得到不同明期（L)與暗期(D)比下的得苗數(shù)（四舍五入的結(jié)果計(jì) 算到1位小數(shù)），總結(jié)果見(jiàn)下表1。
[0080] 表 1
[0081]
[0082]由此可見(jiàn)，步驟S2-2中的明期（L)與暗期(D)的比非常重要，能夠顯著地影響著最 終所得獨(dú)立羌活小苗的數(shù)量，其中當(dāng)為15:9時(shí)能夠取得最好的技術(shù)效果，而其它比值均導(dǎo) 致小苗數(shù)量有顯著降低，偏離15:9越大，則降低越顯著。
[0083]實(shí)施例2:紫外光照射與否的考察
[0084] 除將步驟S2-1中的"紫外光照射1.5小時(shí)"予以省略外，其它操作均不變(即不進(jìn)行 紫外光照射，而只是進(jìn)行照射和暗期循環(huán)，以及選擇最優(yōu)的明期與暗期比），從而重復(fù)進(jìn)行 了實(shí)施例1-1，得到實(shí)施例2。
[0085] 結(jié)果見(jiàn)下表2,為了便于對(duì)比，仍將實(shí)施例1-1的結(jié)果一同列出。
[0086] 表 2
[0087]
[0088] 由此可見(jiàn)，即使在最優(yōu)的明期與暗期的比例下，但當(dāng)步驟S2-1中不進(jìn)行紫外光照 射時(shí)，得苗數(shù)仍有顯著的大幅度降低，這證明紫外光照射能夠改善組織增殖、誘發(fā)增殖，從 而提高了得苗數(shù)。
[0089]實(shí)施例3-4:溫度的考察
[0090]實(shí)施例3:除將步驟S2-1中的溫度由16°C替換為步驟S2-2中的25°C外，其它操作均 不變（即兩個(gè)步驟的溫度均為步驟S2-2中的溫度，以及選擇最優(yōu)的明期與暗期比），從而重 復(fù)進(jìn)行了實(shí)施例1_1，得到實(shí)施例3。
[0091]實(shí)施例3:除將步驟S2-2中的溫度由25°C替換為步驟S2-1中的16°C外，其它操作均 不變（即兩個(gè)步驟的溫度均為步驟S2-1中的溫度，以及選擇最優(yōu)的明期與暗期比），從而重 復(fù)進(jìn)行了實(shí)施例1_1，得到實(shí)施例4。
[0092]結(jié)果見(jiàn)下表3,為了便于對(duì)比，仍將實(shí)施例1-1的結(jié)果一同列出。
[0093] 表 3
[0094]
[0095]由此可見(jiàn)，步驟S2-1與S2-2中的溫度選擇能夠顯著影響最終得苗數(shù)，當(dāng)步驟S2-1 的溫度低于S2-2,且分別為16°C、25°C時(shí)能夠取得最好的效果。而當(dāng)這兩個(gè)階段的溫度相同 時(shí)，導(dǎo)致得苗數(shù)有顯著的降低。
[0096] 發(fā)明人還對(duì)步驟S2-1和S-2的溫度數(shù)值進(jìn)行了對(duì)換，考察了先高溫、后低溫時(shí)的效 果，從而得到了對(duì)比例（即除將步驟S2-1的溫替換為25°C、步驟S2-2的溫度替換為16°C外， 其它操作均變，從而重復(fù)操作了實(shí)施李1-1)，結(jié)果見(jiàn)下表4,為了對(duì)比的方便，將實(shí)施例1-1、 實(shí)施例3-4的結(jié)果一并列出。
[0097] 表 4
[0098]
[0099]由此可見(jiàn)，當(dāng)先高溫、后低溫時(shí)，得苗率降低最為顯著，不但要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)施例1-1，而且要顯著弱于實(shí)施例3-4,這證明反而要弱于溫度恒定不變時(shí)的情形，這進(jìn)一步證明了 先低溫、后高溫的必要性和效果上的非顯而易見(jiàn)性。
[0100]實(shí)施例5-10:2，4，5-三氯苯氧乙酸與6-芐氨基腺嘌呤的用量比的考察
[0101] 除將步驟S2-1中的初增殖培養(yǎng)基由CZZ分別替換為0^1、0222、0223、0224、0225和 CZZ6外，其它操作均不變，從而重復(fù)進(jìn)行了實(shí)施例1-1，順次得到實(shí)施例5-10。
[0102] 結(jié)果見(jiàn)下表5,為了便于對(duì)比，仍將實(shí)施例1-1的結(jié)果一同列出，"兩者質(zhì)量比" SP6-芐氨基腺嘌呤與2，4,5-三氯苯氧乙酸的質(zhì)量比。
[0103] 表5
[0104]
[0105]由此可見(jiàn)，在初增殖培養(yǎng)基中，6-芐氨基腺嘌呤與2,4,5_三氯苯氧乙酸的質(zhì)量比 對(duì)于最終的結(jié)果有顯著的影響，優(yōu)選為2-3:1，最優(yōu)選為2.5:1。而當(dāng)偏離2.5:1越大，則得苗 數(shù)越低。
[0106]實(shí)施例11-12:2，4，5-三氯苯氧乙酸或6-芐氨基腺嘌呤的考察 [0107]實(shí)施例11:除將步驟S2-1的初增殖培養(yǎng)基中的2，4,5-三氯苯氧乙酸予以省略外， 其它操作均不變(即只包含6-芐氨基腺嘌呤），從而重復(fù)進(jìn)行了實(shí)施例1-1，得到實(shí)施例11。 [0108]實(shí)施例12:除將步驟S2-1的初增殖培養(yǎng)基中的6-芐氨基腺嘌呤予以省略外，其它 操作均不變(即只包含2,4,5_三氯苯氧乙酸），從而重復(fù)進(jìn)行了實(shí)施例1-1，得到實(shí)施例12。 [0109]結(jié)果見(jiàn)下表6,為了便于對(duì)比，仍將實(shí)施例1-1的結(jié)果一同列出。
[0110] 表6
[0111]
[0112] 由此可見(jiàn)，當(dāng)初增殖培養(yǎng)基中僅僅包含一種組分時(shí)，可導(dǎo)致最終得苗率有顯著的 降低，尤其是僅僅包含2,4,5_三氯苯氧乙酸時(shí)，得苗率急劇降低至36.9,已經(jīng)失去了大規(guī)模 繁殖的可能。還可以看出，當(dāng)同時(shí)包含這兩種組分時(shí)，兩者之間能夠發(fā)揮意想不到的協(xié)同分 裂促進(jìn)效果，從而取得了最為優(yōu)異的得苗率。
[0113] 實(shí)施例13-14:6-氨基腺嘌呤與2,4_表油菜素內(nèi)酯的考察
[0114] 實(shí)施例13:除將步驟S2-2的復(fù)合生長(zhǎng)素中的2，4_表油菜素內(nèi)酯予以省略外，其它 操作均不變(即只包含6-氨基腺嘌呤），從而重復(fù)進(jìn)行了實(shí)施例1-1，得到實(shí)施例13。
[0115] 實(shí)施例14:除將步驟S2-2的復(fù)合生長(zhǎng)素中的6-氨基腺嘌呤予以省略外，其它操作 均不變(即只包含2,4_表油菜素內(nèi)酯），從而重復(fù)進(jìn)行了實(shí)施例1-1，得到實(shí)施例14。
[0116] 結(jié)果見(jiàn)下表7,為了便于對(duì)比，仍將實(shí)施例1-1的結(jié)果一同列出。
[0117] 表7
[0118]
[0119] 田此η」見(jiàn)，a繼代増鉭堉喬
盎的炅甘王長(zhǎng)累甲1乂 1乂蝕名、一種組分時(shí)，可導(dǎo)致最終 得苗率有顯著的降低(尤其是僅僅包含2,4_表油菜素內(nèi)酯時(shí)急劇降低至58.3)，而當(dāng)同時(shí)包 含這兩種組分時(shí)，能夠取得最為優(yōu)異的得苗率。
[0120] 實(shí)施例15-17:步驟S3中分裂素的考察
[0121] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的步驟S3中，分裂素的種類能夠顯著影響最終的得苗率， 為了進(jìn)行考察，將實(shí)施例1-1中的異戊烯基腺嘌呤分別替換為6-芐氨基嘌呤、6-糠基腺嘌呤 和6-芐基腺嘌呤，其它操作均不變，從而順次得到了實(shí)施例15-17。
[0122] 結(jié)果見(jiàn)下表8,為了便于對(duì)比，仍將實(shí)施例1-1的結(jié)果一同列出。
[0123] 表8
[0124]
[0125]
[0126] 由此可見(jiàn)，在胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的分裂素中，異戊烯基腺嘌呤連同吲哚-3-丁酸一起 能發(fā)揮最好的技術(shù)效果，其它分裂素則有一定程度的降低。
[0127] 除上述考察了不同條件下的得苗率外，發(fā)明人還對(duì)上述不同實(shí)施例的步驟S4實(shí)施 后所得到的每株羌活小苗發(fā)根數(shù)進(jìn)行了考察，以羌活小苗所生出的長(zhǎng)度多l(xiāng)cm的根作為有 效根，計(jì)算有效根的總條數(shù)(每個(gè)實(shí)施例取1〇〇株的平均數(shù)），并觀察根的健康形態(tài)，從而考 察了不同因素對(duì)生根性能的影響。
[0128] 結(jié)果見(jiàn)下表9,為了便于對(duì)比，仍將實(shí)施例1-1的結(jié)果一同列出。
[0129] 表9
[0130]
[0131 ]其中，實(shí)施例3-4的"5.32、5.37"表示實(shí)施例3的100株羌活小苗的平均發(fā)根數(shù)為 5.32條，而實(shí)施例4的100株羌活小苗的平均發(fā)根數(shù)為5.37條，其它例如實(shí)施例11-12、實(shí)施 例13-14的發(fā)根數(shù)也有著相同的對(duì)應(yīng)關(guān)系，在此不再詳細(xì)描述。而實(shí)施例1-2至1-5的"5.13-5.35"則表示這4個(gè)實(shí)施例中的某一個(gè)實(shí)施例的100株羌活小苗的平均發(fā)根數(shù)為5.13條，另 一個(gè)實(shí)施例的100株羌活小苗的平均發(fā)根數(shù)為5.35條，另外兩個(gè)實(shí)施例的各自100株小苗的 平均發(fā)根數(shù)則介于5.13和5.35之間，其它例如實(shí)施例5-10、實(shí)施例5-17也具有先同的含義， 同樣不再 贅述。
[0132] 由此可見(jiàn)，在步驟S2-S3中，上述諸多技術(shù)特征的改變都可導(dǎo)致發(fā)根數(shù)有一定程度 的降低，這證明上述諸多技術(shù)特征不但影響了得苗數(shù)，而且也影響到了最后的生根結(jié)果，但 都能得到形態(tài)良好的根。
[0133] 實(shí)施例18-19:生根培養(yǎng)基的考察
[0134] 實(shí)施例18:除將步驟S4的生根培養(yǎng)基SG中的氯吡苯脲予以省略外，其它操作均不 變，從而重復(fù)進(jìn)行了實(shí)施例1-1，得到實(shí)施例18。
[0135] 實(shí)施例19:除將步驟S4的生根培養(yǎng)基SG中的多效唑予以省略外，其它操作均不變， 從而重復(fù)進(jìn)彳丁了實(shí)施例1_1，得到實(shí)施例19。
[0136] 結(jié)果見(jiàn)下表10,為了便于對(duì)比，仍將實(shí)施例1-1的結(jié)果一同列出。
[0137] 表1〇
[0138]
[0139] 其中，"X"表示存在5-10%的病變褐色根。
[0140]由此可見(jiàn)，當(dāng)不使用氯吡苯脲時(shí)，發(fā)根數(shù)有顯著的降低，這證明氯吡苯脲能夠顯著 地促進(jìn)生根效果，從而得到最為優(yōu)異的生根數(shù)。還可以看出，多效唑的存在，可以使得根健 康良好，保證了后續(xù)煉苗、移栽等的成活率，而當(dāng)不存在多效唑時(shí)，則出現(xiàn)了一些病變褐色 根，從而增大了后續(xù)操作的小苗死亡率。
[0141]綜上所述，本發(fā)明提供了一種羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法，所述方法通過(guò)特定的培 養(yǎng)步驟和特定技術(shù)特征的綜合選擇與協(xié)同促進(jìn)效果，可以對(duì)羌活進(jìn)行快速繁殖，經(jīng)過(guò)如此 組織培養(yǎng)方法(尤其是其中多個(gè)技術(shù)特征的限定和綜合協(xié)同作用），可得到具有株數(shù)多、發(fā) 根數(shù)高、健康良好等諸多優(yōu)異特點(diǎn)的羌活幼苗，滿足了大規(guī)模種植的需求，具有良好的應(yīng)用 前景和潛力。
[0142]應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例的用途僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非意欲限制本發(fā)明的保護(hù)范 圍。此外，也應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各 種改動(dòng)、修改和/或變型，所有的這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的保 護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種羌活的組織培養(yǎng)繁殖方法，所述方法包括如下步驟： S1:無(wú)菌基體的預(yù)處理 選擇羌活萌發(fā)的根芽，并經(jīng)滅菌、消毒處理，得到無(wú)菌基體； S2:簇生芽培養(yǎng) 將所述無(wú)菌基體接種到初增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行第一階段培養(yǎng);然后再接種到繼代增殖 培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，從而在根芽切口出培育出簇生芽； S3:簇生苗培養(yǎng) 將所述簇生芽接種于胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)簇生芽20-30天，從而得到簇生苗； S4:生根培養(yǎng) 將簇生苗仔細(xì)分株，并接種到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20-26天，得到根系完整的獨(dú)立羌活 小苗。2. 如權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述步驟S2具體如下： S2-1 :將所述無(wú)菌基體接種到初增殖培養(yǎng)基中，在溫度為16 ± 2°C下，紫外光照射卜2小 時(shí)，然后以2000-25001UX的光照強(qiáng)度照射8-10小時(shí)，最后恢復(fù)暗期;如此循環(huán)處理15-20天， 完成第一階段培養(yǎng)，得到初增殖基體； S2-2:完成第一階段培養(yǎng)后，將初增殖基體接種到繼代增殖培養(yǎng)基中，將溫度升高至25 ±1°C，并按照以一天為周期、以小時(shí)計(jì)的明期(L):暗期(D) = 13-17:7-ll交替進(jìn)行光照和 停止光照，光照時(shí)的光照強(qiáng)度為2900-31001UX;如此循環(huán)處理10-15天，完成第二階段培養(yǎng)， 得到簇生芽。3. 如權(quán)利要求2所述的組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:在所述步驟S2-1中，所述初增 殖培養(yǎng)基的pH值為5.5，且每1000ml所述初增殖培養(yǎng)基包含如下含量的各種組分:2，4，5-三 氯苯氧乙酸0.5mg、6-節(jié)氨基腺噪呤0.5-2mg、赤霉素 l-2mg、無(wú)機(jī)物混合液50ml、微量元素水 溶液20ml、鹽酸吡哆醇20-30mg、檸檬酸8-14mg、L-脯氨酸10-15mg、乙二醇5-9mg、蔗糖8-12mg和瓊脂3-4g。4. 如權(quán)利要求2或3所述的組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:6-芐氨基腺嘌呤與2，4，5-三氯苯氧乙酸的質(zhì)量比優(yōu)選為2-3:1，最優(yōu)選為2.5:1。5. 如權(quán)利要求3-4任一項(xiàng)所述的組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述無(wú)機(jī)物混合液是 將 10g K2HP〇4.3H20、5g MgCl2、6gNaH2P〇4、2g NH4Cl、3g NH4N03、4g硼酸和3.5g KI加入到 1000ml蒸餾水中攪拌溶解而得到的。6. 如權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述微量元素水溶液 是將4g鉬酸鈉、2g硫酸鋅、3g硝酸銅、4g氯化鈣、2g氯化鈷、7g氯化錳、5g氯化亞鐵、2g氯化鐵 和3g氯化鋁溶解于1000ml蒸餾水中而得到的。7. 如權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所述的組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:在所述步驟S2-2中， 所述繼代增殖培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加有維生素 C 0.8-1.4mg/L、瓊 月旨l_2g/L、麥芽糖5-8g/L和復(fù)合生長(zhǎng)素0.4-0.8mg/L而得到的培養(yǎng)基，且其pH值為5.8。8. 如權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)所述的組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:在所述步驟S2-2中， 按照以一天為周期，以小時(shí)計(jì)的明期(L):暗期(D) = 13-17: 7-11，例如可為13:11、14:10、 15:9、16:8或17:7，最優(yōu)選明期(〇 :暗期(0) = 15:9。9. 如權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述的組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于：所述步驟S3中，每 1000ml所述胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含如下含量的各種組分:異戊烯基腺嘌呤2-4mg、吲哚-3-丁 酸3-3.5mg、乙二胺四乙酸二鈉 l〇-15mg、肌醇8-10mg、蛋白胨5-8mg、無(wú)機(jī)物混合液40ml、微 量元素水溶液25ml、白砂糖2-3g、煙酸l-2mg和瓊脂l-2g，且所述胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為 5.6〇10.如權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)所述的組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述步驟S4中，所述 生根培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加有氯吡苯脲0.4-0.8mg/L、萘乙酸0 . ΙΟ. 3mg/L、瓊脂 2-4g/L、蔗糖 10-15g/L、 多效唑 0.1-0. 2mg/L 而得到的培養(yǎng)基， 且所述生根培 養(yǎng)基的pH值為5.2。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK106069787SQ201610663141
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月12日 公開(kāi)號(hào)201610663141.0, CN 106069787 A, CN 106069787A, CN 201610663141, CN-A-106069787, CN106069787 A, CN106069787A, CN201610663141, CN201610663141.0
【發(fā)明人】黃初旭, 葛云梅
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