一種龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁育方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁育方法，本方法包括外植體消毒殺菌、不定芽誘導、增殖繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及煉苗移栽，并對各步驟具體參數(shù)進行改進，同時對不定芽誘導培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基成分及參數(shù)進行優(yōu)化，本發(fā)明通過植物組織培養(yǎng)方法短時間內獲得大量優(yōu)質龍腦樟種苗的方法。以龍腦樟萌發(fā)芽為外植體，經過外植體消毒、不定芽誘導培養(yǎng)、增殖繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等步驟建立了一套完善的龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁育方法，為滿足對龍腦樟優(yōu)質種苗的需求、加速龍腦樟良種的推廣具有重要的現(xiàn)實意義，同時該套方法相較于其他的培養(yǎng)方法再生率高、出芽多，植株移栽成活率可達到90％以上。
【專利說明】
_種龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁育方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物的繁殖方法，尤其是一種龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁育方法。
【背景技術】
[0002] 長期以來對龍腦樟的開發(fā)利用多以提取精油為主，過度采伐導致其資源嚴重破 壞，尤其是優(yōu)樹資源趨于枯竭。近年來其人工林發(fā)展規(guī)模急劇擴大，市場上對于龍腦樟優(yōu)質 苗木的需求不斷增長。要加速龍腦樟的產業(yè)開發(fā)，必須建立規(guī)?；拿缒竞驮狭只?，如 何使龍腦樟優(yōu)良母株的各種優(yōu)良性狀在后代個體中遺傳性穩(wěn)定，提高龍腦樟的龍腦含量， 提高成活率和生長整齊度，是實現(xiàn)龍腦樟種苗產業(yè)開發(fā)、生產關鍵技術。
[0003] 目前，龍腦樟樹主要是通過種子、扦插、組織培養(yǎng)等方式進行繁育，種子繁育最大 的缺陷是后代個體變異性非常大，母株的諸多優(yōu)良性狀，如高龍腦含量及抗病豐產性能在 后代中很難穩(wěn)定延續(xù);扦插繁育雖然能有效解決后代個體差異問題，單扦插成活率低;采用 組織培養(yǎng)技術不僅能克服上述缺陷，同時在短期內即可獲得大量優(yōu)質苗木，但是組織培養(yǎng) 體系同樣存在著不完善的問題，快繁增殖系數(shù)低、生根苗根系差、容易脫葉、木質程度不夠 等導致田間種植成活率低等客觀事實，大大限制了龍腦樟組織培養(yǎng)產業(yè)的發(fā)展。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁育方法，可有效提高龍腦樟的 增殖系數(shù)、生根率以及成活率。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術方案：
[0006] -種龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁育方法，包括如下步驟：
[0007] (1)剪取龍腦樟單株的萌發(fā)芽做為外植體，用質量百分數(shù)0.05%的洗潔精浸泡 5min，自來水沖洗后，移置于超凈工作臺上；在75%乙醇中浸泡30秒，無菌水沖洗2遍后，用 0.1%升汞消毒lOmin，無菌水清洗3次后，再用無菌吸收紙去掉表面水分待用；
[0008] (2)將步驟（1)處理后的外植體接種到不定芽誘導培養(yǎng)基中，先在25-28°C條件下 全暗培養(yǎng)1-3天，然后置于每天光照10-12小時，光照強度為1500-30001X，直至誘導形成不 定芽;所述不定芽誘導培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、6-BA 0.5-1.Omg/L、NAA 0.1-0.5mg/L、谷氨 酰胺〇 · 5-1 · 0mg/L、DA-6 0 · 02-0 · 05mg/L、瓊脂5 · Og/L、蔗糖30g/L;
[0009] (3)將步驟(2)培養(yǎng)的外植體的愈傷組織上的不定芽長至約2-3cm時切下，并接種 至增殖繼代培養(yǎng)基上進行增殖繼代培養(yǎng)，接種后先在25-28Γ條件下全暗培養(yǎng)3-5天，然后 置于每天光照10-13小時，光照強度為3500-45001x，置于培養(yǎng)溫度為25-28°C的條件下培養(yǎng) 2-3周后，龍腦樟的組培苗開始形成，每25-35天繼代轉管一次，繼代5次生成生長健壯的試 管苗；
[0010] ⑷生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5-5.5cm的小芽分切下并接種到 生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，接種后先在25-28 °C條件下全暗培養(yǎng)3-7天，然后置于每天光 照12-15小時，光照強度為1500-25001X，培養(yǎng)溫度為25-28°C的條件下培養(yǎng)20天左右即開始 生根；
[0011] (5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5-7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根 組培苗置于自然光照下煉苗3-5天后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基并在多菌 靈溶液中浸泡8-10s，栽入由草炭土:沙土 = 3:1混合成的基質，保持濕度并給予60-80%的 遮陰處理;移栽時選擇室外最高氣溫穩(wěn)定達到18°C以上時移栽，移栽后每天進行葉片噴施 清水，早中晚各1次，促進其進一步生長，同時要避免因根部過長而在移栽過程中受傷。
[0012] 優(yōu)選地，上述步驟（3)中所述增殖繼代培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、ZT 2.0-6.0mg/L、 IBA 0.5-1.0mg/L、5.0g/L瓊脂、30g/L鹿糖。
[0013] 優(yōu)選地，上述步驟(4)中所述生根培養(yǎng)基包括：1/2MS培養(yǎng)基、IBA 0.1-0.5mg/L、 NAA 0 · 1 -0 · 2mg/L、5 · Og/L瓊脂、20g/L蔗糖，所述 1 /2MS是MS全量減半。
[0014] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點：1、本發(fā)明通過植物組織培養(yǎng)方法短時間內獲得 大量優(yōu)質龍腦樟種苗的方法。以龍腦樟萌發(fā)芽為外植體，經過外植體消毒、不定芽誘導培 養(yǎng)、增殖繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等步驟建立了一套完善的龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁 育方法，為滿足對龍腦樟優(yōu)質種苗的需求、加速龍腦樟良種的推廣具有重要的現(xiàn)實意義，同 時該套方法相較于其他的培養(yǎng)方法再生率高、出芽多，植株移栽成活率可達到90 %以上。2、 在本發(fā)明的不定芽誘導培養(yǎng)基中，還加入了DA-6(己酸二乙氨基乙醇酯），DA-6作為一種植 物生長調節(jié)劑，通常用于田間栽培，很少用于組織培養(yǎng)，但是在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物對DA-6的加入非常敏感，不定芽的再生效率顯著提升了。
【具體實施方式】
[0015] 下面對本發(fā)明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點和特征能更易于被 本領域技術人員理解，從而對本發(fā)明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。
[0016] 實施例1
[0017] -種龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁育方法：
[0018] (1)剪取龍腦樟單株的萌發(fā)芽做為外植體，用質量百分數(shù)0.05%的洗潔精浸泡 5min，自來水沖洗后，移置于超凈工作臺上；在75%乙醇中浸泡30秒，無菌水沖洗2遍后，用 0.1%升汞消毒lOmin，無菌水清洗3次后，再用無菌吸收紙去掉表面水分待用；
[0019] (2)將步驟（1)處理后的外植體接種到不定芽誘導培養(yǎng)基中，先在25-28Γ條件下 全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照12小時，光照強度為30001x，直至誘導形成不定芽;所述不 定芽誘導培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、6-BA 1.0mg/L、NAA 0.2mg/L、谷氨酰胺0.5mg/L、DA-6 0 · 05mg/L、瓊脂 5 · Og/L、鹿糖 30g/L;
[0020] (3)將步驟(2)培養(yǎng)的外植體的愈傷組織上的不定芽長至約2-3cm時切下，并接種 至增殖繼代培養(yǎng)基上進行增殖繼代培養(yǎng)，所述增殖繼代培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、ZT 4mg/L、 IBA 0.5mg/L、5. Og/L瓊脂、30g/L蔗糖;接種后先在25-28°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于 每天光照12小時，光照強度為40001x，置于培養(yǎng)溫度為25-28 °C的條件下培養(yǎng)3周后，龍腦樟 的組培苗開始形成，每30天繼代轉管一次，繼代5次生成生長健壯的試管苗；
[0021] (4)生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5-5.5cm的小芽分切下并接種到 生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基包括：1/2MS培養(yǎng)基、IBA 0.5mg/L、NAA 0. lmg/L、5. Og/L瓊脂、20g/L蔗糖;接種后先在25-28°C條件下全暗培養(yǎng)6天，然后置于每天 光照15小時，光照強度為25001x，培養(yǎng)溫度為25-28°C的條件下培養(yǎng)20天左右即開始生根； [0022 ] (5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5-7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根 組培苗置于自然光照下煉苗4天后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基并在多菌靈 溶液中浸泡8-10s，栽入由草炭土:沙土 = 3:1混合成的基質，保持濕度并給予75%的遮陰處 理;移栽時選擇室外最高氣溫穩(wěn)定達到18 °C以上時移栽，移栽后每天進行葉片噴施清水，早 中晚各1次，促進其進一步生長，同時要避免因根部過長而在移栽過程中受傷。
[0023] 實施例2
[0024] -種龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁育方法：
[0025] (1)剪取龍腦樟單株的萌發(fā)芽做為外植體，用質量百分數(shù)0.05%的洗潔精浸泡 5min，自來水沖洗后，移置于超凈工作臺上；在75%乙醇中浸泡30秒，無菌水沖洗2遍后，用 0.1%升汞消毒lOmin，無菌水清洗3次后，再用無菌吸收紙去掉表面水分待用；
[0026] (2)將步驟（1)處理后的外植體接種到不定芽誘導培養(yǎng)基中，先在25-28Γ條件下 全暗培養(yǎng)2天，然后置于每天光照11小時，光照強度為15001x，直至誘導形成不定芽;所述不 定芽誘導培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.3mg/L、谷氨酰胺0.7mg/L、DA-6 0 · 04mg/L、瓊脂 5 · Og/L、鹿糖 30g/L;
[0027] (3)將步驟(2)培養(yǎng)的外植體的愈傷組織上的不定芽長至約2-3cm時切下，并接種 至增殖繼代培養(yǎng)基上進行增殖繼代培養(yǎng)，所述增殖繼代培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、ZT 6mg/L、 IBA 0.6mg/L、5.Og/L瓊脂、30g/L鹿糖;接種后先在25-28°C條件下全暗培養(yǎng)5天，然后置于 每天光照10小時，光照強度為35001x，置于培養(yǎng)溫度為25-28 °C的條件下培養(yǎng)2周后，龍腦樟 的組培苗開始形成，每25天繼代轉管一次，繼代5次生成生長健壯的試管苗；
[0028] (4)生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5-5.5cm的小芽分切下并接種到 生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基包括：1/2MS培養(yǎng)基、IBA 0.7mg/L、NAA 0. lmg/L、5. Og/L瓊脂、20g/L蔗糖;接種后先在25-28°C條件下全暗培養(yǎng)4天，然后置于每天 光照12小時，光照強度為15001x，培養(yǎng)溫度為25-28°C的條件下培養(yǎng)20天左右即開始生根； [0029 ] (5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5-7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根 組培苗置于自然光照下煉苗3天后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基并在多菌靈 溶液中浸泡8-10s，栽入由草炭土:沙土 = 3:1混合成的基質，保持濕度并給予65%的遮陰處 理;移栽時選擇室外最高氣溫穩(wěn)定達到18 °C以上時移栽，移栽后每天進行葉片噴施清水，早 中晚各1次，促進其進一步生長，同時要避免因根部過長而在移栽過程中受傷。
[0030] 實施例3
[0031] (1)剪取龍腦樟單株的萌發(fā)芽做為外植體，用質量百分數(shù)0.05%的洗潔精浸泡 5min，自來水沖洗后，移置于超凈工作臺上；在75%乙醇中浸泡30秒，無菌水沖洗2遍后，用 0.1%升汞消毒lOmin，無菌水清洗3次后，再用無菌吸收紙去掉表面水分待用；
[0032] (2)將步驟（1)處理后的外植體接種到不定芽誘導培養(yǎng)基中，先在25-28Γ條件下 全暗培養(yǎng)1天，然后置于每天光照12小時，光照強度為25001x，直至誘導形成不定芽;所述不 定芽誘導培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、6-BA 0.8mg/L、NAA 0.2mg/L、谷氨酰胺0.8mg/L、DA-6 0 · 02mg/L、瓊脂 5 · 0g/L、鹿糖 30g/L;
[0033] (3)將步驟(2)培養(yǎng)的外植體的愈傷組織上的不定芽長至約2-3cm時切下，并接種 至增殖繼代培養(yǎng)基上進行增殖繼代培養(yǎng)，接種后先在25-28Γ條件下全暗培養(yǎng)4天，然后置 于每天光照10小時，光照強度為45001X，置于培養(yǎng)溫度為25-28Γ的條件下培養(yǎng)2周后，龍腦 樟的組培苗開始形成，每35天繼代轉管一次，繼代5次生成生長健壯的試管苗；
[0034] (4)生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5-5.5cm的小芽分切下并接種到 生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，接種后先在25-28Γ條件下全暗
[0035] 培養(yǎng)5天，然后置于每天光照13小時，光照強度為20001x，培養(yǎng)溫度為25-28Γ的條 件下培養(yǎng)20天左右即開始生根；
[0036] (5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5-7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根 組培苗置于自然光照下煉苗4天后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基并在多菌靈 溶液中浸泡8-10s，栽入由草炭土:沙土 = 3:1混合成的基質，保持濕度并給予80%的遮陰處 理;移栽時選擇室外最高氣溫穩(wěn)定達到18 °C以上時移栽，移栽后每天進行葉片噴施清水，早 中晚各1次，促進其進一步生長，同時要避免因根部過長而在移栽過程中受傷。
[0037] 將實施例1-3龍腦樟繁育過程情況進行統(tǒng)計，見表1
[0038] 表1實施例1-3龍腦樟繁育過程數(shù)據(jù)統(tǒng)計表 「00391
[0040]由上述數(shù)據(jù)可知，采用本發(fā)明的組織培養(yǎng)快速培育方法，龍腦樟繁育過程中，愈傷 組織誘導率、不定芽誘導率、小苗生根率、移栽成活率均能保持在較高水平。
【主權項】
1. 一種龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁育方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 剪取龍腦樟單株的萌發(fā)芽做為外植體，用質量百分數(shù)0.05%的洗潔精浸泡5min，自 來水沖洗后，移置于超凈工作臺上;在75 %乙醇中浸泡30秒，無菌水沖洗2遍后，用0.1 %升 汞消毒lOmin，無菌水清洗3次后，再用無菌吸收紙去掉表面水分待用； (2) 將步驟（1)處理后的外植體接種到不定芽誘導培養(yǎng)基中，先在25-28Γ條件下全暗 培養(yǎng)1-3天，然后置于每天光照10-12小時，光照強度為1500-30001X，直至誘導形成不定芽； 所述不定芽誘導培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、6-BA0.5-1.0mg/L、NAA0.1-0.5mg/L、谷氨酰胺0.5_ 1 · 0mg/L、DA-60 · 02-0 · 05mg/L、瓊脂 5 · Og/L、蔗糖 30g/L; (3) 將步驟(2)培養(yǎng)的外植體的愈傷組織上的不定芽長至約2-3cm時切下，并接種至增 殖繼代培養(yǎng)基上進行增殖繼代培養(yǎng)，接種后先在25-28Γ條件下全暗培養(yǎng)3-5天，然后置于 每天光照10-13小時，光照強度為3500-45001x，置于培養(yǎng)溫度為25-28°C的條件下培養(yǎng)2-3 周后，龍腦樟的組培苗開始形成，每25-35天繼代轉管一次，繼代5次生成生長健壯的試管 苗； (4) 生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5-5.5cm的小芽分切下并接種到生根 培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，接種后先在25-28Γ條件下全暗培養(yǎng)3-7天，然后置于每天光照12-15小時，光照強度為1500-25001x，培養(yǎng)溫度為25-28°C的條件下培養(yǎng)20天左右即開始生根； (5) 煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5-7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根組培 苗置于自然光照下煉苗3-5天后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基并在多菌靈溶 液中浸泡8-10s，栽入由草炭土:沙土 = 3:1混合成的基質，保持濕度并給予60-80%的遮陰 處理;移栽時選擇室外最尚氣溫穩(wěn)定達到18 °C以上時移栽，移栽后每天進彳丁葉片噴施清水， 早中晚各1次，促進其進一步生長，同時要避免因根部過長而在移栽過程中受傷。2. 根據(jù)權利要求1所述的龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁育方法，其特征在于，步驟(3)中所述 增殖繼代培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、ZT2 · 0-6 · Omg/L、ΙΒΑ0 · 5-1 · Omg/L、5 · Og/L瓊脂、30g/L蔗 糖。3. 根據(jù)權利要求1所述的龍腦樟組織培養(yǎng)快速繁育方法，其特征在于，步驟(4)中所述 生根培養(yǎng)基包括：1/2MS培養(yǎng)基、ΙΒΑ0 · 1-0 · 5mg/L、ΝΑΑ0 · 1-0 · 2mg/L、5 · 0g/L瓊脂、20g/L蔗 糖，所述1/2MS是MS全量減半。
【文檔編號】A01H4/00GK106069788SQ201610685332
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月15日 公開號201610685332.7, CN 106069788 A, CN 106069788A, CN 201610685332, CN-A-106069788, CN106069788 A, CN106069788A, CN201610685332, CN201610685332.7
【發(fā)明人】蔣志堅
【申請人】湖南龍腦樟種植開發(fā)有限公司