一種帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基及組織培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基及組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明的帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基，包括植物固體培養(yǎng)基及位于其上層的濃度為2000?2500mg/L的先鋒霉素溶液。在實(shí)際組培過程中，將帶菌離體植物材料接種于植物固體培養(yǎng)基上，然后在植物固體培養(yǎng)基表面加入先鋒霉素溶液，再進(jìn)行組織培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方式在達(dá)到高效抑菌同時(shí)避免對(duì)離體培養(yǎng)材料的毒副作用，成功的解決了帶細(xì)菌的植物材料的組培苗生產(chǎn)過程中瓶頸問題，有效完成增殖、生根過程，生產(chǎn)出所需的植物組培苗；該方法可以應(yīng)用于多種帶細(xì)菌的離體培養(yǎng)植物材料，抑菌效率高，生產(chǎn)安全可靠，具有操作性強(qiáng)，生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】
一種帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基及組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基及組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物組織培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的多個(gè)領(lǐng)域，已經(jīng)在種苗脫毒生產(chǎn)、種苗快速繁殖、植物新資源的規(guī)模化應(yīng)用、植物新品種選育等方面給現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)應(yīng)用上的典范，是現(xiàn)代種業(yè)的重要組成部分。目前，我國(guó)植物組培苗已經(jīng)在花卉、果樹、陰生植物、藥用植物等取得了大面積的推廣與應(yīng)用，全世界植物組培苗的年貿(mào)易額已超過150億美元，并且，每年以超過10%的速度在遞增。利用基于離體培養(yǎng)技術(shù)的植物種苗組培快繁方法來生產(chǎn)種苗，比常規(guī)繁殖方法快萬倍乃至十萬倍以上，一個(gè)植株一年可以繁育幾萬到幾百萬個(gè)植株。利用組培快繁技術(shù)來繁殖種苗的成本非常低廉，比用常規(guī)的種苗生產(chǎn)方法生產(chǎn)成本低10倍以上。并且，對(duì)一些營(yíng)養(yǎng)繁殖系數(shù)低且不能通過種子繁殖的農(nóng)業(yè)植物(如香蕉等)、或在自然條件下種子難以萌發(fā)的植物(如鐵皮石斛等)、或數(shù)量稀少的優(yōu)良材料(如生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)的某些優(yōu)良變異單株等)而言，如果沒有組培快繁技術(shù)，要想實(shí)現(xiàn)其規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)是非常困難的，對(duì)一些通過種子來繁殖時(shí)農(nóng)藝性狀會(huì)出現(xiàn)分離的作物(如番木瓜等)而言，如果沒有種苗的組培脫毒快繁技術(shù)，要想進(jìn)一步提高其生產(chǎn)效益也是非常困難的。正是基于種苗組培快繁技術(shù)在繁殖速度高和成本低廉等方面的優(yōu)勢(shì)，植物種苗組培快繁目前已在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域發(fā)展成了一個(gè)巨大的產(chǎn)業(yè)，并取得了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。我省的種苗組培快繁產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)值和技術(shù)在全國(guó)處于領(lǐng)先地位，目前我省涉及到利用組培快繁來生產(chǎn)種苗的農(nóng)業(yè)植物有300多種，估計(jì)組培產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)值在10億元以上。
[0003]目前在組培苗生產(chǎn)過程中，污染率偏高、有些植物褐化嚴(yán)重、種苗玻璃化和變異率高等問題在許多種苗生產(chǎn)企業(yè)依然嚴(yán)重存在，這些問題的存在嚴(yán)重阻礙了組培苗生產(chǎn)成本的進(jìn)一步降低。特別是很多組培苗生產(chǎn)企業(yè)經(jīng)過多年的生產(chǎn)后，由于生產(chǎn)環(huán)境變差及其生產(chǎn)工具老化等原因影響，細(xì)菌污染的發(fā)生概率大大增加。
[0004]目前，國(guó)內(nèi)已有于培養(yǎng)基高溫滅菌前往培養(yǎng)基中添加抗生素的抑菌報(bào)道，這種方法一是經(jīng)過高溫消毒對(duì)其抑菌力有一定的破壞，同時(shí)溶于培養(yǎng)基中的抗生素對(duì)離體培養(yǎng)材料產(chǎn)生的毒副作用比較大。在植物組培苗生產(chǎn)過程中控制污染發(fā)生是其關(guān)鍵技術(shù)之一，細(xì)菌污染的發(fā)生概率比較高，造成生產(chǎn)企業(yè)成本過高乃至失敗。因此，開發(fā)一種在離體植物材料組培苗生產(chǎn)過程中能有效抑菌且對(duì)培養(yǎng)材料不產(chǎn)生毒副作用(或極小毒副作用)的組織培養(yǎng)基及組織培養(yǎng)方法極為重要。
[0005]目前還未見有先將醫(yī)用的先鋒霉素配制高濃度的無菌先鋒霉素溶液，無菌條件下添加到培養(yǎng)基表面上形成固液兩相培養(yǎng)方式來達(dá)到高效抑菌同時(shí)避免對(duì)離體培養(yǎng)材料的毒副作用的報(bào)道和專利申請(qǐng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于解決因發(fā)生帶細(xì)菌后的植物材料不但擴(kuò)大細(xì)菌污染范圍而且導(dǎo)致細(xì)菌污染材料不能利用的問題，開發(fā)出一種有效的針對(duì)組培苗生產(chǎn)中已經(jīng)發(fā)生帶細(xì)菌的離體植物培養(yǎng)材料繼續(xù)有效地利用其增殖、生根完成組培苗生產(chǎn)的組織培養(yǎng)基及組織培養(yǎng)方法O
[0007]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基，包括，植物固體培養(yǎng)基及位于其上層的先鋒霉素溶液。
[0008]優(yōu)選，所述的先鋒霉素溶液的濃度為2000-2500mg/L。
[0009]優(yōu)選，所述的先鋒霉素溶液在植物固體培養(yǎng)基上層形成的厚度為l-2mm。
[0010]優(yōu)選，所述的先鋒霉素溶液是將醫(yī)用先鋒霉素溶于無菌水而制備得到的。
[0011]優(yōu)選，所述的植物固體培養(yǎng)基是用于植物組織增殖或生根培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基。
[0012]優(yōu)選，所述的植物為鐵皮石斛、金線蓮、香蕉、番木瓜、白掌或蔓綠絨。
[0013]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)方法，將帶菌離體植物材料接種于植物固體培養(yǎng)基上，然后在植物固體培養(yǎng)基上層加入先鋒霉素溶液，再進(jìn)行組織培養(yǎng)。
[0014]優(yōu)選，所述的先鋒霉素溶液濃度為2000-2500mg/L，所述的先鋒霉素溶液在植物固體培養(yǎng)基上層形成的厚度為l-2mm。
[0015]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述的帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基在帶菌離體植物材料培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0016]優(yōu)選，所述的帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基在帶菌離體植物材料增殖、生根培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明選擇醫(yī)用的先鋒霉素針劑為使用的抗生素，無菌條件下將其配制成其高濃度(2000-2500mg/L)的無菌先鋒霉素溶液，無菌條件下將其添加到已經(jīng)滅菌冷卻凝固的植物固體培養(yǎng)基表面上，形成了固液兩相的培養(yǎng)方式來達(dá)到高效抑菌同時(shí)避免對(duì)離體培養(yǎng)材料的毒副作用，成功的解決了帶細(xì)菌的植物材料的組培苗生產(chǎn)過程中瓶頸問題，有效完成增殖、生根過程，生產(chǎn)出所需的植物組培苗。本發(fā)明利用高濃度的無菌先鋒霉素溶液，可以應(yīng)用于多種帶細(xì)菌的離體培養(yǎng)植物材料，可以在對(duì)離體培養(yǎng)材料增殖和生根生長(zhǎng)影響極低的條件下完成其組培苗工廠化生產(chǎn)過程，抑菌效率高，生產(chǎn)安全可靠，特別是對(duì)一些經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的蘭科植物的帶菌材料的組培苗生產(chǎn)十分有效，而且具有操作性強(qiáng)，生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0019]實(shí)施例1
[0020]1.材料:此實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)材料為帶菌的鐵皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)離體培養(yǎng)材料。
[0021]鐵皮石斛為我國(guó)常用名貴中藥，由于長(zhǎng)期無節(jié)制的采挖，加之本身繁殖率低，自然資源枯竭，現(xiàn)為國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的藥材品種。具有滋陰清熱。生津益胃，潤(rùn)肺止咳等功效，用于熱病傷津，口干煩燥，病后虛熱等多種病癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，石斛還具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力及擴(kuò)張血管的作用。鐵皮石斛原產(chǎn)區(qū)大多處于溫帶和亞熱帶，全年氣候溫暖、濕潤(rùn)，冬季氣溫在(TC以上。在進(jìn)行鐵皮石斛的規(guī)?；N植時(shí)，要根據(jù)鐵皮石斛的生長(zhǎng)習(xí)性，考慮場(chǎng)地的光照、溫度、濕度、通風(fēng)等多種自然因素進(jìn)行精細(xì)管理。目前鐵皮石斛的規(guī)?；a(chǎn)的種苗基本上來自于無菌播種。
[0022]2.無菌先鋒霉素溶液的配制
[0023]購(gòu)買醫(yī)用注射的先鋒霉素針劑若干瓶(每瓶Ig裝)。選用帶吸管的250mL滴瓶以及100mL的量筒清洗干凈，晾干后用報(bào)紙將其包裝好后于1.06kg/cm2(12rC)條件下滅菌20min，另用500mL的蘭花瓶注入300mL的無離子水，于1.06kg/cm2 (121 °C )條件下滅菌30min，獲得無菌水。將以上的藥品、器具、無菌水放置于超凈工作臺(tái)上，無菌條件下配制成2500mg/L的無菌先鋒霉素溶液，并將該無菌先鋒霉素溶液分裝于無菌的滴瓶中，用無菌牛皮紙將滴瓶的瓶頸部密封后放置4°C冰箱條件下保存待用。
[0024]3.培養(yǎng)基配制
[0025]根據(jù)培養(yǎng)材料鐵皮石斛組培苗生產(chǎn)的要求，分別配制其增殖培養(yǎng)基PB3和生根培養(yǎng)基
[0026]PR2。具體配方為:增殖培養(yǎng)基PB3:花寶I號(hào)1.5g/L+花寶2號(hào)1.5g/L+椰子乳200mL/L+活性炭2g/L+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖 15g/L+瓊脂6g/L;生根培養(yǎng)基PR2:花寶 I號(hào)lg/L+花寶2號(hào)lg/L+蛋白胨2g/L+NAA1.0mg/L+活性炭2g/L+體積分?jǐn)?shù)10% (終濃度)香蕉汁+蔗糖15g/L+瓊脂6g/L。以上兩種培養(yǎng)基均調(diào)整pH為5.4，然后于1.061^/0112(121°(:)條件下滅菌20min，冷卻待用。
[0027]所使用的花寶I號(hào)(HYPONeXI)為美國(guó)生產(chǎn)中國(guó)臺(tái)灣臺(tái)和園藝企業(yè)股份有限股份有限公司分裝產(chǎn)品?；▽?號(hào)(HYPONeX 2)為美國(guó)Haponex公司產(chǎn)品，其N: P: K = 20:20:20。
[0028]4.帶菌材料接種操作與培養(yǎng)
[0029]將無菌先鋒霉素溶液從冰箱取出放置超凈工作臺(tái)上，按正常的操作切割帶菌的鐵皮石斛離體培養(yǎng)材料，插植于增殖培養(yǎng)基PB3上，接著往增殖培養(yǎng)基PB3表面(上層)注入5mL的無菌先鋒霉素溶液，該溶液層厚度約為1_，形成了固液兩相的狀態(tài)，最后蓋上瓶蓋，完成接種操作。增殖培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為(25 ± 2) °C，光照強(qiáng)度I 500-2 OOOLx，光照12h/d。一般45天為I個(gè)繼代增殖周期，每I個(gè)繼代增殖周期后的增殖倍數(shù)為2?4倍。當(dāng)培養(yǎng)一個(gè)繼代周期后，鐵皮石斛離體培養(yǎng)材料的細(xì)菌在先鋒霉素溶液的作用下得到明顯的抑制，同時(shí)培養(yǎng)材料的增殖和生長(zhǎng)不受明顯的影響。以此為分化材料再次重復(fù)進(jìn)行以上的接種操作和添加先鋒霉素溶液于培養(yǎng)基的表面，蓋上瓶蓋，培養(yǎng);如此循環(huán)，可以達(dá)到平常無菌材料的組培苗生產(chǎn)效果。
[0030]按正常的操作切割待進(jìn)行生根培養(yǎng)的帶菌的鐵皮石斛離體培養(yǎng)材料，插植于生根培養(yǎng)基PR2上，接著往生根培養(yǎng)基PR2表面(上層)注入5mL的無菌先鋒霉素溶液，該溶液層厚度約為1mm，形成了固液兩相的狀態(tài)，最后蓋上瓶蓋，完成接種操作。生根壯苗培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為(26 ± 2) °C，光照度2 000-3 OOOLx，光照12h/d。生根壯苗培養(yǎng)周期為60-90天。生根培養(yǎng)基上的芽能夠正常的長(zhǎng)根和生長(zhǎng)，直至出瓶移栽。
[0031]5.組培苗移栽:當(dāng)生根組培苗長(zhǎng)至4?8厘米高時(shí)，在自然光照下煉苗10天。然后打開瓶塞，用鑷子把組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由樹皮和鋸末等量混合成的基質(zhì)中。注意澆水、遮蔭、保溫和保濕，成活率可達(dá)95%以上。
[0032]實(shí)施例2
[0033]1.材料:此實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)材料為帶菌的金線蓮(Anoectochilus roxburghii(wall)lindl.)離體培養(yǎng)材料。
[0034]金線蓮別名金線蘭、金絲草，是蘭科(Orchidaceae)開唇植物花葉蘭屬(Anoectochilus B1.)多年生珍稀草本植物，我國(guó)有23種左右，其中部分種全草民間作藥用，為傳統(tǒng)珍稀名貴中藥材，它在民間使用范圍較廣，多用于治療糖尿病、高血脂、乙型肝炎等疾病，素有“藥王”、”金草”、“神藥”、“烏人參”等美稱，被稱為“藥中之王”。
[0035]2.無菌先鋒霉素溶液的配制
[0036]購(gòu)買醫(yī)用注射的先鋒霉素針劑若干瓶(每瓶Ig裝)。選用帶吸管的250mL滴瓶以及100mL的量筒清洗干凈，晾干后用報(bào)紙將其包裝好后于1.06kg/cm2(12rC)條件下滅菌20min，另用500mL的蘭花瓶注入300mL的無離子水，于1.06kg/cm2 (121 °C )條件下滅菌30min，獲得無菌水。將以上的藥品、器具、無菌水放置于超凈工作臺(tái)上，無菌條件下配制成2000mg/L的無菌先鋒霉素溶液，并將該無菌先鋒霉素溶液分裝于無菌的滴瓶中，用無菌牛皮紙將滴瓶的瓶頸部密封后放置4°C冰箱條件下保存待用。
[0037]3.培養(yǎng)基配制
[0038]根據(jù)培養(yǎng)材料金線蓮組培苗生產(chǎn)的要求，分別配制其增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。具體配方為:增殖培養(yǎng)基:MS+6-BA 5.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蛋白胨2g/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L;生根培養(yǎng)基:MS+NAA1.0mg/L+活性炭2g/L+體積分?jǐn)?shù)10% (終濃度)香蕉汁+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L。以上兩種培養(yǎng)基均調(diào)整pH為5.4，然后于1.06kg/cm2(12rC)條件下滅菌20min，冷卻待用。
[0039]4.帶菌材料接種操作與培養(yǎng)
[0040]將無菌先鋒霉素溶液從冰箱取出放置超凈工作臺(tái)上，按正常的操作切割帶菌的金線蓮離體培養(yǎng)材料，插植于增殖培養(yǎng)基上，接著往增殖培養(yǎng)基表面(上層)注入1mL的先鋒霉素溶液，該溶液層厚度約為2mm，形成了固液兩相的狀態(tài)，最后蓋上瓶蓋，完成接種操作。增殖培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為(23±2)°C，光照強(qiáng)度I 500-2 OOOLx，光照10h/d。一般45天為I個(gè)繼代增殖周期，每I個(gè)繼代增殖周期后的增殖倍數(shù)為3?5倍。當(dāng)培養(yǎng)一個(gè)繼代周期后，金線蓮離體培養(yǎng)材料的細(xì)菌在先鋒霉素溶液的作用下得到明顯的抑制，同時(shí)培養(yǎng)材料的增殖和生長(zhǎng)不受明顯的影響。以此為分化材料再次重復(fù)進(jìn)行以上的接種操作和添加先鋒霉素溶液于培養(yǎng)基的表面，蓋上瓶蓋，培養(yǎng);如此循環(huán)，可以達(dá)到平常無菌材料的組培苗生產(chǎn)效果。
[0041]按正常的操作切割待進(jìn)行生根培養(yǎng)的帶菌的金線蓮離體培養(yǎng)材料，插植于生根培養(yǎng)基上，接著往生根培養(yǎng)基表面(上層)注入1mL的先鋒霉素溶液，該溶液層厚度約為2mm，形成了固液兩相的狀態(tài)，最后蓋上瓶蓋，完成接種操作。生根壯苗培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為(25 ± 2) °C，光照度2 000-3 OOOLx，光照10h/d。生根壯苗培養(yǎng)周期為60天。生根培養(yǎng)基上的芽能夠正常的長(zhǎng)根和生長(zhǎng)，直至出瓶移栽。
[0042]5.組培苗移栽:當(dāng)生根組培苗長(zhǎng)至5?8厘米高時(shí)，在自然光照下煉苗10天。然后打開瓶塞，用鑷子把組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和蛭石等量混合成的基質(zhì)中，移栽后用800倍多菌靈淋透。注意澆水、遮蔭、保溫和保濕，成活率可達(dá)95%以上。
[0043]實(shí)施例3
[0044]采用類似于實(shí)施例1和實(shí)施例2中的方法，將2000-2500mg/L的無菌先鋒霉素溶液用于香蕉、番木瓜、白掌或蔓綠絨的帶菌的離體培養(yǎng)材料，也都能達(dá)到正常的無菌離體培養(yǎng)材料的增殖、生根培養(yǎng)效果，組培苗移栽后的成活率均能達(dá)到95%以上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基，其特征在于，包括植物固體培養(yǎng)基及位于其上層的先鋒霉素溶液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基，其特征在于，所述的先鋒霉素溶液的濃度為2000-2500mg/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基，其特征在于，所述的先鋒霉素溶液在植物固體培養(yǎng)基上層形成的厚度為l_2mm。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基，其特征在于，所述的先鋒霉素溶液是將醫(yī)用先鋒霉素溶于無菌水而制備得到的。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基，其特征在于，所述的植物固體培養(yǎng)基是用于植物組織增殖或生根培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基，其特征在于，所述的植物為鐵皮石斛、金線蓮、香蕉、番木瓜、白掌或蔓綠絨。7.一種帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟:將帶菌離體植物材料接種于植物固體培養(yǎng)基上，然后在植物固體培養(yǎng)基上層加入先鋒霉素溶液，再進(jìn)行組織培養(yǎng)。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的先鋒霉素溶液濃度為2000-2500mg/L，所述的先鋒霉素溶液在植物固體培養(yǎng)基上層形成的厚度為1-2mmο9.權(quán)利要求1所述的帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基在帶菌離體植物材料培養(yǎng)中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，權(quán)利要求1所述的帶菌離體植物材料組織培養(yǎng)基在帶菌離體植物材料增殖、生根培養(yǎng)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK106069789SQ201610693912
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月19日 公開號(hào)201610693912.0, CN 106069789 A, CN 106069789A, CN 201610693912, CN-A-106069789, CN106069789 A, CN106069789A, CN201610693912, CN201610693912.0
【發(fā)明人】吳坤林, 曾宋君, 張建霞, 鄭楓, 段俊
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院華南植物園