一種多囊卵巢綜合征伴2型糖尿病大鼠模型的構建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多囊卵巢綜合征合并2型糖尿病大鼠模型的構建方法，屬于醫(yī)學動物模型技術領域。通過給予23日齡斷乳未成年雌性SD大鼠高脂高糖飼料飲食，并每日皮下注射相當于DHEA 60 μg/（g·d）的硫酸普拉睪酮鈉90 μg/（g·d） +0.4mL注射用水，連續(xù)20d；然后禁食12小時，再給予腹腔注射STZ 45mg/100mg體重一次，構建而成。本發(fā)明首次成功建立了PCOS伴2型糖尿病模型，該模型構建時間短，成功率高，試驗方法簡單易行，可重復性好，成本低廉，是理想的PCOS伴2型糖尿病模型。
【專利說明】
一種多囊卵巢綜合征伴2型糖尿病大鼠模型的構建方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學動物模型技術領域，具體涉及一種多囊卵巢綜合征合并2型糖尿 病大鼠模型的構建方法。
【背景技術】
[0002] 多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，P⑶S)是育齡婦女最常見的內 分泌失調性疾病，占生育期婦女的10%-15%。常表現(xiàn)為雄激素增高、排卵減少或停止、月經 稀少、多毛、痤瘡、肥胖及不孕等癥狀。近年來研究證明PC0S患者普遍存在糖和脂肪代謝異 常，約31%-35%的PC0S患者伴有糖耐量異常（IGT)，7%-10%伴有2型糖尿病，PC0S患者其2 型糖尿病的發(fā)生率是正常婦女的5-10倍，且發(fā)病時間也提前近30年。
[0003] 2006年外國學者提出PC0S女性"青春期發(fā)育亢進學說"由于青春期生長激素的分 泌量增加，使外周組織對胰島素的敏感性降低，導致體內胰島素水平升高，存在代償性的胰 島素抵抗，但在某些條件的誘導下，可能轉變?yōu)椴±硇砸葝u素抵抗，會持續(xù)到成年期，是 PC0S發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)。并且假性性早熟己被確定為女童日后發(fā)展為PC0S的高危因素。
[0004] Sprague Dawley大鼠（SD大鼠）垂體-腎上腺系統(tǒng)功能活躍，常作為垂體、卵巢等內 分泌以及腎上腺和應激反應等方面的實驗對象，對動物實驗研究來說經濟方便。并且SD大 鼠生長快速，且對性激素刺激敏感，廣泛用于藥理毒理、營養(yǎng)學及內分泌方面等研究。故以 剛離乳SD大鼠作為研究對象的建模方法符合PC0S的病理生理特征。Anderson等對脫氫表雄 酮(DHEA)誘導的PC0S大鼠進行動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)其超微結構改變首先是出現(xiàn)卵母細胞及透明 帶的消失，然后是空囊樣卵泡的形成。與人類PC0S的病理過程類似。并且DHEA造模法具有 時間短、成本低的優(yōu)勢，并且可模擬人類PC0S的內分泌改變和卵巢形態(tài)學改變。其機制是 DHEA促進卵泡膜細胞內睪酮的合成，使血清睪酮水平升高，而過高的雄激素干擾了卵泡的 生長成熟導致無排卵。研究結果顯示，單純DHEA誘導SD大鼠21天后，大鼠滿足高雄激素血 癥，胰島素抵抗的內分泌學改變以及卵巢的多囊樣改變等。造模結果基本具備了人類PC0S 的鹿特丹標準中PC0S病人的基本病理特征。
[0005] 2型糖尿病的動物模型多為化學藥物如鏈脲佐菌素(Strept〇Z〇t 〇Cin，STZ)損傷誘 導的糖尿病模型、高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量STZ誘導的糖尿病模型。STZ是一種廣譜抗生素， 具有抗菌、抗腫瘤的性能和致糖尿病的副作用，對一定種屬動物的胰島β細胞具有高度選擇 性的毒性作用，有研究顯示其致動物糖尿病的作用機制包括直接破壞胰島細胞、激活自身 免疫以及通過一氧化氮和自由基損傷等。低劑量的STZ誘導鼠類辟田胞系INS-1凋亡，高劑量 則導致其壞死等。但單純STZ注射造模，STZ劑量不易控制，且容易建立與人類1型糖尿病表 現(xiàn)相似的動物模型，導致成模率及穩(wěn)定性較難控制;高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量STZ誘導的糖 尿病模型具有類似人類2型糖尿病發(fā)病機制的特點，是一種理想的2型糖尿病動物模型。
[0006] 雖然PC0S大鼠模型及2型糖尿病大鼠模型構建技術已經十分成熟，但迄今尚未見 國內外關于PC0S伴2型糖尿病大鼠模型的相關報道。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明針對PC0S伴2型糖尿病實驗技術的空白，提供一種PC0S伴2型糖尿病大鼠模 型極其造模方法，公開了一種PC0S合并2型糖尿病的大鼠模型的制備方法。
[0008] 實驗步驟如下：
[0009] 1、取21日齡斷乳未成年雌性SD大鼠，喂以顆粒飼料，自由飲水，適應性喂養(yǎng)2天； [00 10] 2、23日齡開始，給予高脂高糖飼料飲食，并每日皮下注射相當于DHEA 60yg/(g · d)的硫酸普拉睪酮鈉(注射用硫酸普拉睪酮鈉，揚州奧賽康藥業(yè)有限公司產品）90yg/(g· d) +0.4mL注射用水，連續(xù)20天；
[0011]高脂高糖飼料自行配制，基本配方如下:基礎飼料66.5%，鹿糖20%，豬油10%，膽 固醇2.5%，膽酸鈉1 %;
[0012] 3、20天構造 PC0S大鼠模型結束后，所有大鼠禁食12小時，再給予PC0S伴2型糖尿病 模型組腹腔注射STZ 45mg/kg體重一次；
[0013] 在本發(fā)明的一個實施例中將PC0S伴2型糖尿病、P⑶S大鼠模型與正常大鼠模型進 行了對比：
[0014] 將大鼠分為3組，分別為PC0S伴2型糖尿病組，PC0S組以及正常對照組，每組分別10 只。P⑶S伴2型糖尿病組大鼠給予高脂高糖飼料飲食，并每日皮下注射相當于DHEA 60yg/ (g · d)的硫酸普拉睪酮鈉(注射用硫酸普拉睪酮鈉，揚州奧賽康藥業(yè)有限公司產品）90yg/ (g · d) +0.4mL注射用水，連續(xù)20d JC0S組大鼠給予普通飼料飲食，并每日皮下注射硫酸普 拉睪酮鈉90yg/(g · d)+0.4ml注射用水，連續(xù)20d。正常對照組給予普通飼料飲食，并同期每 日皮下注射〇.4ml注射用水，20天構造 PC0S大鼠模型結束后，所有大鼠禁食12小時，再給予 PC0S伴2型糖尿病模型組腹腔注射STZ 45mg/kg體重一次，PC0S組及對照組注射等量檸檬酸 鹽緩沖液。于注射后72小時大鼠用6 %水合氯醛麻醉，打開腹腔，直視下采三組大鼠下腔靜 脈血，取三組胰腺組織及雙側卵巢組織。測定大鼠血清性激素和空腹血糖胰島素，并對大鼠 卵巢及部分胰腺組織進行常規(guī)石蠟包埋切片。用于HE染色觀察卵巢和胰腺的病理結構。
[0015] 目前國內外學者多采用90天高脂飲食誘導胰島素抵抗后予以小劑量STZ(30mg/ kg)的方法建立2型糖尿病大鼠模型。但由于PC0S大鼠模型經過20天連續(xù)硫酸普拉睪酮鈉注 射后和高脂飲食喂養(yǎng)后通常已經表現(xiàn)為胰島素抵抗，故在誘導PC0S后予以STZ低劑量腹腔 注射誘導大鼠血糖濃度及胰島素水平明顯增高符合2型糖尿病特點，其卵巢改變及性激素 水平亦符合PC0S的特征，提示硫酸普拉睪酮鈉聯(lián)合高脂高糖飼料+STZ可復制與人類相似的 PC0S伴2型糖尿病模型的特點。本發(fā)明首次成功建立了PC0S伴2型糖尿病模型，該模型構建 時間短，成功率高，試驗方法簡單易行，可重復性好，成本低廉。是理想的PC0S伴2型糖尿病 模型。
【附圖說明】
[0016] 圖1為HE染色觀察卵巢的病理結構；
[0017] 圖la為PC0S伴2型糖尿病組卵巢組織，圖lb為PC0S組卵巢組織，圖lc為對照組卵巢 組織，（HE*200);
[0018]圖2為HE染色觀察胰腺的病理結構；
[0019] 圖2a為PC0S伴2型糖尿病組胰腺組織，圖2b為PC0S組胰腺組織，圖2c為對照組胰腺 組織，（HE*200);
【具體實施方式】
[0020] 通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施 例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內容。
[0021 ]注射用硫酸普拉睪酮鈉，揚州奧賽康藥業(yè)有限公司產品；STZ購自美國Sigma公司。 [0022]高脂高糖飼料自行配制，基本配方如下:基礎飼料66.5%，蔗糖20%，豬油10%，膽 固醇2.5%，膽酸鈉1 %。
[0023]臨用前以0. lmmol/L，PH4.2的檸檬酸鹽緩沖液溶解，新鮮配成1 % STZ溶液，經濾菌 器除菌。
[0024]【實施例1】將PC0S伴2型糖尿?。ê喎QPC0S伴2型DM組）、PC0S大鼠模型與正常大鼠 模型進行了對比
[0025] 1、適應性喂養(yǎng)
[0026] 取21日齡斷乳未成年雌性SD大鼠，喂以顆粒飼料，自由飲水，適應性喂養(yǎng)2天。
[0027] 2、模型構建
[0028] 23日齡開始，將大鼠分為3組，分別為PC0S伴2型糖尿病組，P⑶S組以及正常對照 組，每組分別10只。P⑶S伴2型糖尿病組大鼠給予高脂高糖飼料飲食，并每日皮下注射相當 于DHEA 60yg/(g · d)的硫酸普拉睪酮鈉(注射用硫酸普拉睪酮鈉，揚州奧賽康藥業(yè)有限公 司產品）90yg/ (g · d) +0.4mL注射用水，連續(xù)20d。PC0S組大鼠給予普通飼料飲食，并每日皮 下注射硫酸普拉睪酮鈉90yg/(g · d)+0.4ml注射用水，連續(xù)20d。正常對照組給予普通飼料 飲食，并同期每日皮下注射〇.4ml注射用水，20天構造 PC0S大鼠模型結束后，所有大鼠禁食 12小時，再給予PC0S伴2型糖尿病模型組腹腔注射新鮮配制的STZ，45mg/kg體重一次，P⑶S 組及對照組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。
[0029] 3、獲取樣本
[0030]于注射后72小時大鼠用6%水合氯醛麻醉，打開腹腔，直視下采三組大鼠下腔靜脈 血，取三組胰腺組織及雙側卵巢組織。測定大鼠血清性激素和空腹血糖胰島素，并對大鼠卵 巢及部分胰腺組織進行常規(guī)石蠟包埋切片。用于HE染色觀察卵巢和胰腺的病理結構。
[0031] 4、結果
[0032] PC0S伴2型糖尿病組及PC0S組（圖la及l(fā)b)可見卵巢皮質內各級發(fā)育期卵泡;較多 早期發(fā)育的小卵泡和閉鎖卵泡黃體少見，黃體數(shù)量明顯下降并伴有不完全的黃素化?？梢?多個囊泡，閉鎖卵泡常見，卵泡多呈囊性擴張，卵泡內卵母細胞或放射冠消失，顆粒細胞層 數(shù)減少(多為2~3層），排列疏松;對照組（圖lc)大鼠卵巢鏡下見發(fā)育各個時期的卵泡和黃 體;顆粒細胞形態(tài)完整，排列整齊，多為8~9層;卵泡膜細胞、間質細胞未見增生。
[0033] PC0S伴2型DM組（圖2a)胰腺中胰島少見;胰島萎縮，小胰島多見，胰島都遭到破壞， 細胞核變形;胰島同周圍腺泡界限不清;而對照組（圖2c)中胰腺中胰島數(shù)量多;胰島大小均 一，形狀規(guī)則，胰島細胞較整齊;胰島界限清楚，同周圍腺泡界限分明，沒有病理改變。PC0S 組的表現(xiàn)介于正常組與PC0S伴2型DM組之間（圖2b)。
[0034] PC0S伴2-DM組大鼠空腹血糖(FBG)均彡16.7mmol/L，且評價胰島素抵抗的Η0ΜΑ指 數(shù)，空腹胰島素水平(FINS)與對照組相比明顯增高，差距存在統(tǒng)計學意義(P〈0.05)，提示該 組糖尿病模型造模成功。同時，P⑶S組的HOMA-IR指數(shù)與對照組相比亦明顯升高(P〈0.05)， 說明PCOS組的大鼠本身亦存在胰島素抵抗。結果如表1所示。PCOS組及PCOS伴2-DM組大鼠血 清睪酮(T)與雌二醇(E2)水平顯著高于對照組(P〈0.05)，而PCOS組及PCOS伴2-DM組之間無 顯著的統(tǒng)計學意義(見表1)。
[0035] 表1造 t旲完成后各組大鼠空腹的各項指標(x±s)
[0036]
[0037] 注:與對照組相比:*P<0.05
[0038] 參考文獻：
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【主權項】
1. 一種多囊卵巢綜合征合并2型糖尿病大鼠模型的構建方法，其特征在于，包括如下步 驟： 1) 取21日齡斷乳未成年雌性SD大鼠，喂以顆粒飼料，自由飲水，適應性喂養(yǎng)2天； 2) 23日齡開始，給予高脂高糖飼料飲食，并每日皮下注射相當于DHEA 60yg/(g · d)的 硫酸普拉睪酮鈉90yg/(g · d)+0.4mL注射用水，連續(xù)20天； 高脂高糖飼料自行配制，基本配方如下：基礎飼料66.5%，鹿糖20%，豬油10%，膽固醇 2.5%，膽酸鈉1 %; 3) 20天構造多囊卵巢綜合征大鼠模型結束后，所有大鼠禁食12小時，再給予腹腔注射 新鮮配制的鏈脲佐菌素45mg/kg體重一次，72小時后完成建模。
【文檔編號】A61K31/5685GK106070064SQ201610550241
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月13日
【發(fā)明人】楊菁, 李賽姣, 周丹妮, 李維
【申請人】武漢大學