專利名稱：脫氧核糖核苷三磷酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人工合成DNA技術(shù)，特別是涉及人工合成DNA的必備前體原料的方法。
眾所周知，脫氧核糖核苷三磷酸(DNTP)是人工合成DNA的必備前體原料，根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同，DNTP可分為DATP、DCTP、DGTP和DTTP。人工合成DNA片斷(基因)廣泛應(yīng)用于基因工程、分子生物學(xué)、生命科學(xué)、基因藥物等方面。DNTP的制備研究曾有不少報(bào)道，如Chemical Abstract88，117297；ChemicalAbstract89，180281；Acta.Biochim.biophys.Acad.Sci.Hung.16，131-3(1981)。但所有這些方法均有一定的缺陷，大部分的生物生產(chǎn)方法的合成量在1mmol以下，化學(xué)法合成有的后處理相當(dāng)困難，有的還需要使用大量的毒性較大的有機(jī)溶劑。
本發(fā)明的目的在于提供一種利用酶解-酶促-化學(xué)合成工藝制備脫氧核糖核苷三磷酸的方法。
本發(fā)明所述脫氧核糖核苷三磷酸的制備方法包括以下步聚DNMP酶制備的培養(yǎng)基組成細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5-10％、蛋白胨0.5-2％、磷酸二氫鉀4-6％、磷酸氫二鉀2-5％、葡萄糖10-15％、尿素0.5-3％、氯化鈣0.2％、氯化鋅0.2％，培養(yǎng)基經(jīng)1.2公斤/平方厘米的蒸汽滅菌消毒后，接種，接種量為20-30％，50℃下強(qiáng)烈攪拌培養(yǎng)10-30小時(shí)，在1℃下離心收集菌體；菌體經(jīng)高速攪拌后，用PH2-7的緩沖液萃取，緩沖液可以用檸檬酸鈉-氫氧化鈉-鹽酸、氯化鉀-鹽酸、乙酸-乙酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉、磷酸氫二鈉-檸檬酸、鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉等，萃取液不經(jīng)純化可直接使用。
商品DNA分散在水中制得DNA水溶液，DNA可分別來(lái)自于鯨魚(yú)精、鮭魚(yú)精、鯉魚(yú)精、牛肝、牛胸腺等。在DNA溶液中加入鋅離子使其濃度達(dá)到2×10-2-1×10-4M，鋅離子可由乙酸鋅、氯化鋅、硫酸鋅等提供。根據(jù)脫氧核糖核酸酶的活性加入其量，一般為DNA溶液量的二十——五十分之一。酶解在30-55℃下進(jìn)行；酶解5-15小時(shí)。
DNMP水溶液用10M的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)PH為4-8，加入磷酸鹽，如磷酸肌酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、PEP等；再加入金屬離子，如硫酸鋅、氯化鋅、乙酸鋅、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鎂、氯化鋇，用ATP作催化劑，根據(jù)DNMP酶的活性加入DNMP酶，一般為每毫摩爾DNMP加入40-60單位酶。50-55℃保溫48-96小時(shí)。
酶促反應(yīng)完成后，加入等量的醇類溶劑，如甲醇、乙醇、丁醇、丁氧基乙醇，2-5倍量的磷酸或磷酸鹽，20-40倍量的DCC，80-90℃下反應(yīng)4-8小時(shí)。
DNTP合成完成后，得到的溶液為磷酸鹽，DNMP、DNDP、DNTP和多磷化合物的混合溶液，該溶液經(jīng)過(guò)層析分離可得到純凈的DNTP。
本發(fā)明采用酶解-酶促-化學(xué)合成全新工藝線路，采用天然DNA經(jīng)溶液態(tài)脫氧核糖核酸酶的酶解可得到DNMP，DNMP的收率為70-90％。DNMP在經(jīng)DNMP酶反應(yīng)一步后結(jié)合化學(xué)反應(yīng)，可分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的DNTP，DNTP經(jīng)層析法純化，以鈉鹽或鋇鹽的形式沉淀分離。利用該方法得到的DNTP純度為95％-97％。可滿足DNA合成的需要。以DNA為原料計(jì)算，DNTP的總收率為45-80％。本發(fā)明不僅使DNTP的生產(chǎn)工藝變的簡(jiǎn)單，而且使生產(chǎn)量達(dá)到了摩爾級(jí)，適用于工業(yè)大量生產(chǎn)，并且污染性極小。
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明說(shuō)明如下實(shí)施例1100克商品鯨魚(yú)精DNA分散在水中制得濃度為1％的DNA水溶液。DNA還可分別來(lái)自于鮭魚(yú)精、魯魚(yú)精、牛肝、牛胸腺等。在DNA溶液中加入氯化鋅1.5克。加入脫氧核糖核酸酶(550單位/毫升)250毫升。酶解在30-50℃下進(jìn)行。酶解時(shí)間10小時(shí)。酶解過(guò)程中有白色沉淀生成，酶解完成后，冷凍過(guò)夜，過(guò)濾除去沉淀。上清液層析分離。層析條件色層柱150×1000mm，100-200目陰離子交換樹(shù)脂(Cl-)，解析液0.01N鹽酸，流速200-250毫升/分鐘。得到的DNMP蒸發(fā)濃縮，以鈉鹽形式沉淀，沉淀為白色粉末，DAMP23.3克，DCMP26.5克，DGMP22.1克，DTMP18.8克，總收率90.7％。
DNMP酶制備細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物10％、蛋白胨0.5％、磷酸二氫鉀4％、磷酸氫二鉀4％、葡萄糖10％、尿素3％、氯化鈣0.2％、氯化鋅0.2％，余量為水溶液。培養(yǎng)基經(jīng)1.2公斤/平方厘米的蒸汽滅菌消毒后，接種，接種量為20-30％，50℃下強(qiáng)烈攪拌培養(yǎng)24小時(shí)，在1℃下離心收集菌體。菌體經(jīng)高速攪拌后，用PH2.8的磷酸氫二鈉——檸檬酸緩沖液萃取，萃取液不經(jīng)純化可直接使用。
20克(約6mmol)DNMP溶于500毫升水中，溶液用10M的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)PH為4.2-4.4，加入磷酸氫二鈉1.45克(10mmol)，再加入硫酸鋅30毫克、ATP50毫克，加入300單位DNMP酶。50-55℃保溫72小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加溫至90℃10分鐘，冷凍，離心除去沉淀。上清液蒸發(fā)濃縮至200毫升，備用。
在上述得到的溶液中加入等體積的乙醇，2.5倍量的正磷酸，20倍量的DCC，80-90℃下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾除去沉淀，蒸發(fā)除去溶劑，殘留物溶于10升水中，層析分離。層析條件色層柱100×1000mm，200-400目陰離子交換樹(shù)脂(Cl-)，解析液0.1N鹽酸，流速50-80毫升/分鐘。得到的DNTP蒸發(fā)濃縮，以鈉鹽形式沉淀，沉淀為白色粉末，DATP25.5克，DCMP24.1克，DGMP20.7克，DTMP26.2克，本步收率約67％，以DNA為起始原料計(jì)算，總收率60％。
實(shí)施例2DNMP的制備、DNMP和DNTP的層析分離同實(shí)施例1。
DNMP酶制備細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5％、蛋白胨2％、磷酸二氫鉀2％、磷酸氫二鉀2％、葡萄糖10％、尿素1％、氯化鈣0.2％、氯化鋅0.2％，余量為水溶液。培養(yǎng)基經(jīng)1.2公斤/平方厘米的蒸汽滅菌消毒后，接種，接種量為20-30％，50℃下強(qiáng)烈攪拌培養(yǎng)12小時(shí)，在1℃下離心收集菌體。菌體經(jīng)高速攪拌后，用PH4.9的磷酸氫二鈉——磷酸二氫鉀緩沖液萃取，萃取液不經(jīng)純化可直接使用。
20克(約6mmol)DNMP溶于500毫升水中，溶液用10M的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)PH為5.5-5.8，加入磷酸肌酸鈉3.27克(10mmol)，再加入氯化鈣50毫克、ATP100毫克，加入220單位DNMP酶。50-55℃保溫48小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加溫至90℃10分鐘，冷凍，離心除去沉淀。上清液蒸發(fā)濃縮至200毫升，備用。
在上述得到的溶液中加入等體積的乙醇，3倍量的正磷酸，25倍量的DCC，80-90℃下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾除去沉淀，蒸發(fā)除去溶劑，殘留物溶于10升水中，層析分離。最終得DATP27.4克，DCMP29.1克，DGMP24.4克，DTMP22.8克，本步收率約72％，以DNA為起始原料計(jì)算，總收率65％。
實(shí)施例3DNMP的制備、DNMP和DNTP的層析分離同實(shí)施例1。
DNMP酶的制備同實(shí)施例2。
20克(約6mmol)DNMP溶于500毫升水中，溶液用10M的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)PH為6.5-6.8，加入磷酸肌酸鈉4.91克(15mmol)，再加入氯化鎂40毫克、ATP100毫克，加入250單位DNMP酶。50-55℃保溫48小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加溫至90℃10分鐘，冷凍，離心除去沉淀。上清液蒸發(fā)濃縮至200毫升，備用。
在上述得到的溶液中加入等體積的乙醇，4倍量的正磷酸，35倍量的DCC，80-90℃下反應(yīng)8小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾除去沉淀，蒸發(fā)除去溶劑，殘留物溶于10升水中，層析分離。最終得DATP29.6克，DCMP32.4克，DGMP25.2克，DTMP28.7克，本步收率約80.5％，以DNA為起始原料計(jì)算，總收率約72.5％。
權(quán)利要求
1.一種脫氧核糖核苷三磷酸的制備方法，包括以下步驟(1)酶解DNMP酶制備的培養(yǎng)基的基本組成和含量為5-10％的細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物、0.5-2％的蛋白胨、4-6％的磷酸二氫鉀、2-5％的磷酸氫二鉀、10-15％的葡萄糖、0.5-3％的尿素、0.2％的氯化鈣、0.2％的氯化鋅，余量為水溶液；以上培養(yǎng)基經(jīng)滅菌、接種、收集和萃取直接獲得；萃取液不經(jīng)純化可直接使用；將商品DNA分散在水中制得DNA水溶液，在所述DNA溶液中加入鋅離子使其濃度達(dá)到2×10-2-1×10-4M，根據(jù)脫氧核糖核酸酶的活性加入其量，酶解在30-55℃下進(jìn)行；酶解5-15小時(shí)；(2)酶促DNMP水溶液用10M的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)PH為4-8，加入磷酸鹽，再加入金屬離子，用ATP作催化劑，根據(jù)DNMP酶的活性加入DNMP酶，50-55℃保溫48-96小時(shí)；(3)化學(xué)合成酶促反應(yīng)完成后，加入等量的醇類溶劑，2-5倍量的磷酸或磷酸鹽，20-40倍量的DCC，80-90℃下反應(yīng)4-8小時(shí)；所得混合液為磷酸鹽，DNMP、DNDP、DNTP和多磷化合物；該溶液經(jīng)過(guò)層析分離可得到純凈的DNTP。
2.如權(quán)利要求1所述的脫氧核糖核苷三磷酸的制備方法，其特征在于培養(yǎng)基經(jīng)1.2公斤/平方厘米的蒸汽滅菌消毒后，接種，接種量為20-30％，50℃下強(qiáng)烈攪拌培養(yǎng)10-30小時(shí)，在1℃下離心收集菌體；菌體經(jīng)高速攪拌后，用PH2-7的緩沖液萃取。
3.如權(quán)利要求2所述的脫氧核糖核苷三磷酸的制備方法，其特征在于緩沖液可以是檸檬酸鈉-氫氧化鈉-鹽酸、氯化鉀-鹽酸、乙酸-乙酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉、磷酸氫二鈉-檸檬酸、鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉；
4.如權(quán)利要求1所述的脫氧核糖核苷三磷酸的制備方法，其特征在于加入脫氧核糖核酸酶一般為DNA溶液量的二十——五十分之一。
5.如權(quán)利要求1所述的脫氧核糖核苷三磷酸的制備方法，其特征在于磷酸鹽可以采用磷酸肌酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、PEP；金屬離子可以用硫酸鋅、氯化鋅、乙酸鋅、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鎂、氯化鋇。
6.如權(quán)利要求1所述的脫氧核糖核管三磷酸的制備方法，其特征在于醇類溶劑可以是甲醇、乙醇、丁醇、丁氧基乙醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及人工合成DNA的必備前體原料的制備方法。本發(fā)明采用酶解—酶促—化學(xué)合成全新工藝。采用天然DNA經(jīng)溶液態(tài)脫氧核糖核酸酶的酶解可得到DNMP,DNMP收率為70—90%。DNMP在經(jīng)DNMP酶反應(yīng)一步后結(jié)合化學(xué)反應(yīng),可分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的DNTP,經(jīng)層析法純化,以鈉鹽或鋇鹽的形式沉淀分離,可以得到純度為95%—97%的DNTP。本發(fā)明不僅使DNTP的生產(chǎn)工藝變的簡(jiǎn)單,而且使生產(chǎn)量達(dá)到了摩爾級(jí),適于工業(yè)生產(chǎn),并且污染性極小。
文檔編號(hào)C12P19/38GK1269422SQ0010084
公開(kāi)日2000年10月11日 申請(qǐng)日期2000年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月17日
發(fā)明者郭煥芳 申請(qǐng)人:郭煥芳