專利名稱：編碼新的氨肽酶的dna分子和生產該氨肽酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼新的、源于大豆的氨肽酶的DNA分子，含有該DNA分子的重組表達載體，被該重組表達載體轉化了的轉化體，和采用該轉化體生產氨肽酶的方法采用酸諸如鹽酸和硫酸或從微生物、例如曲霉屬，中分離得到的現(xiàn)存蛋白酶，大豆蛋白質通常被水解成氨基酸。
然而，當采用酸性蛋白酶解來獲得適于作為天然調味品的大豆蛋白的蛋白酶解產物時，反應必須在100℃下進行一天或兩天。如此高溫下的反應進行如此長的時間，將引起高能耗的問題。盡管蛋白的酸性水解很容易進行，但卻另外存在著過分解(降解)和由中和反應引起的高鹽含量的問題。
為了解決這些問題，建議在溫和的反應條件下，采用現(xiàn)存蛋白酶分解大豆蛋白。特別是，由于是溫和反應條件下的生物學反應的分解過程，希望采用蛋白水解酶(蛋白酶)將大豆蛋白水解成氨基酸成為替代酸性水解的化學反應的可取方法。
然而，當?shù)鞍滋幱谔烊粻顟B(tài)，豆科植物中的貯存蛋白通常對現(xiàn)存蛋白酶具有很高的耐性。由于現(xiàn)有蛋白酶諸如木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶通常是肽鏈內切酶，盡管它們能將蛋白分解為肽，但僅使用這些蛋白酶將蛋白完全分解成氨基酸是困難的。另外，由于味苦，由此獲得的產品實際上不能用作調味品。
人們已經考慮到，也能將肽分解成氨基酸的肽鏈內切酶和肽鏈端解酶諸如氨肽酶和羧肽酶的結合對解決上述問題是有效的。
另一方面，據(jù)報導，亮氨酸氨肽酶和酸性羧肽酶在采用曲霉屬分解大豆蛋白中，例如在醬油的釀造[Tadanobu Nakadai，“Shoken”Vol.11，No.2(1985)]中，對于增加游離氨基酸的含量是重要的。然而，如這篇報告中所提出的，醬油仍然含有序列中含有酸性氨基酸的二肽和三肽，因此指出它們分解的困難性。二肽和三肽也包括N-末端具有谷氨酸或天門冬氨酸的肽。
肽分解的困難性表現(xiàn)在肽酶相對這些肽的底物特異性很低。除了在醬油釀造中，采用從曲霉屬中分離的肽酶分解肽時遇到的困難問題外，從市場上買到的肽酶制劑也有問題，這就是微生物酶，諸如得自于曲霉屬的酶，對于含有酸性氨基酸的二肽和三肽的分解活性也很低。
在這些情況下，發(fā)明人試圖通過采用大豆子葉解決上述問題。即，大豆籽中的貯存蛋白在種籽發(fā)芽過程中非常短的時間內被水解成氨基酸。從這一現(xiàn)象出發(fā)，假設能輕易水解貯存蛋白中難于水解的肽的肽酶存在于發(fā)芽大豆中。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在發(fā)芽大豆子葉中的這種肽酶(氨肽酶GX和亮氨酸氨肽酶，能夠有效水解含有酸性氨基酸的肽)，并且在有效地水解大豆蛋白方面獲得了成功[日本未審公開專利申請(下文稱作“JP-Kokai”)No.9-294583]。
然而，由于這些子葉中的大豆氨肽酶GX的含量非常低，所以從發(fā)芽大豆子葉的提取物中獲得大量的大豆氨肽酶GX是困難的。
在解決上述問題的方法之一中，氨肽酶基因通過基因重組技術得到了高表達，該重組技術通過采用系統(tǒng)而不是大豆，獲得了大量的氨肽酶。實施這一方法的關鍵是要得到編碼氨肽酶的cDNA和分析DNA序列，來得到氨肽酶的氨基酸全序列的信息。
將編碼氨肽酶的DNA重組到一個合適的表達載體上，從而獲得能夠大量生產目的產物的轉化體也是必不可少的。
本發(fā)明是在這些情況下完成的。本發(fā)明的目的是提供一種采用基因重組技術進行有效的基因表達和大量生產氨肽酶的技術，其可用來取代上述從天然獲得的發(fā)芽大豆子葉中分離氨肽酶的原始方法。
在為了解決上述問題而進行的大量研究后，通過以稻谷植物EST作為具有與氨肽酶GX高度同源的內氨基酸序列的探針，篩選制備于發(fā)芽大豆的芽的mRNA的cDNA文庫，發(fā)明人成功地獲得了編碼氨肽酶GX的cDNA。
在進一步研究后，發(fā)明人成功地獲得了能夠由如此獲得的cDNA形成氨肽酶的轉化體，然后獲得具有氨肽酶活性的蛋白。
即，本發(fā)明提供如下(1)一個編碼源于發(fā)芽大豆子葉且具有序列表中的SEQ ID No1氨基酸序列的、新的氨肽酶的DNA分子。
(2)含有所述DNA分子的重組DNA分子。
(3)被所述重組DNA分子轉化了的轉化體。
(4)生產具有氨肽酶活性的蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)轉化體來生產具有氨肽酶活性的蛋白，并回收。
為了解決上述問題，進行了大量的研究，通過以稻谷植物EST作為具有與氨肽酶GX高度同源的內氨基酸序列的探針，篩選制備于發(fā)芽大豆芽的mRNA的cDNA文庫，發(fā)明人成功地獲得了編碼氨肽酶GX的cDNA。


圖1.表示構建質粒pUCTRPGXN1-8的策略。
圖2.表示構建GX表達質粒pUCTRPGX1-8的策略。
圖3.表示構建質粒pUCTRPGXN2-1的策略。
圖4.表示構建GX表達質粒pUCTRPGX2-1的策略。
本發(fā)明提供如下(1)一個編碼源于發(fā)芽大豆子葉且具有序列表中的SEQ ID No1的氨基酸序列的、新的氨肽酶的DNA分子。
(2)(1)中的DNA分子的變異體，其編碼具有SEQ ID No1的氨基酸序列的蛋白的變異體，其中SEQ ID No1的氨基酸序列中插入、增加、刪除或取代了一個或多個氨基酸殘基。
(3)(1)中的DNA分子，其具有序列表中的SEQ ID No2中第22個堿基到第1428個堿基的DNA序列。
(4)含有(1)到(3)中任意一個的DNA分子的重組DNA分子。
(5)被重組DNA分子轉化了的轉化體。
(6)生產具有氨肽酶活性的蛋白的方法，包括培養(yǎng)轉化體來生產具有氨肽酶活性的蛋白，并回收。
本發(fā)明將作出更加詳細的說明。下文中，氨肽酶GX將被稱作“GX”。
<1>本發(fā)明的DNA分子本發(fā)明的cDNA能夠通過，例如一種普通的方法獲得，該方法中在已經測出的GX的氨基酸序列的基礎上合成寡聚-DNA，通過采用從發(fā)芽大豆的子葉或其另外部分中提取的mRNA作為RT-PCR方法的模板來制備基因片段，以基因片段為探針，從制備于以發(fā)芽大豆的子葉或另外部分的mRNA作為模板的cDNA文庫中，通過雜交來克隆GX的cDNA。
在另外一種可行的方法中，從合適的DNA數(shù)據(jù)庫諸如DDBJ、EMBL或GenBank中檢索到與將GX的已測的氨基酸序列進行編碼的DNA序列高度同源的一個DNA序列，以從發(fā)芽大豆的子葉或另外部分中提取的mRNA為模板來制備cDNA文庫，以相應序列的DNA片段作為探針來篩選cDNA文庫以便獲得GX的cDNA。
用于提取GX的mRNA的發(fā)芽大豆的種類不限。即種植地區(qū)和大豆的品種不受限制。市場上買到的那些用作榨豆油的原料的大豆等也可以使用。而且，發(fā)芽的方法、培養(yǎng)條件、階段(發(fā)芽的或未發(fā)芽的)和它們發(fā)芽的持續(xù)時間也不受限制。然而，優(yōu)選地使用經水浸泡后生長7到10天所獲得的發(fā)芽大豆。
cDNA探針也可在測得的氨基酸序列的基礎上，通過采用從發(fā)芽大豆子葉的子葉或另外部分中提取的mRNA，以RT-PCR方法或類似方法來制備；或在所述氨基酸序列的基礎上，通過化學合成來制備。與所述氨基酸序列高度同源的DNA序列即可用作探針，而不需考慮DNA序列的來源和基因產品的功能。即，DNA序列不需限定到已知氨肽酶的DNA序列；具有未知功能的基因產品也可使用。并且EST(表達序列的標記)也可使用。下面給出的的實施例中，源于稻谷植物根部的EST被作為探針。cDNA文庫可通過一般的方法制備。
因此，可以獲得編碼源于發(fā)芽大豆子葉且具有序列表中SEQ ID No1氨基酸序列的新氨肽酶的DNA分子。本發(fā)明的DNA分子可以是編碼序列表中具有SEQ ID No1氨基酸序列的蛋白的DNA分子，該SEQ ID No1氨基酸序列中被插入、增加、刪除或取代了一個或多個氨基酸殘基，由該DNA分子編碼的蛋白具有氨肽酶活性。
通過進一步研究，發(fā)明人成功地獲得了能夠由如此獲得的cDNA形成氨肽酶的轉化體，然后獲得了具有氨肽酶活性的蛋白。
<2>本發(fā)明的重組DNA分子由此獲得的cDNA被組合到表達載體上，從而獲得重組DNA分子。所使用的載體沒有特別的限制。載體可以是在宿主細胞中能夠自我復制的載體或能夠被以多于一個拷貝的方式插入到染色體上的載體。該載體必須具有一個可被插入上述DNA，即GX基因的插入位點和進一步具有一個允許插入的DNA在宿主細胞中表達的區(qū)域。
插入到載體的GX基因不僅僅被限定在cDNA而且也包括為編碼由cDNA推導出的GX的氨基酸序列所設計的DNA片段。退火后，通過連接采用自動DNA合成儀合成的寡核苷酸，可容易地合成由這樣一種氨基酸序列推導出的基因。
在另外一種方法中，GX以與一種與異種蛋白結合的融合蛋白的形式被表達并生產。例如，GX可在大腸桿菌(E.coli)中以通過pGEX系統(tǒng)(AmershamPharmacia Biotech.Co.的一種產品)或類似系統(tǒng)與谷胱甘肽-S-轉移酶相結合的融合蛋白形式被生產。
至于表達GX基因的啟動子，通常使用用于表達異源蛋白的強啟動子。GX基因的下游可引入終止子。啟動子的例子包括，例如trp、tac、lac、trc、λPL和T7，終止子包括，例如tpA、lpp和T4。
為了使翻譯更加有效，SD序列的種類和數(shù)目，和堿基組成、序列和SD序列與起始密碼間的區(qū)域長度優(yōu)選地被優(yōu)化成適于GX基因的表達。
表達GX所需的啟動子與翻譯起始位點間的區(qū)域可通過已知的PCR方法或化學合成方法來制備。序列的例子如SEQ ID No3所示。
本發(fā)明的重組DNA分子可通過將上述含有GX基因的DNA片段插入到決定于要使用的表達系統(tǒng)所選擇的已知表達載體中。本文中的表達載體優(yōu)選地是多拷貝載體。
用于制備本發(fā)明的重組DNA分子的已知載體是pUC18、pHSG299等。本發(fā)明的重組DNA分子的實例是pUCTRPGX1-8，其通過將本發(fā)明的DNA重組分子組合到pUC18上而獲得。
<3>本發(fā)明的轉化體將描述通過引入上述重組DNA分子而獲得的各種轉化體。
可被轉化為轉化體的細胞為細菌，諸如大腸桿菌等的細胞。大腸桿菌菌株的實例包括JM109菌株(recA，endA1，gyrA96，，thi，hsdR17，supE44，relA1，和Δ(lac-proAB)/F’[traD36，proAB+，lacIq和LacZΔM15])。
可轉化為轉化體的其它細胞是枯草桿菌、酵母、曲霉菌屬的細胞等。利用它們的蛋白-分泌的特點，能夠將GX生產到培養(yǎng)基當中。除上述微生物外，也可使用諸如蠶細胞的培養(yǎng)細胞。
將上述獲得的重組載體引入宿主細胞來獲得轉化體?？赏ㄟ^各種傳統(tǒng)方法將重組載體引入到宿主細胞中，例如有效的細胞法、原生質體法、磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、微注射法和脂質體融合法。
<4>生產本發(fā)明的氨肽酶的方法在培養(yǎng)基混合物中培養(yǎng)如此獲得的轉化體來生產GX。通過已知的方法分離GX，如果需要，進行純化來獲得所要的酶。
當使用大腸桿菌作為宿主時，獲得的GX基因產品有可能是沒有活性的締合產品，即蛋白包含體，然后通過適當?shù)姆椒せ钸@種包含體。經再活化后，活性蛋白可通過已知的方法進行分離和純化來獲得所要的酶。
培養(yǎng)轉化體的培養(yǎng)基是已知的。例如，對于培養(yǎng)大腸桿菌，使用的營養(yǎng)培養(yǎng)基如LB培養(yǎng)基或最低培養(yǎng)基如M9培養(yǎng)基需添加碳源、氮源、維生素源等。轉化體的培養(yǎng)溫度通常是16到42℃，優(yōu)選地是25到37℃，培養(yǎng)時間是5到168小時，優(yōu)選地是8到72小時。培養(yǎng)條件隨宿主而變化。震蕩培養(yǎng)和靜止培養(yǎng)都可以。如果需要，培養(yǎng)基可以攪拌或通氣。當使用誘導啟動子來表達GX，培養(yǎng)基中可加入啟動誘導物。
通過已知方法諸如鹽析方法、等電沉淀方法或溶劑沉淀的方法；利用了分子量差異的方法諸如透析、超濾或凝膠過濾；利用了特定的親合力的方法諸如離子交換色譜法；利用了疏水性差異的方法諸如疏水性色譜法或反向色譜法；親和色譜法；SDS聚丙烯酰胺電泳；或等電聚焦方法，可以從轉化體的提取物中分離和純化出GX。GX可通過這些方法的結合進行純化。
根據(jù)本發(fā)明，可獲得一個編碼氨肽酶GX的氨基酸序列的cDNA，該氨肽酶GX適于從含有富含酸性氨基酸的蛋白質和肽的起始原料中生產高度水解的產物。使用該cDNA，通過大腸桿菌等可大量生產重組氨肽酶。通過使用該cDNA，也可通過使用除大腸桿菌以外的宿主生產氨肽酶GX。另外，富含谷氨酸和天門冬氨酸并且具有出色的調味特性的水解產物可通過結合使用如此生產的GX與市場上買到的蛋白酶如FlavourzymeTM(由Novo Nardisk A/S生產)和蛋白酶MTM(由Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.生產)，從大豆蛋白中獲得。
蛋白酶D3和亮氨酸氨肽酶DLAP。
實施例下面的實施例旨在說明本發(fā)明，并不將本發(fā)明的范圍限定到這些實施例的范圍。
實施例1GX cDNA的克隆在這個實施例中，本發(fā)明描述了幾個方面<1>測定GX的內部氨基酸序列，<2>找到與GX的DNA序列高度同源的DNA序列，<3>分析大豆中的GX的表達位點和<4>以稻谷植物EST R2219.2A作為探針，篩選發(fā)芽大豆芽的cDNA文厙。
<1>測定GX的內部氨基酸序列從發(fā)芽大豆子葉中獲得的GX蛋白被降解，羧甲基化并采用賴氨酰肽鏈內切酶(EC.3.4.21.50 Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)處理。如此獲得的肽片段采用μRPC C2/C18 SC2.1/10柱(Pharmacia Aktiebolag的產品)進行分離。通過使用蛋白序列儀分析每一片段的氨基酸序列，成功地測定了總共10部分片段的氨基酸序列。
<2>找到與GX高度同源的DNA序列上述測定的氨基酸序列進行DDBJ(日本的DNA數(shù)據(jù)庫)的同源性檢索來尋找源于稻谷植物的根且與序列表中的SEQ ID NO4的第8肽片段具有高度同源性的EST R22192A。如此獲得的稻谷植物的R22192A很有可能就是編碼稻谷植物的GX同源體。然后，以稻谷植物的R22192A作為探針嘗試克隆大豆GX?？寺∏?，進行了研究來尋找能夠高表達的大豆器官。
<3>分析大豆中的GX的表達位點作為探針使用的稻谷植物的R22192A cDNA片段是通過下述RT-PCR方法獲得的。
R2219.2A cDNA片段通過以稻谷根的多聚(A)RNA為模板的RT-PCR方法來擴增。R2219.2A擴增的引物是作為有意義引物的R2219 2AU(序列表中的SEQ ID NO5)和作為反義引物的R2219 2AD(序列表中的SEQ ID NO6)。擴增區(qū)域被發(fā)現(xiàn)含有對應于第8肽片段的區(qū)域。
在RT-PCR反應中，使用了Takara RNA PCR試劑盒。PCR的反應條件是94℃，5分鐘，然后55℃，1分鐘和72℃，1分鐘進行1個循環(huán)；94℃，1分鐘，然后55℃，1分鐘和72℃，1分鐘進行25個循環(huán)。
然后，采用上述稻谷植物的R22192A cDNA，進行Northem雜交來確定大豆RNA是否具有與稻谷植物R22192A的DNA同源的序列。
通過采用上述獲得的R22192A cDNA進行了從大豆各個器官中提取完整RNA的Northern blotting(Northern點雜交)。所用的大豆器官是發(fā)芽后三天和七天的子葉，發(fā)芽后七天的芽，未成熟的子葉、豆莢和葉。
在55℃或60℃雜交后，接著采用0.5×SSC，0.1％的SDS、在與雜交溫度相同的溫度下進行強洗脫，發(fā)芽7天后的芽產生清晰的信號。計算出其大小為大約1.5kbp。
基于這一結果得出的結論是，大豆芽具有和稻谷植物R22192A有一些同源性的mRNA，并且它就是非常想得到的GX mRNA。上述試驗表明GX cDNA最好通過以稻谷植物R22192A cDNA作為探針、在60℃的雜交條件下，篩選制備于發(fā)芽后7天的大豆芽的mRNA的cDNA文庫來獲得。
<4>以稻谷植物EST作為探針，篩選源于發(fā)芽大豆芽的cDNA文庫制備于發(fā)芽后7天的大豆芽的多聚A RNA的cDNA文庫7.2×104pfu通過常規(guī)方法，在上述條件下進行篩選來獲得7個雜交克隆。測定每個克隆的DNA序列來確定含有SEQ ID NO2的全長GX DNA序列的克隆，其編碼含有SEQ IDNO1的487個氨基酸殘基并含有SEQ ID NO4的GX內氨基酸序列的多肽。
由于這一DNA序列編碼上述測定的GX內氨基酸序列的所有10個區(qū)域，所以該DNA序列被認為是目的GX cDNA的DNA序列。然后，采用這一cDNA，通過大腸桿菌生產GX蛋白。
實施例2通過大腸桿菌生產GX將實施例1中獲得的GX cDNA組合到能在大腸桿菌表達的表達載體中，對含有該表達質粒的轉化體進行培養(yǎng)。檢測細胞中的GX的活性。除了獲得的GX cDNA的序列外，表達質粒也可制備成這樣的質粒，其中考慮到密碼子用于大腸桿菌，密碼子被改變了從Ala(N端的第二個殘基)到Leu(第五個殘基)的四個殘基，即Ala，Ala，Lys和Leu。它們的表達水平彼此進行了比較。
在這個實施例中，本發(fā)明將說明以下幾個方面<1>表達質粒的構建，<2>使用該表達質粒來制備大腸桿菌轉化體并進行培養(yǎng)，<3>測定GX的活性。
<1>表達質粒的構建；(1)具有未經修飾的GX cDNA序列的表達質粒的構建其轉錄能在不含色氨酸的培養(yǎng)基中被輕易誘導的trp啟動子被用作轉錄GX基因的啟動子。trp啟動子被用于能高效表達Pagrus大型轉谷氨酰胺酶(TG)基因的質粒pTTG-22(JP-Kokai No.6-225775)。Pagrus大型TG基因的上游序列被設計成適于異源蛋白能在大腸桿菌中高效表達。
高效表達源于微生物的轉谷氨酰胺酶(MTG)基因的質粒pUCTRPMTG(+)D2(EP-A-0889133)具有含有Pagrus大型TG的表達質粒的trp啟動子的上游序列(SEQ ID NO3)。通過進一步組合到多拷貝質粒pUC19中，MTG能獲得高效表達。
通過PCR方法，DNA片段被連接到GX cDNA上游區(qū)域的trp啟動子上。首先，如
圖1所示，通過PCR方法擴增含有MTG表達質粒pUCTRPMTG(+)D2的trp啟動子的區(qū)域(SEQ ID NO3)和GX cDNA的部分區(qū)域。擴增trp啟動子的引物是TRP-N2(SEQ ID NO7)和TRP-C2(SEQ ID NO8)；擴增GX的引物是GX-N1(SEQ ID NO9)和GX-C(SEQ ID NO10)；TRP-N2和GX-N1是有意義的引物；TRP-C2和GX-C是反義引物。GX-N1被設計成添加了用于連接GX與trp啟動子的11個堿基的DNA序列，其中trp啟動子含有片段，即含有GX的上游起始密碼。這一序列與TRP-C2中的序列互補。
通過采用質粒pUCTRPMTG(+)D2和引物TRP-N2和TRP-C2；和含有全長GX cDNA的質粒pR2219i和引物GX-N1和GX-C進行PCR反應。PCR反應的條件是94℃、2分鐘進行一個循環(huán)；和94℃、30秒鐘，然后50℃、5秒鐘和72℃、30秒鐘進行25個循環(huán)。PCR產物用酚/氯仿進行處理并用乙醇進行沉淀。每一沉淀物溶解在100μL的dH2O中。
從每一PCR產物中取出等分試樣(1μL)并進行混合。在94℃下加熱變性10分鐘后，采用引物TRP-N2和GX-C進行PCR反應，循環(huán)次數(shù)為25。每一循環(huán)的條件包括94℃、30秒鐘，然后55℃、5秒鐘和72℃、1分鐘。
第二次PCR反應產物通過酚/氯仿進行萃取。用乙醇沉淀后，該產物被EcoRI和KpnI消化，然后被亞克隆到pUC18上來獲得pUCTRPGXN1-g(
圖1)。序列被確定。
然后，使用KpnI和XbaI切除含在pR2219i中的GX基因的C端區(qū)域并將其亞克隆到上述的pUCTRPGXN1-8上來獲得由trp啟動子啟動的GX表達質粒pUCTRPGX1-8(圖2)。
(2)具有修飾密碼子的GX表達質粒的構建除了使用GX-N2(SEQ ID NO；11)作為通過PCR反應擴增GX cDNA的N端片段的有意義的引物外，質粒以同于上述方法(1)的方法進行構建。在GX-N2中，對應于N端第2個到第5個殘基的密碼子，即對應于Ala，Ala，Lys和Leu的密碼子被從GCG GCG AAG CTA變?yōu)镚CT GCT AAA CTG。
通過采用質粒pUCTRPMTG(+)D2和引物TRP-N2和TRP-C2；或質粒pR2219i和引物GX-N2和GX-C進行PCR反應。PCR反應的條件是94℃、2分鐘進行了一個循環(huán)；94℃、30秒鐘，然后50℃、5秒鐘和72℃、30秒鐘進行了25個循環(huán)。PCR產物用酚/氯仿進行處理并用乙醇進行沉淀。每一沉淀物溶解在100μL的dH2O中。
從每一PCR產物中取出等分試樣(1μL)并進行混合。在94℃加熱變性10分鐘后，采用引物TRP-N2和GX-C進行PCR反應，循環(huán)次數(shù)為25。每一循環(huán)的條件包括94℃、30秒鐘，然后55℃、5秒鐘和72℃、1分鐘。
第二次PCR反應產物通過酚/氯仿進行萃取。用乙醇沉淀后，該產物被EcoRI和KpnI消化，然后被亞克隆到pUC18上來獲得pUCTRPGXN2-1(圖3)。序列被確定。
然后，使用KpnI和XbaI切除含在pR2219i中的GX基因的C端區(qū)域并將其亞克隆到上述的pUCTRPGXN2-1上來獲得由trp啟動子啟動的GX表達質粒pUCTRPGX2-1(圖4)。
<2>使用表達質粒pUCTRPGX2-1制備并培養(yǎng)大腸桿菌轉化體通過感受態(tài)細胞的方法將pUCTRPGX1-8，pUCTRPGX2-1和pUC19導入大腸桿菌JM109，并在含有150μg/mL氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)基中篩選轉化體。被pUCTRPGX2-1轉化的大腸桿菌被命名為“AJ13564”并保藏在工業(yè)科學技術aqnd Huma-技術機構的生物科學國立研究所(National Institue ofBioscience aqnd Huma-Technology Agency of Institute Science and Technology)中，保藏號為FERM P-17131，根據(jù)布達佩斯條約，于2000年2月14日在同一研究所中轉為國際保藏，保藏號為FERMBP-7027。將每一轉化體接種到含有150μg/mL氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中并在37℃下培養(yǎng)5小時。如此獲得的1mL預培養(yǎng)液被轉移到50mL、含有150μg/mL氨芐青霉素的M9-酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基中來進行主培養(yǎng)。主培養(yǎng)在37℃下進行18小時。
完成培養(yǎng)后，通過離心收集的細胞被懸浮在細胞均質緩沖液(50mMTris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA)當中并采用Branson型超聲儀-250的芯片(microchips)，在具有輸出控制7、忙閑度50％和大約10分鐘的條件下進行超聲處理。如此獲得的液體在12000rpm的條件下離心10分鐘。上清液被作為細胞的可溶部分，沉淀被作為不溶部分。SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳后，具有與GX相同分子量的蛋白的表達被確定為是在pUCTRPGX1-8/JM109-可溶部分中，和在pUCTRPGX2-1/JM109-可溶部分和-不溶部分中。其中密碼被修飾的pUCTRPGX2-1/JM109-可溶部分被發(fā)現(xiàn)具有特別高的表達量。這一事實清楚地表明通過改變密碼子而獲得的效果。即使在未添加3-β-吲哚丙烯酸的生產培養(yǎng)基中也能獲得相當高的表達。
<3>GX活性的測定GX活性是在由于二肽Glu-Glu的水解而增加了游離谷氨酸含量的基礎上測定的。將一種酶溶液添加到一種含有50mM的HEPES(PH8.0)和5mM的Glu-Glu的活性測定溶液中。在37℃下反應5到10分鐘后，乙酸被加到反應混合物中并且最終濃度達到2％，然后終止反應。游離谷氨酸的量通過谷氨酸分析試劑盒(Seikagaku Kogyo的產品)進行測定。在1分鐘內產生1μmol的谷氨酸的活性被定為1個單位。
pUCTRPGX1-8/JM109，pUCTRPGX2-1/JM109和pUC19/JM109可溶部分的GX活性，即，含有細胞碎片的上清液的GX活性，被確定來計算比活性。獲得的比活性是pUCTRPGX1-8/JM109的為0.91U/mg，pUCTRPGX2-1/JM109的為2.88U/mg，和pUC19/JM109的為0.04U/mg。因此證實了積累在細胞中的GX蛋白具有活性。還證實了通過修飾密碼子，可以積累大約三倍量的GX蛋白。
序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.<120>編碼新氨肽酶的DNA，和生產該氨肽酶的方法<130>0P00010<150>JP 11-68255<151>1999-03-15<160>11<210>1<211>487<212>PRT<213>甘氨酸最大含量(Glycine max)<400>1Met Ala Ala Lys Leu Asp Thr His Ala Val Ala Ser Asp Leu Ile Asp1 5 10 15Phe Leu Asn Ala Ser Pro Thr Ala Phe His Ala Val Asp Glu Ala Lys20 25 30Arg Arg Leu Arg Ser Ala Gly Tyr His Gln Leu Ser Glu Arg Glu Val35 40 45Trp Glu Leu Gln Pro Gly Asn Lys Tyr Phe Phe Thr Arg Asn His Ser
50 55 60Thr Ile Val Ala Phe Ala Ile Gly Lys Lys Tyr Val Ala Gly Asn Gly65 70 75 80Phe Tyr Ile Ile Gly Ala His Thr Asp Ser Pro Cys Leu Lys Leu Lys85 90 95Pro Val Thr Lys Val Val Lys Ale Gly Ile Leu Glu Val Gly Val Gln100 105 110Thr Tyr Gly Gly Gly Leu Trp His Thr Trp Phe Asp Arg Asp Leu Thr115 120 125Val Ala Gly Arg Val Ile Val Arg Glu Glu Asn Ala Gly Ser Val Ser130 135 140Tyr Ser His Arg Leu Val Arg Ile Glu Glu Pro Ile Met Arg Ile Pro145 150 155 160Thr Leu Ala Ile His Leu Asp Lys Thr Val Asn Asp Gly Phe Lys Phe165 170 175Asn Asn Glu Asn His Leu Ile Pro Ile Leu Ala Thr Ser Leu Lys Gly180 185 190Glu Leu Asn Lys Val Ser Ser Glu Asn Gly Pro Val Glu Ser Gly Asn195 200 205Gln Thr Asp Gly Lys Lys Ala Asn Asp Lys Thr Gly Thr Ser Asn Thr210 215 220Lys His His Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Ala Ser Lys Leu Gly Cys225 230 235 240Glu Pro Asp Asp Ile Cys Asp Phe Glu Leu Gln Ala Cys Asp Thr Gln245 250 255Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ala Ala Lys Glu Phe Ile Phe Ser Gly Arg
260 265 270Leu Asp Asn Leu Cys Met Ser Phe Cys Ser Leu Lys Ala Leu Ile Asp275 280 285Ala Thr Ser Ser Asp Ser Ser Leu Glu Glu Glu Ser Gly Val Arg Met290 295 300Val Ala Leu Phe Asp His Glu Glu Val Gly Ser Asn Ser Ala Gln Gly305 310 315 320Ala Gly Ser Pro Val Met Leu Asn Ala Val Thr Arg Val Thr Asn Ser325 330 335Phe Ser Ser Asn Pro Asn Leu Leu Glu Lys Ala Ala Gln Leu Ser Tyr340 345 350Leu Val Ser Ala Asp Met Ala His Ala Leu His Pro Asn Tyr Met Asp355 360 365Lys His Glu Ala Asn His Gln Pro Lys Leu His Gly Gly Leu Val Ile370 375 380Lys Thr Asn Ala Sar Gln Arg Tyr Ala Thr Asn Val Val Thr Ser Phe385 390 395 400Ile Phe Arg Glu Ile Ala Ser Lys His Lys Leu Pro Val Gln Asp Phe405 410 415Val Val Arg Asn Asp Met Ser Cys Gly Ser Thr Ile Gly Pro Ile Leu420 425 430Ala Ser Gly Val Gly Ile Arg Thr Val Asp Val Gly Ala Pro Gln Leu435 440 445Ser Met His Ser Ile Arg Glu Ile Cys Ala Val Asp Asp Val Lys Tyr450 455 460Ser Tyr Glu His Phe Lys Ala Phe Tyr Gln Glu Phe Ser His Vel Asp465 470 475480Gly Lys Met Val Val Asp Ile485<210>2<211>1657<212>DNA<213>甘氨酸最大含量(Glycine max)<220><221>CDS<222>22..1482<400>2aaaattaaaa tctgaaaaac a atg gcg gcg aag cta gac acc cac gcc gtg 51Met Ala Ala Lys Leu Asp Thr His Ala Val1 5 10gct tcc gat ctg atc gac ttc ctc aac gct tct cca acg gct ttc cac 99Ala Ser Asp Leu Ile Asp Phe Leu Asn Ala Ser Pro Thr Ala Phe His15 20 25gcc gtc gac gag gca aag agg cgt ttg cgt agc gcg ggg tac cac caa 147Ala Val Asp Glu Ala Lys Arg Arg Leu Arg Ser Ala Gly Tyr His Gln30 35 40ctc tct gag agg gaa gtg tgg gaa ctg caa ccg ggc aac aag tac ttc 195Leu Ser Glu Arg Glu Val Trp Glu Leu Gln Pro Gly Asn Lys Tyr Phe45 50 55ttc acc aga aat cac tcc acc atc gtc gcc ttc gcc atc ggc aaa aag 243Phe Thr Arg Asn His Ser Thr Ile Val Ala Phe Ala Ile Gly Lys Lys60 65 70tac gtt gct gga aat gga ttc tac ata att ggg gct cac acg gat agt 291Tyr Val Ala Gly Asn Gly Phe Tyr Ile Ile Gly Ala His Thr Asp Ser75 80 85 90cct tgt ctc aaa ctc aag cct gtc acc aag gtt gtt aag gct ggg att 339Pro Cys Leu Lys Leu Lys Pro Val Thr Lys Val Val Lys Ala Gly Ile95 100 105ttg gag gtt ggt gtc caa acc tat gga ggt ggt ctg tgg cac aca tgg 387Leu Glu Val Gly Val Gln Thr Tyr Gly Gly Gly Leu Trp His Thr Trp110 115 120ttt gat cga gac ttg act gtg gcg ggg agg gtc atc gtg cgg gaa gag 435Phe Asp Arg Asp Leu Thr Val Ala Gly Arg Val Ile Val Arg Glu Glu125 130 135aat gct ggt tct gtt tcg tac tca cat cgc ctt gtt aga att gag gaa 483Asn Ala Gly Ser Val Ser Tyr Ser His Arg Leu Val Arg Ile Glu Glu140 145 150cot ata atg cga ata ccg act ttg gca att cac ttg gac aag act gtt 531Pro Ile Met Arg Ile Pro Thr Leu Ala Ile His Leu Asp Lys Thr Val155 160 165 170aat gat gga ttc aaa ttt aac aac gag aat cac ctt att ccc atc ttg 579Asn Asp Gly Phe Lys Phe Asn Asn Glu Asn His Leu Ile Pro Ile Leu175 180 185gca aca tcg ctg aag ggt gag ctc aat aaa gtg tcc tct gaa aat ggt 627Ala Thr Ser Leu Lys Gly Glu Leu Asn Lys Val Ser Ser Glu Asn Gly
190 195 200cct gtt gaa agt gga aat cag acc gat gga aag aaa gca aat gat aaa 675Pro Val Glu Ser Gly Asn Gln Thr Asp Gly Lys Lys Ala Asn Asp Lys205 210 215aca ggc acc agc aat acg aag cat cac ctt ctt ctt cta cag ttg ctt 723Thr Gly Thr Ser Asn Thr Lys His His Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu220 225 230gca agc aag ctt ggg tgt gaa cca gat gac ata tgt gat ttt gaa ttg 771Ala Ser Lys Leu Gly Cys Glu Pro Asp Asp Ile Cys Asp Phe Glu Leu235 240 245 250caa gct tgc gat aca caa cca agt act att gct gga gct gca aag gaa 819Gln Ala Cys Asp Thr Gln Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ala Ala Lys Glu255 260 265ttc att ttt tca gga cgg ctt gat aat ctc tgc atg tca ttt tgc tcg 867Phe Ile Phe Ser Gly Arg Leu Asp Asn Leu Cys Met Ser Phe Cys Ser270 275 280ctg aag gca tta ata gat gct aca tct tct gac agc agt ctt gag gaa 915Leu Lys Ala Leu Ile Asp Ala Thr Ser Ser Asp Ser Ser Leu Glu Glu285 290 295gag tca ggt gtt aga atg gtg gct tta ttt gac cat gag gaa gtt gga 963Glu Ser Gly Val Arg Met Val Ala Leu Phe Asp His Glu Glu Val Gly300 305 310tct aac tct gcc caa gga gct ggc tct cct gtt atg cta aat gct gtg1011Ser Asn Ser Ala Gln Gly Ala Gly Ser Pro Val Met Leu Asn Ala Val315 320 325 330act agg gtt acc aat tcc ttc agc tcc aat ccc aac ctt ctg gag aaa1059Thr Arg Val Thr Asn Ser Phe Ser Ser Asn Pro Asn Leu Leu Glu Lys335 340 345gca gca caa tta agc tac ctt gta tct gcc gac atg gca cat gca cta1107Ala Ala Gln Leu Ser Tyr Leu Val Ser Ala Asp Met Ala His Ala Leu350 355 360cac cca aat tac atg gac aag cat gaa gca aac cat cag ccc aaa cta1155His Pro Asn Tyr Met Asp Lys His Glu Ala Asn His Gln Pro Lys Leu365 370 375cat gga gga ctt gtc att aaa acc aat gca agc caa cgc tat gca acc1203His Gly Gly Leu Val Ile Lys Thr Asn Ala Ser Gln Arg Tyr Ala Thr380 385 390aat gtt gtc aca tcc ttc ata ttc agg gag ata gca tca aaa cat aaa1251Asn Val Val Thr Ser Phe Ile Phe Arg Glu Ile Ala Ser Lys His Lys395 400 405 410ctt ccc gtt cag gac ttt gtg gtg cgc aat gac atg tea tgt ggt tca1299Leu Pro Val Gln Asp Phe Val Val Arg Asn Asp Met Ser Cys Gly Ser415 420 425acc att ggt cct att ctt gct agt ggc gta ggt att cgc act gtt gat1347Thr Ile Gly Pro Ile Leu Ala Ser Gly Val Gly Ile Arg Thr Val Asp430 435 440gta ggt gca ccg cag ttg tca etg cat agc ata cga gaa att tgt gct1395Val Gly Ala Pro Gln Leu Ser Met His Ser Ile Arg Glu Ile Cys Ala445 450 455gtt gat gat gtg aag tat tca tat gag cac ttc aaa gca ttt tac caa1443Val Asp Asp Val Lys Tyr Ser Tyr Glu His Phe Lys Ala Phe Tyr Gln460 465 470gaa ttc tct cat gtt gat ggt aag atg gtc gtg gat ata tag gaatatctc 1494Glu Phe Ser His Val Asp Gly Lys Met Val Val Asp Ile475 480 485taatcacgaa atcctcatta atcctttgct ctagaagctg ttgctgaaat ggtcgtgttt 1554cgtaatttag taccattata atgccgacgt tattatgatg aaattttcaa taaaattaga 1614ctccctgaat gaaatattag caactaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1657<210>3<211>357<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動子<222>0..357<400>3cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccgc ttcattaatg cagctggcac 60gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc 120actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg atcgtatgtt gtgtggaatt 180gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttgca 240tgcctgcagg tcgccctttc gtcttcaaga attcccctgt tgacaattaa tcatcgaact 300agttaactag tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgat tagtaaggag gtttaaa 357<210>4<211>20<212>PRT<213>甘氨酸最大含量(Glycine max)<400>4Ser Ala Gly Tyr His Gln Leu Ser Glu Arg Glu Val Trp Glu Leu Gln Pro Gly1 5 10 15Asn Lys20<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>5ctacacctga ctcatcgatc cacta25<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>6caggcttgag cttcagggat ggact25<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>7cgcccaatac gcaaaccgcc 20<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>8tttaaacctc cttactaatc gataccc 27<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>9ggaggtttaa aatggcggcg aagctagaca cc32<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>10gttgcagttc ccacaattcc c21<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>11ggaggtttaa aatggctgct aaactggaca cc 3權利要求
1.一種編碼源于發(fā)芽大豆子葉且具有SEQ ID NO1氨基酸序列的氨肽酶的DNA分子。
2.一種編碼源于發(fā)芽大豆子葉且具有SEQ ID NO1氨基酸序列的氨肽酶的變異體的DNA分子，其中SEQ ID NO1氨基酸序列中插入、增加、刪除或取代了一個或多個氨基酸殘基。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其具有SEQ ID NO2的第22到第1482個核苷酸序列。
4.一種在嚴格條件下能與具有SEQ ID NO2序列的DNA分子雜交并編碼具有氨肽酶活性的蛋白的DNA分子。
5.如權利要求1所述的DNA分子，其中密碼子的應用被優(yōu)化到適用于大腸桿菌。
6.如權利要求5所述的DNA分子，其中Ala2-Ala3-Lys4-Leu5的密碼子是GCTGCTAAACTG。
7.含有權利要求1的DNA分子的重組DNA分子。
8.含有權利要求2的DNA分子的重組DNA分子。
9.含有權利要求4的DNA分子的重組DNA分子。
10.如權利要求7所述的重組DNA分子，其為高效表達載體。
11.如權利要求7所述的重組DNA分子，其中trp啟動子被功能性地連接到權利要求1所述的DNA分子上。
12.如權利要求7所述的重組DNA分子，其為高拷貝載體。
13.被權利要求1所述的DNA分子轉化了的宿主。
14.如權利要求13所述的轉化宿主，其為原核生物。
15.如權利要求13所述的轉化宿主，其為真核生物。
16.如權利要求14所述的轉化宿主，其為大腸桿菌。
17.被權利要求5所述的DNA分子轉化了的大腸桿菌細胞。
18.如權利要求17所述的大腸桿菌細胞，其保藏號為FERM BP-7027。
19.生產具有氨肽酶活性的蛋白的方法，其包括步驟(i)培養(yǎng)權利要求13所述的轉化宿主，(ii)表達具有氨肽酶活性的蛋白，和(iii)回收蛋白。
全文摘要
公開了編碼源于發(fā)芽大豆的新的氨肽酶的cDNA,含有該DNA的重組表達載體,通過采用該表達載體進行轉化所獲得的轉化體,和通過培養(yǎng)轉化產物生產氨肽酶的方法。
文檔編號C12N15/57GK1270224SQ00108358
公開日2000年10月18日 申請日期2000年3月15日 優(yōu)先權日1999年3月15日
發(fā)明者二宮大記, 三輪哲也, 淺野皆夫, 中村奈巳, 丹尾式希 申請人:味之素株式會社