專利名稱：有效檢測丙型肝炎病毒(hcv)的寡核苷酸引物及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測生物樣品中核酸序列，特別是來源于傳染性微生物的序列的改良的方法。
丙型肝炎病毒(HCV)是引起大多數(shù)輸血后肝炎病例和全世界大部分偶發(fā)(或者群體獲得性)肝炎病例的一種不經(jīng)過腸胃傳染的病毒。據(jù)估計(jì)世界人口的1％以上感染了HCV。急性肝炎、慢性肝炎、肝硬變和肝細(xì)胞癌都與HCV感染相關(guān)。
當(dāng)前HCV分類為一個(gè)單獨(dú)的屬，即黃病毒科中的Hepacivirus。其基因組由大約9,500個(gè)核苷酸的一個(gè)正鏈RNA分子構(gòu)成，其中含有一個(gè)編碼大約3,000個(gè)氨基酸聚多蛋白前體的大的單一開放式閱讀框架(ORF)。在該大的開放式閱讀框架之前加上一個(gè)大約340核苷酸的5’-非編碼區(qū)(NCR)，這是基因組中最保守的區(qū)域。ORF的5’區(qū)域編碼(5’→3’方向)一個(gè)衣殼蛋白，二種包膜糖蛋白(E1和E2)以及一種未知功能的小蛋白(P7)。ORF的3’部分編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括一種蛋白酶，蛋白酶/解旋酶雙功能蛋白，RNA聚合酶和調(diào)節(jié)肽。在3’端亦包含一個(gè)NCR。
分析取自世界各地的HCV編碼序列揭示不同的病毒分離株間具有顯著的序列差異。進(jìn)一步分析不同病人的HCV序列顯示病毒以所謂的含有相關(guān)但不相同序列的“準(zhǔn)種(quasi-species)”而傳播。據(jù)認(rèn)為在分離株間和不同病人間存在的差異是病毒編碼的依賴RNA的RNA聚合酶低保真度的結(jié)果。HCV的遺傳變異性程度對預(yù)防、診斷和控制感染具有重要影響。
HCV感染典型的血清學(xué)診斷是通過可商業(yè)化購得的檢測結(jié)合重組HCV蛋白或肽的酶免疫分析法(EIA)而進(jìn)行測定。陽性EIA結(jié)果可由一種重組免疫印跡分析法(RIBA)證實(shí)，但EIA和RIBA分析法都不能辨別過去的和現(xiàn)在的感染。由于傳染病毒的典型低滴度，還沒有成功地開發(fā)出一種直接分析病毒蛋白的方法。此外，基于抗體的分析法沒有檢測出一般暴露2-3個(gè)月后的HCV感染。
因此，該領(lǐng)域需要改進(jìn)的靈敏分析HCV方法，足以檢測病人接觸HCV最初幾天內(nèi)的HCV病毒血癥。
首先，本發(fā)明涉及一種檢測生物樣品中HCV RNA存在的方法。該方法包括(A)用樣品來源的模板RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以產(chǎn)生HCV特異的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
(B)用HCV特異性的一對或多對寡核苷酸引物擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而產(chǎn)生HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
其中每對包括(a)選自以下序列的正向引物(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID NO.3>；(b)選自以下序列的反向引物(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，(ii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>，(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>；(c)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物表明樣品中存在HCV RNA。
另一方面，本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增HCV DNA的方法。該方法包括(A)用HCV特異的一對或多對寡核苷酸引物對含有HCV DNA的DNA樣品進(jìn)行PCR以產(chǎn)生HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
其中每對引物包括(a)選自以下序列的正向引物
(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；(b)選自以下序列的反向引物(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，(ii)5’-GCAAGCACCCATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>，(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>。
第三，本發(fā)明涉及一種檢測生物樣品中HCV RNA存在的方法，該方法包括(A)用來源于樣品的模板RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以產(chǎn)生HCV特異性的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
(B)用正向引物和反向引物擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以產(chǎn)生HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
這里，正向引物包括寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>；反向引物包括寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>
(C)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物這里，檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物表明樣品中存在HCV RNA。
第四，本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增HCV DNA的方法。該方法包括(A)用正向引物和反向引物對含有HCV DNA的DNA樣品進(jìn)行PCR以產(chǎn)生HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
這里，正向引物包括寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)(SEQ ID No.8)和反向引物包括寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>
第五，本發(fā)明涉及一種檢測生物樣品中HCV RNA存在的方法。該方法包括(A)用來源于樣品的模板RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以產(chǎn)生HCV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
(B)用HCV特異的一對或多對5’NCR寡核苷酸引物和一對或多對3’NCR寡核苷酸引物擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以產(chǎn)生HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
這里，每對5’NCR寡核苷酸引物包括(a)選自以下序列的正向引物(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；(b)選自以下序列的反向引物(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，(ii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>，(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>；這里每對3’NCR寡核苷酸引物包括一個(gè)含有寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>的正向引物和含有寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNo.9>的反向引物。
(c)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物這里，檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物表明樣品中存在HCV RNA。
第六，本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增HCV DNA的方法。該方法包括(A)用一對或多對HCV特異的5’NCR寡核苷酸引物和一對或多對3’NCR寡核苷酸引物對含有HCV DNA的DNA樣品進(jìn)行PCR以產(chǎn)生HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
這里，每對5’NCR寡核苷酸引物包括(a)選自以下序列的正向引物(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；(B)選自以下序列的反向引物(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，(ii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>，或(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>；這里，每對3’NCR寡核苷酸引物含有一個(gè)寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>組成的正向引物和一個(gè)寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQID No.9>組成的反向引物。
在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)方法的具體例子中，采用隨機(jī)的寡核苷酸引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；或者用HCV特異性的一個(gè)或多個(gè)逆轉(zhuǎn)錄引物，例如具有相應(yīng)于HCV RNA序列的寡核苷酸。檢測擴(kuò)增的方法包括但不限于(a)電泳、(b)在附著有HCV特異性探針的固相載體上俘獲擴(kuò)增產(chǎn)物，接著用比色分析法定量所結(jié)合的產(chǎn)物。
此外，本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增來源于HCV RNA的HCV DNA的試劑盒。該試劑盒包含一對或多對5’NCR寡核苷酸引物，這里，每對5’-NCR寡核苷酸引物包括
(a)選自以下序列的正向引物(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；(b)選自以下序列的逆向引物(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，(ii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>，(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>。
另一方面，本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增來源于HCV RNA的HCV cDNA的試劑盒。該試劑盒包含一對或多對3’NCR寡核苷酸引物，這里每對3’NCR寡核苷酸引物包括一個(gè)寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACT-3’(1F27)<SEQID No.8>組成的正向引物和一個(gè)寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>組成的反向引物。
另一方面，本發(fā)明涉及一個(gè)檢測HCV DNA存在的試劑盒。該試劑盒包括一對或多對5’NCR寡核苷酸引物，每對5’NCR寡核苷酸引物包含(a)選自以下序列的正向引物(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；(b)選自以下序列的反向引物(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，(ii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>，(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>。
另一方面，本發(fā)明涉及一種檢測HCV RNA存在的試劑盒。該試劑盒包括一對或多對3’NCR寡核苷酸引物，每對3’NCR寡核苷酸引物包括一個(gè)寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>組成的正向引物和一個(gè)寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>組成的反向引物。
本發(fā)明揭示用與HCV RNA中某序列具有序列互補(bǔ)的寡核苷酸作擴(kuò)增引物來檢測生物樣品中HCV RNA更為有效。本發(fā)明提供了一種檢測低拷貝HCV RNA的改進(jìn)的單輪逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增分析法。根據(jù)序列保存的理論價(jià)值、分子內(nèi)和分子間相互作用、擴(kuò)增子和周圍序列預(yù)測的次級(jí)結(jié)構(gòu)而選擇寡核苷酸引物。此外，引物和分析系統(tǒng)的設(shè)計(jì)要允許HCV基因組的多個(gè)區(qū)域、多種病毒和一個(gè)內(nèi)部陽性對照(IPC)RNA(或DNA)一起共擴(kuò)增(或檢測)。HCV基因組多個(gè)區(qū)域的同時(shí)擴(kuò)增/檢測增加了分析的靈敏性，而一種IPC的共擴(kuò)增降低了由于PCR抑制產(chǎn)生錯(cuò)誤陰性結(jié)果的可能性。
實(shí)施本發(fā)明中應(yīng)用了許多分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和蛋白質(zhì)生物化學(xué)方面的技術(shù)，例如在以下書目中都有說明。
Current Protocols in Molecular Biology，VolumesI，II，and III，1997(F.M..Ausubel ed.)；Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York；DNA CloningA Practical Approach，Volumes I and II，1985(D.N.Glover ed.)；Oligonucleotide Synthesis，1984，(M.L.Gait ed.)；Transcription and Translation，1984(Hames and Higgins eds.)；A Practical Guideto Molecular Cloning；the series，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；and Protein PurificationPrinciples and Practice，Second Edition(Springer-Verlag，N.Y.).
這里所用的“核酸”或“多核苷酸”涉及任何長度的含嘌呤和嘧啶的多聚體，或是多核糖核苷酸，或是多脫氧核糖核苷酸，或者混合多核糖一多脫氧核糖核苷酸。這涉及單鏈和雙鏈分子，例如DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA雜合物，以及堿基共軛結(jié)合到氨基酸骨架形成的“蛋白核酸”(PNA)。同時(shí)也涉及含有修飾堿基的核酸。
這里所用的核酸序列的“互補(bǔ)”涉及參與和原始序列以Watson-Crick堿基配對的反義序列。
這里所用的“引物”是一個(gè)長度約為10～50核苷酸的分離的寡核苷酸，優(yōu)選長度約為12～25核苷酸，最佳長度約為12～18核苷酸，并與需要的單鏈核酸序列形成雙鏈體，允許用逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶聚合互補(bǔ)鏈。
這里所用的“分離的”核酸涉及一種與其原初環(huán)境不同的組分(例如，如果是自然發(fā)生的就指其自然環(huán)境，如果是合成的就指其反應(yīng)混合物)。一種分離的核酸含有與其最初聯(lián)系在一起成分的典型含量少于約50％，優(yōu)選其含量少于約75％，最佳含量少于約90％。
來源于一個(gè)設(shè)計(jì)序列的核酸序列涉及相應(yīng)于設(shè)計(jì)序列一個(gè)區(qū)域的序列。這包括與該序列同源或互補(bǔ)的序列。
一種內(nèi)陽性對照(IPC)靶核酸涉及克隆到隨后由特定的限制性內(nèi)切核酸酶作用而線性化的質(zhì)粒載體中的一個(gè)合成核酸序列。一種IPC具有包圍一般結(jié)合探針區(qū)域的多個(gè)引物結(jié)合序列，并作為在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中錯(cuò)誤陰性結(jié)果的一般對照。
優(yōu)選的內(nèi)陽性對照靶DNA序列為
5′-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3′<SEQ ID NO.10>.
這里或隨后公開的任何序列的核酸都可用常規(guī)方法制備。例如，用亞磷酰胺固相載體方法或其它熟知方法化學(xué)合成DNA，參考Matteucci et al.，1981，J.Am.Chem. Soc.1033185；Yoo et al.，1989，J.Biol.Chem. 76417078。也可用該領(lǐng)域熟知的許多方法修飾核酸。這種修飾化的非限制性實(shí)例包括甲基化，“加帽子結(jié)構(gòu)”，用類似物替代一個(gè)或多個(gè)自然發(fā)生的核苷酸，以及核苷酸間的修飾，例如，不帶電鍵合(如，甲基磷酸酯，磷酸三酯、磷酸酰胺，氨基甲酸酯，等)或帶電鍵合(如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，等)。核酸可能含有一個(gè)或多個(gè)附帶共價(jià)結(jié)合部分，如，蛋白質(zhì)(例如，核酸酶，毒素，抗體，信號(hào)肽，聚-L-賴氨酸等)，嵌入劑(例如，吖啶，補(bǔ)骨脂素，等)，螯合劑(例如，金屬，放射金屬，鐵，氧化金屬，等)，以及烷化劑。PNAs也包括在術(shù)語“核酸”范疇。核酸可以通過形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基磷酰胺鍵而衍生化。此外，本發(fā)明的核酸序列也可以用提供直接或間接檢測信號(hào)的標(biāo)記進(jìn)行修飾。典型的標(biāo)記包括放射同位素、熒光分子、生物素等等。
這里所用的擴(kuò)增涉及一種拷貝核酸的重復(fù)過程。合適的擴(kuò)增方法包括不受限制的PCR，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，鏈置換擴(kuò)增，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增，以及核酸單堿基擴(kuò)增。
本發(fā)明提供檢測生物樣品中HCV的方法。方法如下進(jìn)行<i>用內(nèi)含有的或來源于樣品的RNA作模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
<ii>用具有相應(yīng)于HCV RNA的5’或3’非編碼區(qū)序列的擴(kuò)增引物對來擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以產(chǎn)生HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
<iii>檢測HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。檢測HCV特異擴(kuò)增產(chǎn)物表明樣品中HCV RNA的存在。
根據(jù)本發(fā)明，可用任何常規(guī)方法從病人獲取生物樣品。合適的生物樣品不受限制，包括血液，血清，血漿，尿，乳汁，腦脊液。優(yōu)選血漿用作HCV RNA的來源。
生物樣品用任何方法處理，為樣品含有的RNA，特別是HCV RNA提供進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的試劑。來源于生物樣品的RNA是最初存在于樣品的任何RNA，并通過處理樣品而獲得。優(yōu)選地，用該領(lǐng)域熟知的方法從樣品中提取RNA，例如，用硫氰酸胍或可商業(yè)購得試劑的方法，以及采用Gentra系統(tǒng)的Purescript方法(Minneapolis MN)。能從Rnases，其它蛋白質(zhì)和/或其它可能干擾逆轉(zhuǎn)錄的成分中分離出RNA的任何提取步驟都可應(yīng)用。
然后對樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用(a)隨機(jī)引物，例如從Pharmacia Biotech，Piscataway，New Jersey得到的隨機(jī)六聚體引物，和/或(b)來源于HCV RNA基因組序列5’或3’NCRs的引物。用常規(guī)程序完成逆轉(zhuǎn)錄，例如下列文獻(xiàn)描述的方法，Current Protocols in Molecular Bidogy，Volumes I，II，III，1997(F.M.，Ausubel ed.)；U.SPatent 5，322，770；Young，et al.，J.Clin.Microbidl.31(4)882(1993)；Myers et al.，Biochemistry 30(3)7661(1991)。本發(fā)明中采用的適用于逆轉(zhuǎn)錄引物的其它引物和逆轉(zhuǎn)錄方法包括美國專利申請?zhí)枮镹o.09/＿＿，受理號(hào)為2904/OE287的專利中的描述。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增。任何擴(kuò)增方法都可不受限制地采用，包括，PCR，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，鏈置換反應(yīng)，核酸單堿基擴(kuò)增，以及轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增。優(yōu)選采用PCR。典型地，含有PCR所有需要成分的反應(yīng)混合物直接加到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物中。然后采用所用引物對在特異性條件下進(jìn)行擴(kuò)增。
本發(fā)明公開了特別有利于檢測病人樣品中HCV RNA的一些HCV特異性擴(kuò)增引物。來源于HCV基因組5’NCR的有用的引物的非限制實(shí)例包括下面表1所列舉的例子。
9>組成的反向引物。
本發(fā)明也包括多重?cái)U(kuò)增，即在同一反應(yīng)混合物中用不同組引物同時(shí)擴(kuò)增不同序列。能同時(shí)用于多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的優(yōu)選引物對是(a)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’<SEQ ID No.2>，5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(5’對)<SEQ ID No.7>；(b)5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’<SEQ ID No.8>，5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(3’對)<SEQ ID No.9>。
擴(kuò)增后接著不受限制地用該領(lǐng)域任何方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，包括，瓊脂或丙烯酰胺凝膠電泳；非同位素比色檢測，如SureCell系統(tǒng)(見實(shí)施例1)；Eci檢測；熒光和化學(xué)發(fā)光。這類檢測方法所用試劑可從很多地方得到，例如，Molecular Probe，Eugene，Oregon and Ortho Clinical Diagnostics，Rochester，NY。
檢測HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物表明樣品中HCV RNA的存在。當(dāng)用凝膠電泳時(shí)，與相應(yīng)于反應(yīng)用到的擴(kuò)增引物序列的HCV RNA定位預(yù)測相同，根據(jù)其大小來證實(shí)HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。用于比色檢測的HCV特異性5’NCR捕捉探針包括但不限于5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’<SEQ ID NO.11>，5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’<SEQ ID No.12>，5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’<SEQ ID No.13>。有用的HCV特異性的3’NCR捕捉探針包括但不限于5’-GCGGCTCACGGACCTTTCAC AGCTA-3’<SEQ ID No.14>和5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’<SEQ IDNo.15>。
制備擴(kuò)增來源于HCV RNA的HCV DNA試劑盒，使其含有一對或多對正向和反向5’NCR寡核苷酸引物，正向引物可以是5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>或5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>，反向引物可以是5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ IDNo.4>，5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ IDNo.5>，5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ IDNo.6>，或5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ IDNo.7>。
來源于HCV RNA的HCV DNA擴(kuò)增試劑盒也可以制備成含有一對或多對正向和反向3’NCR寡核苷酸引物，其中正向引物可能是5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>，反向引物可能是寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNo.9>。
檢測HCV DNA存在的試劑盒，包括上述用于擴(kuò)增來源HCV RNA的HCVDNA的5’和3’NCR引物也屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本試劑盒附含用于逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測的試劑和指導(dǎo)。例如，試劑盒可含有逆轉(zhuǎn)錄酶，脫氧核苷酸，適用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)的熱穩(wěn)定聚合酶以及用于標(biāo)記和檢測核酸的試劑。
本發(fā)明可用于病人HCV感染的診斷，檢驗(yàn)抗HCV治療方案的功效，以及篩選提供感染HCV樣品的血液。
下列實(shí)施例沒有限制地闡述了本發(fā)明。實(shí)施例1生物樣品中HCV的檢測5’HCV擴(kuò)增引物和Roche Amplicor HCV鑒定的比較。
進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以比較本發(fā)明和Roche Amplicor系統(tǒng)的HCV鑒定。A.方法1.樣品制備用Pure Script RNA分離試劑(Gentra Systems，Minneapolis MN)從血漿樣品中制備RNA。修改廠商的用體液制備方案，包括，用40克糖原而不是用20克糖原作為載體以輔助沉淀病毒RNA。此外，大多數(shù)情況下，用異丙醇沉淀RNA并用乙醇洗滌RNA沉淀之后，RNA沉淀再懸浮到RT緩沖混合液中，而不是懸浮到廠商提供的RNA水合溶液中。
2.逆轉(zhuǎn)錄在下述溶液中加入100u重組莫洛尼鼠類白血病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)(Gibco BRL，Gaithorsburg，Maryland)催化由RNA合成cDNA，50mL溶液組成是50mM Tris-HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，0.4mM各種dNTP(Pharmacia Biotech)，4mM隨機(jī)六聚體(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)或特異性逆轉(zhuǎn)錄引物，以及用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過水中的20Units RNasin(Promega，Madison，Wisconsin)。在42℃培育30分鐘后，RT反應(yīng)在100℃持續(xù)5分鐘以破壞RT活性。每個(gè)反應(yīng)冷卻1分鐘，然后在16000xg微量離心4秒鐘。
3.PCR擴(kuò)增在PE9600熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer)中以100ml下述溶液進(jìn)行PCR，25mMTris-HCl，3mM MgCl2，0.725mM EDTA，54mM KCl，3.72mM NaCl，40mM DTT，108mg/mL明膠(IV號(hào))，9.5％甘油，0.02％吐溫20，0.02％ NP40，小牛胸腺DNA(2μg)，1.2mM各種dNTP，0.4mM各種引物，10拷貝線性化內(nèi)陽性對照(IPC)質(zhì)粒DNA，以及16u的Taq聚合酶。用美國專利5,338,671公開的制備方法制取的Taq的單克隆抗體TP1-12和TP4-9分別以50∶1和5∶1摩爾比加入到反應(yīng)中，提供抗體和Taq聚合酶為55∶1的摩爾比。經(jīng)96℃初始變性3分鐘后，在96℃保溫5秒鐘，在68℃保溫40秒鐘進(jìn)行擴(kuò)增40循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，在103℃熱處理5分鐘使Taq聚合酶失活。所用的引物如下表2所示
*標(biāo)準(zhǔn)取向S＝有義；AS＝反義；**SEQ ID No.
預(yù)期的產(chǎn)物大小在下面表3中顯示。
4.PCR產(chǎn)物的檢測在擴(kuò)增過程中，用5’-生物素標(biāo)記引物(有義鏈)使PCR產(chǎn)物生物素化。用共價(jià)附著于乳汁顆粒的寡核苷酸探針雜交而捕獲產(chǎn)物，在流動(dòng)膜表面上沉積下來(Sure Cell tests，Ortho Clinical Diagnostics，Rochester，NY)，該探針是，5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(標(biāo)示為C96-27-PRB)<SEQ IDNo.11>；5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(標(biāo)示為C252-27-PRB)<SEQ ID No.12>；5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(標(biāo)示為C252-25-PRB)<SEQ ID No.13>。用催化一種染料前體氧化成染料(藍(lán)色)的鏈霉抗生物素(SA)-辣根過氧化酶(HRP)偶聯(lián)物與探針/產(chǎn)物復(fù)合物反應(yīng)。色強(qiáng)度與顏色標(biāo)準(zhǔn)比較將藍(lán)色強(qiáng)度直觀地做記號(hào)(0-10)。所有的視覺顏色記號(hào)大于3才視為陽性結(jié)果。
5.Roche Amplicor鑒定Roche Amplicor鑒定(Roche Diagnostics，Kaiseraugst，Switzerland)按照廠商說明實(shí)行。B結(jié)果一組來自巴西和埃及病人的42個(gè)樣品用上述方法檢測HCV。其中有些樣品也用Chiron B-DNA分析方法作了檢測。預(yù)期巴西樣品比美國樣品含有更大比例的HCV基因型3，而埃及樣品主要含有HCV基因型4，這種基因型在美國很少發(fā)現(xiàn)。
所有反應(yīng)都一式二份進(jìn)行。陽性記錄表明二個(gè)反應(yīng)都呈陽性。結(jié)果如下表4所示
用本發(fā)明5’NCR引物和Roche檢測系統(tǒng)所得結(jié)果比較總結(jié)于下表5和表6表5Roche Amplicor+
+C131/C294 -(長產(chǎn)物)表6Roche Amplicor+
表7Roche Amplicor+-
+131F/294R -表8Roche Amplicor+ -
+69F/133R -本發(fā)明的兩個(gè)5’NCR引物對都比Roche檢測系統(tǒng)的靈敏度更高。采用69F/133R引物對獲得最高靈敏度，與C131/C294引物對相比，檢測出另外三個(gè)樣品中HCVRNA的存在。實(shí)施例25’NCRHCV檢測法靈敏度的分析。
用本發(fā)明的5’NCR引物對進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)HCV檢測方法的靈敏度。
1．根據(jù)HCV RNA的理論拷貝數(shù)稀釋三個(gè)病人的樣品，并用Roche Amplicor系統(tǒng)和本發(fā)明的引物對分析HCV RNA。結(jié)果如下表9所示
這三組稀釋病人樣品，用本發(fā)明的5’NCR引物分析比用Roche檢測法分析的靈敏度更高。
2.用HCV陰性血漿稀釋已知為HCV陽性血漿，并用上述方法檢測。一種內(nèi)部陽性對照(IPC)質(zhì)粒以10拷貝/反應(yīng)加入到反應(yīng)混合物中。結(jié)果(五個(gè)實(shí)驗(yàn)匯編)如下表10所示。
正如Poisson分布分析所預(yù)測，C131F/C294R 5’NCR引物對具有極好的靈敏度，即便每個(gè)PCR反應(yīng)少到單個(gè)病毒粒子也能檢測到。
3.來自帶有少量HCV病毒(范圍＝316-8080拷貝/ml，相應(yīng)于16-404拷貝/PCR反應(yīng))病人的十八份病人的樣品，在該檢測中有十七個(gè)樣品呈陽性。實(shí)施例3生物樣品中HCV的檢測3’NCR HCV擴(kuò)增引物和Roche Amplicor HCV分析的比較。
用Roche Amplicor鑒定和用本發(fā)明的3’NCR引物檢查取自巴西的150份血漿樣品，這些樣品以前檢測為HCV抗體陽性。如實(shí)施例1所述方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。用序列為5’GTATCAGCACTC-3’<SEQ ID No.16>的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用X1F27/57R27引物對進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)反應(yīng)含有質(zhì)粒DNA的內(nèi)陽性對照(IPC)。用Sure Cell系統(tǒng)，用一種捕獲探針3X30PRB25檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。每個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物都進(jìn)行凝膠檢測以證實(shí)結(jié)果。含有陰性血漿樣品和水(無RNA)的陰性對照(散布于臨床樣品)都被涉及到，在RT-PCR中都呈陰性。用本發(fā)明引物和Roche分析系統(tǒng)所得結(jié)果的比較總結(jié)于表11。
表11ROCHE AMPLICOR+ -
1F27/57R2 +3’試驗(yàn)-實(shí)施例4生物樣品中HCV的檢測本發(fā)明和Rochester綜合醫(yī)院(RGH)5’NCR嵌套式PCR分析法的比較。
進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以比較本發(fā)明3’NCR HCV引物和RGH嵌套式PCR檢測系統(tǒng)。
用57R27引物逆轉(zhuǎn)錄八十三份血漿樣品，用3X1F27/57R27引物對采用實(shí)施例1所述方法對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠檢測以證實(shí)結(jié)果。含有陰性血漿樣品和水(無RNA)的陰性對照(散布于臨床樣品)也被涉及，在該檢測中都呈陰性。
用本發(fā)明引物和Roche分析系統(tǒng)所得結(jié)果的比較總結(jié)于表12。
表125’嵌合試驗(yàn)(RG)+ -
1F27/57R2 +3’試驗(yàn) -這些結(jié)果表明本發(fā)明的檢測系統(tǒng)比RGH嵌套式PCR系統(tǒng)更加靈敏而特效。按本發(fā)明的分析與RGH分析的26個(gè)陰性樣品中的25個(gè)結(jié)果相符。本發(fā)明的好處在于比進(jìn)行嵌套式PCR的樣品遺留可能性更小，因?yàn)閷τ诤笳?，在反?yīng)過程中必須打開試管以添加新試劑。上述顯示錯(cuò)誤陰性結(jié)果的單個(gè)樣品可能是嵌套式PCR方案引起的樣品遺留的例證。實(shí)施例53’NCR HCV分析法的拷貝靈敏性進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)以測定本發(fā)明3’NCR HCV分析法的檢測靈敏性。
已有Roche Monitor和Chiron B-DNA分析方法檢測HCV的血漿樣品，獲自Boston Biomedica，Inc.，制備RNA，稀釋到含有20-1000拷貝HCV RNA/ml，并用實(shí)施例1所述方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。用66RT(12聚體)引物(表13)或57R27(27聚體)引物(表14)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，分別以1F27和57R27作正向和反向引物進(jìn)行PCR。在該分析中加進(jìn)內(nèi)陽性對照(IPC)引物，導(dǎo)致每個(gè)樣品的陽性記錄。以基于凝膠帶和用3X-30PRB25作捕獲探針的Surecell呈陽性的樣品百分率來表示所得結(jié)果。
3’NCR HCV分析方法檢測1000病毒拷貝/ml·100％時(shí)間，和200拷貝/ml·88-100％時(shí)間。對于100拷貝/ml，在大約50％樣品中檢測到病毒(用一種12聚體RT引物時(shí))。Poisson分布預(yù)測對于1拷貝/反應(yīng)(20病毒粒子/ml)，陽性結(jié)果頻率應(yīng)大約為60％。對于這種水平的病毒只檢測出20％，可能是由于并非在每個(gè)病毒粒子都存在HCV的3’-NCR，或者是由于在用短(12聚體)逆轉(zhuǎn)錄引物作檢測時(shí)引起靈敏度降低。對同一樣品用5’NCR引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增檢測，導(dǎo)致較高水平地檢測到20拷貝/ml樣品，從而有力地支持了后一種解釋。這些結(jié)果表明采用較長(27體)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄可以增加3’NCR檢測的靈敏度(如表13、表14，分別用12-聚體和27聚體引物對10拷貝/rxn檢測的比較)。實(shí)施例6具有不同HCV基因型病人樣品的分析進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以評定對不同基因型HCV的檢測。
1.基因型范圍黑猩猩血漿，代表各種基因型HCV，獲自NIH。按實(shí)施例1所述方法制備并處理血漿。5’NCR引物是C131F和C294R(分別為正向和反向引物)，3’NCR引物是1F27和57R27(分別為正向和反向引物)，在4％瓊脂凝膠上用溴化乙錠染色分析PCR產(chǎn)物得出結(jié)果。根據(jù)重復(fù)樣品得到陽性結(jié)果。結(jié)果見下表15(用5’NCR引物)和表16(用3’NCR引物)所示
定了當(dāng)今所有HCV基因型(基因型1-6)。
3.低拷貝數(shù)樣品
采用Roche Monitor分析法定量含有不同基因型HCV的樣品(基因型1-6，獲自美國、蘇格蘭，突尼斯，沙特阿拉伯和香港)，稀釋到50病毒拷貝/PCR反應(yīng)(1000拷貝/ml)，并用上述C131F和C294R引物進(jìn)行檢測。
用本發(fā)明的引物檢測所有樣品。實(shí)施例7用5’和3’擴(kuò)增引物對進(jìn)行多重分析進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以分析在單個(gè)反應(yīng)混合物中同時(shí)擴(kuò)增HCV基因組的5’NCR和3’NCR區(qū)域的效果。
A與Roche Monitor分析比較檢測含有相當(dāng)于45和170,000病毒拷貝/反應(yīng)的73份病人樣品。這些樣品取自己知感染了HCV并用干擾素治療過的病人。結(jié)果，一些病人很少或者沒有循環(huán)病毒。用5’NCR引物對131F/294R和3’NCR引物對1F27/57R27以及IPC引物以多重方案對該組進(jìn)行檢測。整個(gè)檢測樣品中安置陰性臨床樣品。所有的陰性都導(dǎo)致RT-PCR陰性。所得結(jié)果與用定量Roche Monitor分析所得結(jié)果比較(Roche診斷法，Kaiseraugst，瑞士)。結(jié)果總結(jié)于下表17。
表17ROCHE 監(jiān)視器+ -
多重試驗(yàn) +-用本發(fā)明的5’和3’NCR引物對，對于按Roche Monitor結(jié)果檢測不出的另一個(gè)樣品，可以用5’NCR和3’NCR分析檢測到，這表明在分析帶有低量病毒樣品時(shí)用本發(fā)明的引物分析比Roche分析法靈敏度更高。用Roche分析法檢測不出的陽性樣品，用另一5’NCR引物69F/133R得到了證實(shí)。
B與Roche Amplicor分析法比較用5’引物對131F/294R和3’引物對1F27/57R27以多重方案檢測了十六份病人樣品，這些樣品用重組免疫印跡分析法(RIBA)檢測不出來。該結(jié)果與用定性Roche Amplicor分析所得結(jié)果作了比較。結(jié)果總結(jié)于下表18。
表18ROCHE AMPLICOR+ -
多重試驗(yàn) +-本發(fā)明分析法與Roche分析結(jié)果完全一致。用單個(gè)RNA提取物進(jìn)行的所有PCR反應(yīng)都是一式二份。以另一組5’NCR引物(69F/133R)進(jìn)行擴(kuò)增來證實(shí)陰性結(jié)果。所有陰性都重復(fù)檢測以證實(shí)真實(shí)的陰性結(jié)果。
上面提及的所有專利、申請、論文、出版物及檢測方法在這里都完整地作為參考文獻(xiàn)而引用。熟悉該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)以上具體描述對本發(fā)明進(jìn)行一些變更。這種明顯的變更都在附加權(quán)利要求的所有預(yù)期范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測生物樣品中丙型肝炎病毒(HCV)RNA存在的方法，該方法包括(A)用來源于所說樣品的RNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以產(chǎn)生HCV特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；(B)用HCV特異的一對或多對寡核苷酸引物擴(kuò)增所說的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以產(chǎn)生HCV特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所說引物對選自以下序列(a)正向引物5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>和反向引物5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，或者(b)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>和反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>，以及(c)正向引物5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>和選自以下序列的反向引物(i)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ IDNo.5>，(ii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ IDNo.6>；(C)檢測所說的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中檢測到所說擴(kuò)增產(chǎn)物表明所說樣品中HCV RNA的存在。
2.一種如權(quán)利要求1所限定的方法，其中所說逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用隨機(jī)寡核苷酸引物進(jìn)行。
3.一種如權(quán)利要求1所限定的方法，其中所說逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用具有相應(yīng)于HCV RNA序列之序列的一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸引物進(jìn)行。
4.一種如權(quán)利要求1所限定的方法，其中所說的擴(kuò)增用選自下述的方法進(jìn)行PCR、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴(kuò)增、核酸單堿基取代、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增。
5.一種如權(quán)利要求1所限定的方法，其中所說的檢測包括用凝膠電泳顯示所說的擴(kuò)增產(chǎn)物。
6.一種如權(quán)利要求1限定的方法，其中所說的檢測包括在含有一個(gè)或多個(gè)HCV特異寡核苷酸探針的固相支持物上俘獲所說的擴(kuò)增產(chǎn)物，以及用比色分析法定量所說的俘獲產(chǎn)物。
7.一種如權(quán)利要求6限定的方法，其中所說的探針包括選自以下序列中的一個(gè)(a)5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNo.13>，(b)5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQ IDNo.12>，所說的正向引物是(C131F25)或者(C143F26)；其中所說的探針包括；(c)5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQ IDNo.11>，所說的正向引物是(C69F28)。
8.一種如權(quán)利要求1限定的方法，其中所說的樣品選自血液、血清、血漿、尿、唾液和腦脊液。
9.一種擴(kuò)增HCV DNA的方法，所說方法包括(A)用一對或多對HCV特異的寡核苷酸引物對含HCV DNA的DNA樣品進(jìn)行PCR，以產(chǎn)生HCV特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所說引物對選自以下序列，(a)正向引物5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>和反向引物5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>；或者(b)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>和反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>；和(c)正向引物5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>和選自以下序列的反向引物(i)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ IDNo.5>，(ii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ IDNo.6>。
10.一種如權(quán)利要求9限定的方法，還包括(B)檢測所說擴(kuò)增產(chǎn)物，其中檢測到所說擴(kuò)增產(chǎn)物表明所說樣品中HCV DNA的存在。
11.一種如權(quán)利要求10限定的方法，其中所說的檢測包括通過凝膠電泳顯示所說的擴(kuò)增產(chǎn)物。
12.一種如權(quán)利要求10所限定的方法，其中所說的檢測包括在含有一個(gè)或多個(gè)HCV特異寡核苷酸探針的固相支持物上俘獲所說的擴(kuò)增產(chǎn)物，以及用比色分析法定量所說的俘獲產(chǎn)物。
13.一種如權(quán)利要求10所限定的方法，其中所說的探針包括選自以下序列中的一個(gè)(a)5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNo.13>，和(b)5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQID No.12)，所說的正向引物是(C131F25)或者(C143F26)，和其中所說的探針包括(c)5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQID No.11>，所說的正向引物是(C69F28)。
14.一種檢測生物樣品中HCV RNA存在的方法，所說的方法包括(A)用來自所說樣品的模板RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以產(chǎn)生HCV特異的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；(B)用正向和反向引物擴(kuò)增所說的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以產(chǎn)生HCV特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所說的正向引物由寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>組成，所說的反向引物由寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>組成；(C)檢測所說的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中檢測到所說的擴(kuò)增產(chǎn)物表明所說樣品中HCV RNA的存在。
15.一種如權(quán)利要求14限定的方法，其中所說的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用隨機(jī)寡核苷酸引物進(jìn)行。
16.一種如權(quán)利要求14限定的方法，其中所說的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用一個(gè)或多個(gè)具有相應(yīng)于HCV RNA序列之序列的寡核苷酸引物進(jìn)行。
17.一種如權(quán)利要求14限定的方法，其中所說的擴(kuò)增選自一種以下方法進(jìn)行PCR、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴(kuò)增、核酸單堿基取代、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增。
18.一種如權(quán)利要求14限定的方法，其中所說的檢測包括用凝膠電泳顯示所說的擴(kuò)增產(chǎn)物。
19.一種如權(quán)利要求14限定的方法，其中所說的檢測包括在含有一個(gè)或多個(gè)HCV特異寡核苷酸探針的固相支持物上俘獲所說的擴(kuò)增產(chǎn)物，以及用比色分析法定量所說的俘獲產(chǎn)物。
20.一種如權(quán)利要求19限定的方法，其中所說的探針選自以下序列5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’(30PRB25)<SEQ ID No.14>和5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’(32PRB25)<SEQ ID No.15>。
21.一種如權(quán)利要求14限定的方法，其中所說樣品選自血液、血清、血漿、尿、唾液，腦脊液。
22.一種擴(kuò)增HCV DNA的方法，所說的方法包括(A)用一個(gè)正向引物和一個(gè)反向引物對含有HCV DNA的DNA樣品進(jìn)行PCR，以產(chǎn)生HCV特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所說的正向引物由寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>組成，所說的反向引物由寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>組成。
23.一種如權(quán)利要求22限定的方法，還包括(B)檢測所說的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中檢測到所說的擴(kuò)增產(chǎn)物表明所說的樣品中HCV DNA的存在。
24.一種如權(quán)利要求23限定的方法，其中所說的檢測包括用凝膠電泳顯示所說的擴(kuò)增產(chǎn)物。
25.一種如權(quán)利要求23限定的方法，其中所說的檢測包括在含有一個(gè)或多個(gè)HCV特異寡核苷酸探針的固相支持物上俘獲所說的擴(kuò)增產(chǎn)物，以及用比色分析法定量所說的俘獲產(chǎn)物。
26.一種如權(quán)利要求25限定的方法，其中所說的探針選自以下序列5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’(30PRB25)<SEQ ID No.14>和5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’(32PRB25)<SEQ ID No.15>。
27.一種檢測生物樣品中HCV RNA存在的方法，所說方法包括(A)用來源于所說樣品的模板RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以產(chǎn)生HCV特異的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(B)用一對或多對HCV特異的5’NCR寡核苷酸引物和一對或多對3’NCR寡核苷酸引物擴(kuò)增所說的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以產(chǎn)生HCV特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所說的5’NCR引物對選自以下序列(a)正向引物5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>和反向引物5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，(b)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>和反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>，(c)正向引物5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>和選自以下序列的反向引物(i)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ IDNo.5>，(ii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ IDNo.6>；其中，每個(gè)所說的3’NCR寡核苷酸引物對包括一個(gè)由寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCTAGTCCG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>組成的正向引物和一個(gè)由寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>組成的反向引物，(C)檢測所說的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中檢測到所說的擴(kuò)增產(chǎn)物表明所說的樣品中HCV RNA的存在。
28.一種如權(quán)利要求27限定的方法，其中所說的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用寡核苷酸隨機(jī)引物進(jìn)行。
29.一種如權(quán)利要求27限定的方法，其中所說的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用具有相應(yīng)于HCV RNA序列之序列的一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸引物進(jìn)行。
30.一種如權(quán)利要求27限定的方法，其中所說的擴(kuò)增用選自下述的方法進(jìn)行PCR、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴(kuò)增、核酸單堿基取代、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增。
31.一種如權(quán)利要求27限定的方法，其中所說的檢測包括用凝膠電泳顯示所說的擴(kuò)增產(chǎn)物。
32.一種如權(quán)利要求27限定的方法，其中所說的檢測包括在含有一個(gè)或多個(gè)HCV特異寡核苷酸探針的固相支持物上俘獲所說的擴(kuò)增產(chǎn)物，以及用比色分析法定量所說的俘獲產(chǎn)物。
33.一種如權(quán)利要求32限定的方法，其中所說的探針包括選自下列序列中的一個(gè)(a)5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNo.13>，和(b)5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQ IDNo.12>，所說的5’NCR正向引物是(C131F25)或(C143F26)；其中所說的探針包括(c)5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQ IDNo.11>，所說的5’NCR正向引物是(C69F28)，其中所說的探針包括選自下列序列中的一個(gè)(d)5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’(30PRB25)<SEQ IDNo.14>；和(e)5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’(32PRB25)<SEQ IDNo.15>。
34.一種如權(quán)利要求27限定的方法，其中所說樣品選自血液、血清、血漿、尿、唾液、和腦脊液。
35.一種擴(kuò)增HCV DNA的方法，所說方法包括(A)用一對或多對HCV特異的5’NCR寡核苷酸引物和一對或多對3’NCR寡核苷酸引物對含有HCV DNA的DNA樣品進(jìn)行PCR，以產(chǎn)生HCV特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所說的5’NCR引物對選自以下序列(a)正向引物5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>和反向引物5’-GGGTTCCGCAGAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，或者(b)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQID No.2>和反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>；和(c)正向引物5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>和選自以下序列的一個(gè)反向引物(i)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ IDNo.5)，(ii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ IDNo.6>；其中，每對所說的3’NCR寡核苷酸引物包括一個(gè)寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>的正向引物和一個(gè)含有5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNo.9>寡核苷酸的反向引物。
36.一種如權(quán)利要求35限定的方法，還包括(B)檢測所說的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中檢測到所說的擴(kuò)增產(chǎn)物表明所說的樣品中HCV DNA的存在。
37.一種如權(quán)利要求36限定的方法，其中所說的檢測包括用凝膠電泳顯示所說的擴(kuò)增產(chǎn)物。
38.一種如權(quán)利要求36限定的方法，其中所說的檢測包括在含有一個(gè)或多個(gè)HCV特異寡核苷酸探針的固相支持物上俘獲所說的擴(kuò)增產(chǎn)物，以及用比色分析法定量所說的俘獲產(chǎn)物。
39.一種如權(quán)利要求38限定的方法，其中所說的探針包括選自下列序列的一個(gè)(a)5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ ID NO.13>，和(b)5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQ ID NO.12>，其中所說的5’NCR正向引物是(C131F25)或(C143F26)；其中所說的探針包含(c)5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQ ID No.11>，其中所說的5’NCR正向引物是(C69F28)；其中所說的探針包含選自下組中的一個(gè)(d)5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’(30PRB25)<SEQ ID NO.14>；和(e)5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’(32PRB25)<SEQ ID NO.15>。
40.選自以下序列組中的一個(gè)寡核苷酸5′-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3′(C69F28)<SEQ ID NO.1>.5′-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3′(C131F25)<SEQ ID NO.2>.5′-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3(C143F26)<SEQ ID NO.3>.5′-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3′(C133R26)<SEQ ID NO.4>.5′-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3′(C282R27)<SEQ ID NO.5>.5′-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3′(C287R27)<SEQ ID NO.6>.5′-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3′(C294R25)<SEQ ID NO.7>.5′-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3′(1F27)<SEQ ID NO.8>.5′-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3(57R27)<SEQ ID NO.9>.5′-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3′(C96-22-PRB)<SEQ ID NO.11>.5′-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3′(C252-27-PRB)<SEQ ID NO.12>.5′-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3′(C252-25-PRB)<SEQ ID NO.13>.5′-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3′(30PRB25)<SEQ ID NO.14>.5′-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3′(32PRB25)<SEQ ID NO.15>。
41.選自以下序列組中一個(gè)HCV特異的擴(kuò)增引物寡核苷酸5′-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3′(C69F28)<SEQ ID NO.1>.5′-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3′(C131F25)<SEQ ID NO.2>.5′-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3(C143F26)<SEQ ID NO.3>.5′-GGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3′(C133R26)<SEQ ID NO.4>.5′-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3′(C282R27)<SEQ ID NO.5>.5′-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3′(C287R27)<SEQ ID NO.6>.5′-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3′(C294R25)<SEQ ID NO.7>.5′-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3′(1F27)<SEQ ID NO.8>.5′-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3(57R27)<SEQ ID NO.9>。
42.一種含有選自以下序列組中的一個(gè)寡核苷酸的探針。5′-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3′(C96-22-PRB)<SEQ ID NO.11>.5′-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3′(C252-27-PRB)<SEQ ID NO.12>.5′-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3′(C252-25-PRB)<SEQ ID NO.13>.5′-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3′(30PRB25)<SEQ ID NO.14>.5′-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3′(32PRB25)<SEQ ID NO.15>。
43.一種擴(kuò)增來源于HCV RNA的HCV DNA的試劑盒，所說的試劑盒含有一對或多對5’NCR寡核苷酸引物，其中所說的5’NCR引物對選自以下序列組(a)正向引物5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID NO.1>和反向引物5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGGTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID NO.4>；(b)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID NO.2>和反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID NO.7>；和(c)正向引物5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3(C143F26)<SEQ ID NO.3>和選自下組中的一個(gè)反向引物(i)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ IDNO.5>，(ii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ IDNO.6>。
44.一種如權(quán)利要求43限定的試劑盒，還包括一對或多對3’NCR寡核苷酸引物，其中每對3’NCR寡核苷酸引物包括一個(gè)寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>組成的正向引物和一個(gè)寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>組成的反向引物。
45.一種如權(quán)利要求43限定的試劑盒，還包括一個(gè)或多個(gè)探針。
46.一種如權(quán)利要求44限定的試劑盒，還包括一個(gè)或多個(gè)探針。
47.一種如權(quán)利要求45限定的試劑盒，其中所說的探針包含選自以下序列組的一個(gè)(a)5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNo.13>，和(b)5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQID NO.12>，其中所說5’NCR正向引物是(C131F25)或(C143F26)；和其中所說的探針包含(c)5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQID NO.11>，其中所說的5’NCR正向引物是(C69F28)。
48.一種如權(quán)利要求46限定的試劑盒，其中所說探針包含選自以下序列組的一個(gè)(a)5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNO.13>，和(b)5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQID No.12>，其中所說的5’NCR正向引物是(C131F25)或(C143F26)；其中所說的探針包含(c)5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQID NO.11>，其中所說的5’NCR正向引物是(C69F28)；其中所說的探針包含選自下列中的一個(gè)(d)5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’(30PRB25)<SEQ IDNO.14>；和(e)5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’(32PRB25)<SEQ IDNO.15>。
49.一種如權(quán)利要求43限定的試劑盒，其中所說的5’NCR引物對由5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>和5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>組成。
50.一種如權(quán)利要求43限定的試劑盒，其中所說的5’NCR引物對由5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>和5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>組成。
51.一種用于擴(kuò)增來源于HCV RNA的HCV cDNA的試劑盒，所說的試劑盒包含一對或多對3’NCR寡核苷酸引物，其中每對所說的3’NCR寡核苷酸引物包括一個(gè)寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<DEQID No.8>組成的正向引物和一個(gè)寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>組成的反向引物。
52.一種如權(quán)利要求51限定的試劑盒，還包含一個(gè)或多個(gè)探針。
53.一種如權(quán)利要求52限定的試劑盒，其中所說的探針選自以下序列組(a)5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’(30PRB25)<SEQ IDNo.14>，和(b)5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’(32PRB25)<SEQ IDNo.15>。
54.一種檢測HCV DNA存在的試劑盒，所說的試劑盒包含一對或多對5’NCR寡核苷酸引物，其中所說的5’NCR引物對選自以下序列組(a)正向引物5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID NO.1>和反向引物5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID NO.4>；或(b)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>和反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID NO.7>；和(c)正向引物5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3(C143F26)<SEQ ID NO.3>和選自下組的反向引物(i)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ IDNO.5>，(ii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ IDNO.6>。
55.一種如權(quán)利要求54限定的試劑盒，還包含一對或多對3’NCR寡核苷酸引物，其中每對所說的3’NCR寡核苷酸引物包含一個(gè)寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>組成的正向引物和一個(gè)寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>組成的反向引物。
56.一種如權(quán)利要求54限定的試劑盒，還包含一個(gè)或多個(gè)探針。
57.一種如權(quán)利要求55限定的試劑盒，還包含一個(gè)或多個(gè)探針。
58.一種如權(quán)利要求56限定的試劑盒，其中所說的探針包含選自以下序列組的一個(gè)(a)5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNO.13>和(b)5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQID NO.12>，其中所說的5’NCR正向引物是(C131F25)或(C143F26)；其中所說的探針包含(c)5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTAT-3’(C96-22-PRB)<SEQID NO.11>，其中所說的5’NCR正向引物是(C69F28)。
59.一種如權(quán)利要求57限定的試劑盒，其中所說的探針包含選自以下序列組的一個(gè)(a)5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNO.13>，和(b)5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQID NO.12>，其中所說的5’NCR正向引物是(C131F25)或(C143F26)；其中所說的探針包含(c)5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQID NO.11>，其中所說的5’NCR正向引物是(C69F28)；和其中所說的探針包含選自下組中的一個(gè)(d)5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’(30PRB25)<SEQ IDNO.14>；和(e)5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’(32PRB25)<SEQ IDNO.15>。
60.一種如權(quán)利要求54限定的試劑盒，其中所說的5’NCR引物對由5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>和5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>組成。
61.一種如權(quán)利要求54限定的試劑盒，其中所說的5’NCR引物對由5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>和5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>組成。
62.一種檢測HCV RNA存在的試劑盒，所說的試劑盒包含一對或多對3’NCR寡核苷酸引物，其中每對3’NCR寡核苷酸引物包含一個(gè)寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>組成的正向引物和一個(gè)寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>組成的反向引物。
63.一種如權(quán)利要求62限定的試劑盒，還包含一個(gè)或多個(gè)探針。
64.一種如權(quán)利要求63限定的試劑盒，其中所說的探針選自以下序列組5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’(30PRB25)<SEQ ID No.14>和5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’(32PRB25)<SEQ ID No.15>。
全文摘要
本文描述了檢測取自人類受試者生物樣品中的丙型肝炎病毒RNA的方法和試劑盒。本發(fā)明包括用于擴(kuò)增來源于HCV RNA的DNA的新型擴(kuò)增引物和探針,以及與這種新型引物相關(guān)的試劑盒和方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1274757SQ00108390
公開日2000年11月29日 申請日期2000年2月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月3日
發(fā)明者J·M·林南, K·M·戈曼 申請人:奧索臨床診斷有限公司