專利名稱：用于均相熒光pcr檢測的孿生引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因的擴(kuò)增與檢測。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)已廣泛應(yīng)用于基于核酸的各個研究領(lǐng)域，在臨床診斷方面的應(yīng)用也日益增加，均相熒光PCR是近幾年發(fā)展起來的新型檢測技術(shù)。目前均相熒光PCR檢測技術(shù)已有多種方式，根據(jù)是否具備識別特異擴(kuò)增片段的能力可以分為非探針型和探針型兩類。非探針型有熒光嵌入劑法和Sunrise Primer(又稱Amplifluor)，探針型包括5′-核酸外切酶技術(shù)(TaqMan探針)、分子信標(biāo)(molecular beacon)技術(shù)、應(yīng)用于Lightcycler的雙探針技術(shù)、蝎子引物(Scorpions primer)以及AmpliSensor等。前一類型設(shè)計(jì)簡單，但由于無法識別非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，在實(shí)際應(yīng)用中受到很大限制。后一種類型，由于增加了探針識別步驟，提高了測定的可靠性，但實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜，價(jià)格高昂。這兩類技術(shù)缺點(diǎn)的根源在于它們都缺乏有效預(yù)防非特異擴(kuò)增的機(jī)制。
目前預(yù)防非特異擴(kuò)增技術(shù)主要有固體石蠟法和熱啟動法(hot-start)。固體石蠟法是預(yù)先將DNA聚合酶用固體石蠟與其它反應(yīng)成分隔開，這樣，即使在低溫階段存在非特異結(jié)合，由于沒有聚合酶的參與也就無法形成延伸產(chǎn)物。隨著溫度升高，低熔點(diǎn)的結(jié)合全部解離，此時(shí)聚合酶才通過融化的石蠟與反應(yīng)成分接觸，而發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。該法消除了反應(yīng)開始前至升溫這一階段引起的非特異擴(kuò)增。顯然，由于石蠟只能發(fā)揮一次性作用，對以后循環(huán)中退火階段可能發(fā)生的非特異擴(kuò)增無能為力。由于固體石蠟?zāi)しú僮鳠┈?，易引入污染，目前?yīng)用已很少。另一種常用的方法是熱啟動技術(shù)，通過對聚合酶進(jìn)行處理，如聚合酶抗體技術(shù)，聚合酶人工修飾等，使聚合酶在低溫階段不具活性，高溫時(shí)活性才得以發(fā)揮，如PE公司著名的AmpliTaq Gold等。經(jīng)過處理的聚合酶可以預(yù)先與反應(yīng)組分混合，其作用機(jī)制與固體石蠟法相似，同樣只能在反應(yīng)開始前至升溫這一階段發(fā)揮一次性作用。熱啟動技術(shù)目前應(yīng)用較廣，已有多家公司推出了不同的修飾酶，但普遍價(jià)格高昂。以上這些技術(shù)均無法在擴(kuò)增的全程發(fā)揮作用，因而不能徹底消除非特異擴(kuò)增。
本發(fā)明的目的旨在提供一種可預(yù)防非特異擴(kuò)增的、用于均相熒光PCR檢測的雙鏈?zhǔn)揭铩獙\生引物。
孿生引物為正引物與負(fù)引物雜交而成的雙鏈結(jié)構(gòu)，正引物為用于PCR擴(kuò)增的上、下游引物，負(fù)引物為與正引物互補(bǔ)的并經(jīng)修飾的序列。孿生引物包括標(biāo)記型和非標(biāo)記型兩種。
標(biāo)記型孿生引物為在正引物的5′端標(biāo)記熒光染料，負(fù)引物的3′標(biāo)記熒光淬滅劑，這一修飾使負(fù)引物不具備延伸能力，在這種結(jié)構(gòu)的孿生引物中，熒光染料和熒光淬滅劑同處一端發(fā)生熒光淬滅，形成非熒光的孿生引物。標(biāo)記型孿生引物的制備方法是首先在正引物的5′端標(biāo)記上熒光染料，負(fù)引物的3′端標(biāo)記上熒光淬滅劑，將標(biāo)記后的正、負(fù)引物以1∶(1.0～2.0)比例混合，在1.0～2.0mM Mg2+體系中，于20～95℃下雜交而成雙鏈?zhǔn)揭铩?br> 非標(biāo)記型孿生引物為正引物無標(biāo)記，負(fù)引物的3′端磷酸化或加雙脫氧核苷酸，使其通過修飾而失去延伸能力。非標(biāo)記型孿生引物的制備為首先將負(fù)引物的3′端磷酸化或加雙脫氧核苷酸，然后將正、負(fù)引物以1∶(1.0～2.0)的比例混合后，在1.0～2.0mM Mg2+體系中，于20～95℃下雜交而成雙鏈?zhǔn)揭铩?br> 標(biāo)記型孿生引物用于均相熒光PCR檢測的原理如下在由標(biāo)記孿生引物組成的PCR反應(yīng)混合體系中(見


圖1)，以孿生引物1和孿生引物2分別作為上、下游引物，均在正引物的5′端標(biāo)記上熒光染料(用0表示)，負(fù)引物的3′端標(biāo)記上淬滅劑(用
表示)。在反應(yīng)開始前的低溫階段，由于不存在游離的具備延伸能力的正引物，不會發(fā)生正引物之間的結(jié)合或正引物在模板上的非特異結(jié)合，也不會生成引物二聚體或非特異擴(kuò)增產(chǎn)物；游離的過剩負(fù)引物即使能夠發(fā)生非特異結(jié)合，因不具備延伸能力，也無法形成擴(kuò)增產(chǎn)物。也就是說，采用孿生引物的PCR擴(kuò)增體系，在進(jìn)入變性階段前有效預(yù)防了非特異擴(kuò)增的發(fā)生。進(jìn)入熱變性階段，孿生引物和模板均發(fā)生變性，正引物從孿生引物中被釋放出來，熒光性質(zhì)得以恢復(fù)。溫度降低至退火溫度時(shí)，部分正引物與模板結(jié)合，部分正引物則為過剩的負(fù)引物退火而重新成為無熒光的孿生引物，同時(shí)，負(fù)引物也結(jié)合至模板，但不引發(fā)延伸反應(yīng)。這些過程杜絕了正引物發(fā)生非特異結(jié)合的機(jī)會，也就是說，在循環(huán)的退火階段或者說整個循環(huán)階段(因其它階段不發(fā)生退火)孿生引物同樣發(fā)揮了預(yù)防非特異擴(kuò)增的作用。該階段反應(yīng)體系的熒光源于釋放出的正引物的退火和延伸。當(dāng)溫度升高(如72℃)進(jìn)入延伸階段時(shí)，退火的正引物將引導(dǎo)DNA的合成，生成具熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物；此時(shí)，孿生引物會因溫度高于其熔點(diǎn)而發(fā)生解鏈，那些與模板結(jié)合的負(fù)引物也會解離下來，而不影響延伸的進(jìn)行。在以后的每一輪溫度循環(huán)中，正引物都會隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的積累而消耗，PCR結(jié)束后，整個反映體系的熒光強(qiáng)度也將得以積累。從以上擴(kuò)增過程可以看出，孿生引物PCR不僅能在反應(yīng)開始前而且能在整個擴(kuò)增循環(huán)過程中，發(fā)揮預(yù)防非特異擴(kuò)增的作用。還可以看出，標(biāo)記型孿生引物PCR可以采用終點(diǎn)測定法獲得定性或半定量結(jié)果，也可以通過實(shí)時(shí)檢測每一循環(huán)退火階段的熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)定量檢測。
標(biāo)記孿生引物用于均相熒光PCR檢測，將預(yù)防非特異擴(kuò)增和實(shí)現(xiàn)均相熒光檢測通過標(biāo)記的孿生引物同時(shí)完成。和同樣采用熒光淬滅原理的其它均相PCR檢測技術(shù)，如Sunriseprimer、分子信標(biāo)、蝎子引物和TaqMan探針相比，理論上，標(biāo)記孿生引物具有更高的分析靈敏度。因?yàn)榍叭邿晒庑盘杹碜杂诎l(fā)夾型引物或探針的開閉之差，或者說是熒光物質(zhì)及其淬滅劑之間從零距離變化到一有限長距離之后熒光的增加程度；TaqMan探針技術(shù)的熒光信號則是來自于探針解離前后之差，或者說是熒光物質(zhì)及其淬滅劑之間從一有限長距離變化到一無限長距離之后熒光的增加程度。標(biāo)記型孿生引物PCR的熒光信號來自于孿生引物中正引物的釋放，它是熒光物質(zhì)及其淬滅劑之間是從零距離變化到無限長距離之后熒光的增加程度。顯然后者的距離變化最大，因而在采用相同的熒光物質(zhì)和淬滅劑的情況下，后者的熒光信號也最大。
從制備的角度比較，標(biāo)記型孿生引物最為簡單。首先，孿生引物可根據(jù)引物序列即能直接完成設(shè)計(jì)；其次，孿生引物的標(biāo)記是寡核苷酸的單端修飾，可以通過固相合成直接制備，純化一步完成，因此產(chǎn)率也高。其它的探針或引物，皆為雙修飾(雙端修飾或內(nèi)部插入修飾)，且須按照彼此的規(guī)則進(jìn)行特殊處理，由于這些規(guī)則均屬經(jīng)驗(yàn)性質(zhì)，常常需要數(shù)次嘗試才能成功，而個別情況，如蝎子引物則需專門合成商完成。雙修飾純化繁瑣，產(chǎn)率低，因此價(jià)格普遍高昂。對于探針型而言，存在的另一問題是，由于需要設(shè)計(jì)出可以檢測特異的擴(kuò)增產(chǎn)物的探針，對于那些引物包含序列或未知或?yàn)楦叨瓤勺儏^(qū)域的情況，探針設(shè)計(jì)的難度將大大增加。
標(biāo)記型孿生引物PCR均相熒光檢測技術(shù)本身具有很大的靈活性，根據(jù)上述原理，具備一定經(jīng)驗(yàn)的人可以設(shè)計(jì)出多種模式。比如，在PCR反應(yīng)中，可以一側(cè)采用標(biāo)記孿生引物，另一側(cè)采用正引物或非標(biāo)記孿生引物。孿生引物要求負(fù)引物不具備延伸能力，根據(jù)這一要求，除了采用雙脫氧核苷酸和磷酸化途徑外，具備一定經(jīng)驗(yàn)的人可以設(shè)計(jì)出多種方式，比如負(fù)引物采用不具備延伸能力肽核酸等，這些新途徑還可能賦予雙鏈引物以新的優(yōu)點(diǎn)，如對反應(yīng)體系中鎂離子不敏感，抗降解能力等。為了進(jìn)一步提高測定靈敏度，標(biāo)記型孿生引物中的熒光物質(zhì)和淬滅劑的標(biāo)記數(shù)量可以不限于一端，可以進(jìn)一步在鏈中間插入多個修飾的堿基，在不干擾擴(kuò)增的情況下，使靈敏度得以大幅度提高。
標(biāo)記型孿生引物PCR均相熒光檢測技術(shù)可與現(xiàn)有技術(shù)具有兼容，也就是說，原有的多數(shù)均相熒光PCR檢測技術(shù)可以采用標(biāo)記孿生引物，并可能增加一些新的功能。比如對于非探針型的Sunrise primer(又稱Amplifluor)，在一側(cè)引物為Sunrise primer時(shí)，另一引物就可以采用標(biāo)記孿生引物，這樣做的好處是，可以避免引物間二聚體的形成引起的非特異擴(kuò)增。對于探針型的分子信標(biāo)，使用帶有相同熒光基團(tuán)和淬滅劑(這里指具有相同效果的熒光基團(tuán)和淬滅劑，而不一定是完全一樣的物質(zhì)，以下同)的標(biāo)記雙鏈引物，就可能進(jìn)一步提高測定的靈敏度，因?yàn)椋肿有艠?biāo)具備識別特異擴(kuò)增的能力，但不具備預(yù)防非特異擴(kuò)增功能。采用標(biāo)記雙鏈引物后，一方面避免了非特異擴(kuò)增引起的消耗，有助于提高特異擴(kuò)增產(chǎn)率，另一方面，標(biāo)記雙鏈引物擴(kuò)增本身也貢獻(xiàn)了熒光信號。同樣地，對于其它探針型如TaqMan和Amplisensor而言，只要標(biāo)記型雙鏈引物使用相同的熒光基團(tuán)和淬滅劑，也可達(dá)到類似效果。對于蝎子引物，可以一側(cè)采用標(biāo)記雙鏈引物，對于用于Lightcycler的雙探針，由于后者采用能量轉(zhuǎn)移原理而非熒光淬滅途徑，標(biāo)記雙鏈引物不能直接使用，但是，可以理解的是，如果兩者之一在熒光染料選擇上加以變換，就可達(dá)到兼容的目的。
標(biāo)記型孿生引物還可用于內(nèi)標(biāo)設(shè)計(jì)，在PCR反應(yīng)中，加入內(nèi)標(biāo)是防止假陰性和實(shí)現(xiàn)定理檢測的有效途徑。內(nèi)標(biāo)的傳統(tǒng)概念是使用與靶序列完全相同的引物，其序列又與靶序列相近，以使二者擴(kuò)增效率盡量接近，但為了檢測時(shí)能區(qū)分它們，二者又需保持一定差異。這一點(diǎn)成為設(shè)計(jì)內(nèi)標(biāo)的主要矛盾。孿生引物PCR為設(shè)計(jì)內(nèi)標(biāo)提供了新思路。孿生引物內(nèi)標(biāo)PCR的設(shè)計(jì)思想為，內(nèi)標(biāo)序列的長度與模板一致，內(nèi)標(biāo)序列的引物間部分采用模板引物間相同序列，兩個內(nèi)標(biāo)引物或者其中的一個與模板引物序列不同，但其熔點(diǎn)和退火效率與模板引物一致。內(nèi)標(biāo)引物與模板引物采用不同的熒光標(biāo)記以便于熒光測定。與傳統(tǒng)設(shè)計(jì)采用引物包含序列不同，采用標(biāo)記孿生引物設(shè)計(jì)的內(nèi)標(biāo)引物包含序列完全相同，但兩者的擴(kuò)增引物序列不同，但靶序列的引物和內(nèi)標(biāo)的引物在退火溫度，效率等方面應(yīng)盡可能一致。用于檢測時(shí)區(qū)分它們的方法則是利用不同的標(biāo)記熒光染料。由于，內(nèi)標(biāo)和靶序列擴(kuò)增的序列擴(kuò)增部分完全相同，決定于二者效率的影響因素就只有引物序列，很顯然，在延伸階段，引物序列對擴(kuò)增的影響很小，因此，這一設(shè)計(jì)本身經(jīng)大大縮小了靶序列和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增之間的差別，而不同的熒光染料在檢測時(shí)又很容易地將它們區(qū)分開來。另一方面，在靶序列引物基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出退火效率相同的引物也相對簡單。內(nèi)標(biāo)的生成可以通過諸多技術(shù)，如PCR突變技術(shù)等實(shí)現(xiàn)。對于有一定經(jīng)驗(yàn)的人來說，可以采用多種靈活的途徑實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。
標(biāo)記型孿生引物也可用于多重?zé)晒釶CR，在這樣的反應(yīng)體系中，每個反應(yīng)采用互不相同的熒光標(biāo)記染料。在反應(yīng)后，通過檢測不同染料的熒光反應(yīng)，即可達(dá)到同時(shí)檢測各個反應(yīng)的目的。與一般多重PCR相比，孿生引物多重?zé)晒釶CR有兩個明顯優(yōu)勢一是可以實(shí)現(xiàn)均相熒光同時(shí)檢測，二是雙鏈引物有助于防止引物多重PCR中的多個引物之間的非特異結(jié)合。
非標(biāo)記型孿生引物用于均相熒光PCR檢測采用的一種典型的熒光指示系統(tǒng)就是熒光嵌入劑。熒光嵌入劑是一類能嵌入雙鏈DNA而發(fā)出特征熒光的熒光染料。目前在均相熒光PCR檢測中，最常用的是SYBR Green I。SYBR Green I可以直接用于常規(guī)PCR反應(yīng)中，是實(shí)現(xiàn)均相熒光測定的最簡便途徑，但是，由于熒光嵌入劑不具備識別非特異擴(kuò)增能力，在均相熒光PCR檢測中的應(yīng)用受到很大限制。采用非標(biāo)記雙鏈引物后，這種情況得以根本改變，雙鏈引物具備在PCR全程發(fā)揮預(yù)防非特異擴(kuò)增的作用，如果嵌入劑僅指示擴(kuò)增的DNA，就可以實(shí)現(xiàn)特異的均相熒光測定。
在由非標(biāo)記孿生引物和熒光嵌入劑組成的PCR反應(yīng)混合體系(見圖2)中，以孿生引物3和孿生引物4為上、下游引物，其負(fù)引物的3′端均經(jīng)修飾而成封閉端(用X表示)。在反應(yīng)開始前的低溫階段，由于不存在游離的具備延伸能力的正引物，不會發(fā)生正引物之間的結(jié)合或正引物在模板上的非特異結(jié)合，也不會生成引物二聚體或非特異擴(kuò)增產(chǎn)物；游離的過剩負(fù)引物即使能夠產(chǎn)生非特異結(jié)合，因其不具備延伸能力，也無法形成擴(kuò)增產(chǎn)物。也就是說，采用孿生引物的PCR擴(kuò)增體系，在進(jìn)入變性階段前有效預(yù)防了非特異擴(kuò)增的發(fā)生。熒光嵌入劑和雙鏈DNA的存在，使處于這一階段的反應(yīng)液是具熒光的。在進(jìn)入熱變性階段的過程中，到達(dá)一定溫度后，孿生引物和模板均發(fā)生變性，正引物從孿生引物中被釋放出來。由于此時(shí)無雙鏈DNA與熒光嵌入劑結(jié)合，此時(shí)反應(yīng)體系的熒光是最低的。溫度降低至退火溫度后，部分正引物與模板退火，部分正引物被大量過剩的負(fù)引物退火又生成孿生引物，同時(shí)，負(fù)引物也結(jié)合至模板，但不會引發(fā)延伸反應(yīng)。這些過程杜絕了正引物發(fā)生非特異結(jié)合的機(jī)會，也就是說，在循環(huán)的退火階段或者說整個循環(huán)階段(因其它階段不發(fā)生退火)孿生引物同樣發(fā)揮了預(yù)防非特異擴(kuò)增的作用。此階段反應(yīng)體系的熒光源于嵌入劑與退火形成的所有雙鏈DNA的結(jié)合。當(dāng)溫度升高(如72℃)進(jìn)入延伸階段時(shí)，退火的正引物引導(dǎo)DNA的合成，嵌入劑將會與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光，而且，隨著DNA鏈的延長，會有更多嵌入劑結(jié)合，故體系的熒光在延伸的后期更強(qiáng)。處于延伸階段的孿生引物會因溫度高于其熔點(diǎn)而發(fā)生解鏈，那些與模板結(jié)合的負(fù)引物也同樣解離下來。也就是說，此時(shí)體系的熒光的唯一來源就是正引物退火并延伸的雙鏈DNA。它代表了特異擴(kuò)增產(chǎn)物的生成。在以后的溫度循環(huán)中，正引物將因生成擴(kuò)增產(chǎn)物而被消耗(負(fù)引物無消耗)。在延伸階段測定的熒光強(qiáng)度，將能如實(shí)反映擴(kuò)增產(chǎn)物的生成。選擇在此階段測定每一循環(huán)的熒光強(qiáng)度就實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)測定，可以看出，孿生引物PCR不僅能在反映開始前而且能在整個反應(yīng)過程中，都發(fā)揮著預(yù)防非特異擴(kuò)增的作用，保證了測定結(jié)果的特異性。
在實(shí)際測定中，非標(biāo)記孿生引物PCR測定方式與常規(guī)熒光嵌入劑實(shí)時(shí)測定方式相同，即首先測定反應(yīng)熱啟動階段的熒光強(qiáng)度(此時(shí)熒光強(qiáng)度最低)作為本底，以后測定每一循環(huán)延伸階段后期的熒光強(qiáng)度，二者的差值作為該循環(huán)的熒光強(qiáng)度。需要指出的是，非標(biāo)記孿生引物PCR不適合采用終點(diǎn)測定法進(jìn)行定性或半定量測定。原因是，孿生引物反應(yīng)前后的大量存在使反應(yīng)體系均呈熒光，擴(kuò)增后反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度變化由——孿生引物消耗導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度降低和擴(kuò)增產(chǎn)物積累引起的熒光強(qiáng)度增加——兩個相互消長的因素決定，其凈結(jié)果難以反映出原始模板量的差別。
非標(biāo)記型孿生引物均相熒光PCR，在設(shè)計(jì)上較標(biāo)記型更為簡單。
非標(biāo)記孿生引物提供預(yù)防非特異擴(kuò)增能力，在選擇熒光指示系統(tǒng)上則不受約束。采用熒光嵌入劑只是一種最為簡便的途徑。實(shí)際上，現(xiàn)有的多數(shù)均相熒光PCR檢測技術(shù)都可以直接采用非標(biāo)記孿生引物。比如對于非探針型的Sunrise primer，在一側(cè)引物為Sunrise primer時(shí)，另一引物就可以采用非標(biāo)記孿生引物，這樣做的好處是，可以避免引物間二聚體的形成導(dǎo)致非特異擴(kuò)增。對于探針型的分子信標(biāo)，使用非標(biāo)記孿生引物，一方面可進(jìn)一步提高測定的靈敏度——因?yàn)榉肿有艠?biāo)具備識別特異擴(kuò)增的能力，但不具備預(yù)防非特異擴(kuò)增功能，雙鏈引物避免了非特異擴(kuò)增引起的消耗，有助于提高特異擴(kuò)增產(chǎn)率。另一方面，孿生引物PCR具備的特異擴(kuò)增能力加上探針的特異指示能力，使這一組合成為理論上最為可靠的檢測系統(tǒng)。對于其它探針型如TaqMan、Amplisensor和Lightcycler的雙探針，采用非標(biāo)記孿生引物，也都可以取得類似效果。對于蝎子引物，可以一側(cè)采用蝎子引物，另一側(cè)采用非標(biāo)記孿生引物。與標(biāo)記孿生引物不同，非標(biāo)記型可以直接采用這些熒光指示系統(tǒng)，而無須考慮熒光基團(tuán)和淬滅劑的選配。非標(biāo)記孿生引物與各種熒光指示系統(tǒng)的結(jié)合，也使得測定方式更加靈活。實(shí)際上，采用非標(biāo)記的孿生引物，并不改變這些熒光測定系統(tǒng)的原由測定方式。如與探針型的分子信標(biāo)結(jié)合，既可進(jìn)行終點(diǎn)測定，又可在循環(huán)的退火階段進(jìn)行實(shí)時(shí)測定，因?yàn)榉肿有艠?biāo)本身就具備這些測定方式。與Sunrise primer、TaqMan、Lightcycler的雙探針、蝎子引物以及Amplisensor等的組合，也是類似情況。
在某些PCR反應(yīng)中，非標(biāo)記孿生引物也可以采用一側(cè)使用孿生引物而另一側(cè)使用正引物的方式。非標(biāo)記孿生引物也要求負(fù)引物不具備延伸能力。負(fù)引物可以采用多種設(shè)計(jì)模式，除了采用雙脫氧核苷酸和磷酸化途徑外，具備一定經(jīng)驗(yàn)的人可以設(shè)計(jì)出多種方式，比如采用不具備延伸能力的肽核酸等，這些新途徑還可能賦予雙鏈引物以新的優(yōu)點(diǎn)，如對反應(yīng)體系中鎂離子不敏感，抗降解能力等。
圖1為標(biāo)記型孿生引物的PCR原理示意圖。
圖2為非標(biāo)記型孿生引物的PCR原理示意圖。
圖3為標(biāo)記型孿生引物與傳統(tǒng)引物PCR瓊脂糖凝膠電泳對照圖。
圖4為標(biāo)記型孿生引物PCR熒光檢測結(jié)果。
圖5為單側(cè)標(biāo)記型孿生引物PCR用于人端粒酶的熒光檢測結(jié)果。
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1標(biāo)記型孿生引物PCR用于人β-珠蛋白的檢測。
人β-珠蛋白的PCR擴(kuò)增是一個標(biāo)準(zhǔn)的PCR程序，我們用它來說明標(biāo)記型孿生引物用于均相熒光PCR的原理。
標(biāo)記孿生引物的制備正引物是在傳統(tǒng)引物的5′引入熒光修飾，本例采用FAM。具體設(shè)計(jì)為5′-FAM-GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3′和5′-FAM-CAA CTT CAT CCACGT TCA CC-3′；兩負(fù)引物的序列可以直接采用其正引物的互補(bǔ)序列，也可在其5′縮短若干堿基提高正引物的解離效率。其3′端則標(biāo)記淬滅劑DABCYL。本例中，負(fù)引物的5′縮短一個堿基，即5′-TAC CTG TCC TTG GCT CCT C-Dabcyl-3′和5′-GTG AAC GTG GATGAA GTT G-Dabcyl-3′。
將正引物與負(fù)引物以1∶1.5比例混合，雜交液含1.5mM Mg2+。雜交條件94℃ 5min，55℃ 2min。冷卻，冷凍保存作為PCR反應(yīng)的引物。
正常人外周血由實(shí)驗(yàn)室志愿者提供。用淋巴細(xì)胞液分離法分離血液白細(xì)胞和用常規(guī)酚氯仿抽提，乙醇沉淀法提取白細(xì)胞DNA。
PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)總體積為25μL，內(nèi)含10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.0UTaq酶，200μM dNTP，2.0mM MgCl2，0.4μM正引物的孿生引物，5μL模板，50μL石蠟油，經(jīng)95℃，5min預(yù)變性，再95℃，30s，55℃，35s，72℃，1min，40個循環(huán)后，72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增后直接進(jìn)行熒光值測定。結(jié)果見圖3、4。從圖3中可明顯看出標(biāo)記型孿生引物PCR可有效地預(yù)防非特異擴(kuò)增(b表示空白)。圖4中，F(xiàn)表示熒光強(qiáng)度，s為樣品，從圖中看出，模板的濃度與熒光強(qiáng)度成正比。
實(shí)施例2單側(cè)標(biāo)記型孿生引物PCR用于人端粒酶的檢測。
端粒酶是一種廣譜的腫瘤標(biāo)志物，目前端粒酶的測定方法繁瑣，本例說明采用單側(cè)標(biāo)記孿生引物可以實(shí)現(xiàn)快速的均相熒光PCR檢測，TS引物為5′-AAT CCG TCG AGC AGAGTT-3′。
孿生引物的制備正引物在端粒酶的TX引物基礎(chǔ)上，在5′端標(biāo)記FAM，即5′-FAM-CCC TTACCC TTA CCC TTA CCC TAA，負(fù)引物在選擇其負(fù)補(bǔ)序列，其中5′端縮短一個堿基，3′端則用淬滅劑標(biāo)記，即5′-TAG GGT AAG GGT AAG GGT GGT AAG GG-Dabcyl-3′。將正負(fù)引物以1∶1.5比例混合，雜交液含2.0mM Mg2+。雜交條件為94℃ 5min，55℃2min。冷卻，冷凍保存作為PCR反應(yīng)的引物。
端粒酶從人胃癌細(xì)胞MGc80-3中提取。
端粒酶的延伸體系25μL，內(nèi)含20mM Tris-HCl，pH8.3，200μM dNTP，0.4μM TS引物，5μg CHAPS細(xì)胞提取物，50μL石蠟油。經(jīng)22℃，10min反應(yīng)后，再95℃，15min熱變性，加入0.4μM下游孿生引物(含2U Taq酶)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為經(jīng)94℃預(yù)變性60s，再94℃ 30s，50℃ 30s，72℃1.5min，30個循環(huán)后72℃延伸5min。對PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行熒光測量。結(jié)果見圖5。
實(shí)施例3非標(biāo)記型孿生引物PCR用于乙型肝炎病毒(HBV)的檢測。
采用非標(biāo)記型孿生引物進(jìn)行均相熒光PCR檢測，需要采用相應(yīng)的熒光指示系統(tǒng)，本例利用熒光嵌入劑，說明非標(biāo)記孿生引物的設(shè)計(jì)和檢測方法。
非標(biāo)記孿生引物的制備選擇擴(kuò)增HBV的引物序列引物15′-CTT TAT AAG GATCAA TGT CCA TGC-3′和引物25′-GAA ATA TTC CTA GTT ACA GGT ACG-3′。引物1的負(fù)引物為5′-GCA TGG ACA TTG ATC CTT ATA AAG-3′-PHOR，引物2的負(fù)引物為5′-CGT ACC TGT AAC TAG GAA TAT TTC-3′-PHOR，其中，PHOR為磷酸基，用于封閉負(fù)引物的延伸。將正負(fù)引物以1∶1.5比例混合，雜交液含1.5mM Mg2+，雜交條件為94℃5min，55℃2min。冷卻，冷凍保存作為PCR反應(yīng)的引物。
取臨床血清標(biāo)本，按常規(guī)水煮法提取DNA。
PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)總體積為25μL，內(nèi)含10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.0UTaq酶，200μM dNTP，1.5mM MgCl2，0.4μM正引物的孿生引物、1∶10,000的SYBRGreen I(Molecular Probes Inc)和5μL模板，滴加50μL石蠟油，經(jīng)95℃，5min預(yù)變性，再95℃，30s，55℃，35s，72℃，1min，35個循環(huán)后，72℃延伸5min。通過測定延伸階段的熒光強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)測定。
權(quán)利要求
1.用于均相熒光PCR檢測的孿生引物，其特征在于孿生引物為正引物與負(fù)引物雜交而成的雙鏈結(jié)構(gòu)，正引物為用于PCR擴(kuò)增的上、下游引物，負(fù)引物為與正引物互補(bǔ)的并經(jīng)修飾的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的用于均相熒光PCR檢測的孿生引物，其特征在于孿生引物為標(biāo)記型孿生引物，其正引物的5′端標(biāo)記熒光染料，負(fù)引物的3′端標(biāo)記熒光淬滅劑。
3.如權(quán)利要求1和2所述的用于均相熒光PCR檢測的孿生引物，其特征在于其制備為首先在正引物的5′端標(biāo)記上熒光染料，負(fù)引物的3′端標(biāo)記上熒光淬滅劑，將標(biāo)記后的正、負(fù)引物以1∶(1.0～2.0)的比例混合，在1.0～2.0mM Mg2+體系中，于20～95℃下雜交而成雙鏈?zhǔn)揭铩?br> 4.如權(quán)利要求1所述的用于均相熒光PCR檢測的孿生引物，其特征在于孿生引物為非標(biāo)記型孿生引物，其正引物無標(biāo)記，負(fù)引物的3′端磷酸化或加雙脫氧核苷酸。
5.如權(quán)利要求1和4所述的用于均相熒光PCR檢測的孿生引物，其特征在于其制備為首先在負(fù)引物的3′端磷酸化或加雙脫氧核苷酸，然后將正、負(fù)引物以1∶(1.0～2.0)的比例混合后，在1.0～2.0mM Mg2+體系中，于20～95℃下雜交而成雙鏈?zhǔn)揭铩?br> 全文摘要
提供一種可預(yù)防非特異擴(kuò)增的,用于均相熒光PCR檢測的雙鏈?zhǔn)揭铩獙\生引物。孿生引物由正引物與負(fù)引物雜交而成,正引物為用于擴(kuò)增的上、下游引物,負(fù)引物為與正引物互補(bǔ)的并經(jīng)修飾的序列,包括標(biāo)記型和非標(biāo)記型兩種。通過在正引物的5′端進(jìn)行標(biāo)記或不作任何標(biāo)記,而在負(fù)引物的3′端通過修飾而使其失去延伸能力。雙鏈結(jié)構(gòu)的孿生引物在PCR過程中可有效地預(yù)防非特異擴(kuò)增,且其制備簡單,可靈活地應(yīng)用于各種PCR檢測技術(shù)中。
文檔編號C12Q1/68GK1278009SQ0010841
公開日2000年12月27日 申請日期2000年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月30日
發(fā)明者李慶閣, 郭秋平, 欒國彥, 梁基選 申請人:廈門大學(xué)