專利名稱：：生產(chǎn)l－賴氨酸的棒狀菌和制備l－賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有擴(kuò)增的lysE基因(賴氨酸輸出載體基因)的棒狀菌的生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株，在這些菌株中，選自包括dapA基因(二氫吡啶二羧酸合酶基因)，lysC基因(天冬氨酸激酶基因)，dapB基因(二氫吡啶二羧酸還原酶基因)和pyc基因的組的附加基因，特別是dapA基因和lysC基因(天冬氨酸激酶基因)得到擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)，本發(fā)明也涉及制備L-賴氨酸的方法。L-賴氨酸是商業(yè)上重要的L-氨基酸，尤其是用作動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的飼料添加劑。近年來(lái)需求量一直穩(wěn)步增加。L-賴氨酸由棒狀菌，尤其是谷氨酸棒桿菌的生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株的發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生。由于這一產(chǎn)物非常重要，人們不斷嘗試改進(jìn)其制備過(guò)程。對(duì)過(guò)程的改進(jìn)可以涉及牽涉發(fā)酵技術(shù)的手段，攪拌和氧供給，或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組成(如發(fā)酵期間的糖濃度)，或產(chǎn)物的檢測(cè)(如經(jīng)離子交換色譜)，或微生物自身的內(nèi)在生產(chǎn)特征。這些微生物的生產(chǎn)能力的特性通過(guò)利用誘變，選擇以及突變體選擇的方法來(lái)改善，以給出對(duì)抗代謝物(例如S-(2-氨乙基)半胱氨酸)具有抗性，氨基酸(例如L-亮氨酸)營(yíng)養(yǎng)缺陷的，并產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株。一些年來(lái)重組DNA技術(shù)的方法也曾用于通過(guò)擴(kuò)增個(gè)體生物合成基因改進(jìn)谷氨酸棒桿菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株，并且研究了對(duì)L-賴氨酸生產(chǎn)影響。就此而言，EP-A-0088166報(bào)道了在賦予對(duì)氨乙基半胱氨酸的抗性的DNA片段擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-B-0387527報(bào)道了編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-A-0197335報(bào)道了編碼二氫吡啶二羧酸合酶的dapA基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-A-0219027報(bào)道了編碼天冬氨酸半醛脫氫酶的基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。Pisabarro等(細(xì)菌學(xué)雜志175(9)，2743-2749(1993)描述了編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的dapB基因。也已經(jīng)研究了主要代謝基因的擴(kuò)增對(duì)L-賴氨酸生產(chǎn)的影響。就此而言，EP-A-0219027報(bào)道了編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的aspC基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-A-0143195和EP-A-0358940報(bào)道了編碼烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的ppc基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。DE-A-19831609報(bào)道了編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。最后，DE-A-19548222描述了由lysE基因編碼的L-賴氨酸輸送載體的活性增加促進(jìn)賴氨酸生產(chǎn)。除這些擴(kuò)增個(gè)體基因的嘗試之外，也嘗試了在棒狀菌中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或更多個(gè)基因，進(jìn)而改進(jìn)L-賴氨酸生產(chǎn)。就此而言，DE-A-3823451報(bào)道了同時(shí)擴(kuò)增大腸桿菌asd基因和dapA基因后，生產(chǎn)能力增加。DE-A3943117公開了用pJC50同時(shí)擴(kuò)增編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapA基因后，生產(chǎn)能力增加。EP-A-0841395特別報(bào)道了同時(shí)擴(kuò)增編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapB基因后，生產(chǎn)能力增加；進(jìn)一步的改進(jìn)可以由dapB，lysA，以及ddh基因的額外擴(kuò)增完成。EP-A-0854189描述了同時(shí)擴(kuò)增編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapA，dapB，lysA和aspC基因后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-A-0857784特別報(bào)道了同時(shí)擴(kuò)增編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和lysA基因后生產(chǎn)能力增強(qiáng)；進(jìn)一步的改進(jìn)可以由ppc基因的額外擴(kuò)增完成。由許多現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)中所描述的方法可以清楚看出，需要開發(fā)新的方法并改進(jìn)用棒狀菌生產(chǎn)賴氨酸的現(xiàn)行的方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)新的措施提供改進(jìn)的棒狀菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株。L-賴氨酸是商業(yè)上重要的L-氨基酸，尤其是用作動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的飼料添加劑。當(dāng)L-賴氨酸或賴氨酸在下文中提及時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解為其不僅包括其本身，而且包括適當(dāng)?shù)柠}，例如賴氨酸鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。本發(fā)明提供了棒狀菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株，它們具有擴(kuò)增的lysE基因(賴氨酸輸送載體基因)，其中它們還含有單獨(dú)或一起擴(kuò)增的、優(yōu)選超量表達(dá)的選自包括dapA基因(二氫吡啶二羧酸合酶基因)，lysC基因(天冬氨酸激酶基因)，dapB基因(二氫吡啶二羧酸還原酶基因)和pyc基因(丙酮酸羧化酶基因)組的基因，尤其是dapA基因和lysC基因。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)位于dapB基因上游(5’末端)的新的DNA序列，其攜帶dapB啟動(dòng)子的-35區(qū)，對(duì)dapB基因的表達(dá)是有利的。其顯示在SEQIDNo．1中。因此，也要求了具有在SEQIDNo．1中顯示的核苷酸序列的能夠復(fù)制的DNA。本發(fā)明也提供了保藏號(hào)分別為DSM12868與DSM12867的SEQIDNo．5和SEQIDNo．6中顯示的dapA啟動(dòng)子的MC20和MA16突變。本發(fā)明也涉及棒狀菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株，其具有擴(kuò)增的lysE基因，在這些菌株中，dapA基因和dapB基因也同時(shí)擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)。本發(fā)明也涉及棒狀菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株，其具有擴(kuò)增的lysE基因，在這些菌株中，dapA和lysC基因也同時(shí)擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)。在本說(shuō)明書上下文中，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”描述的是利用強(qiáng)啟動(dòng)子或利用編碼具有高活性的適當(dāng)酶的基因，或者可以也可以不組合這兩種手段增加基因的拷貝數(shù)，來(lái)增加由適當(dāng)DNA編碼的一種或多種酶在微生物中的胞內(nèi)活性。本發(fā)明也提供了利用以上所描述的這些棒狀菌發(fā)酵制備L-賴氨酸的方法。本發(fā)明提供的微生物可以從葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉或纖維素或從甘油和乙醇，尤其是從葡萄糖或蔗糖制備L-賴氨酸。所說(shuō)的微生物是棒狀菌，尤其是棒桿菌屬的。在棒桿菌屬菌種中，可以特別提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其產(chǎn)生氨基酸的能力。這一物種包括野生型菌株，如谷氨酸棒桿菌ATCC13032，黃色短桿菌ATCC14067，CorynebacteriummelassecolaATCC17965和來(lái)源于它們的菌株或突變體。棒狀菌的生產(chǎn)L-賴氨酸的突變體的例子如谷氨酸棒桿菌FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712黃色短桿菌FERM-P6463黃色短桿菌FERM-P6464谷氨酸棒桿菌DSM5714谷氨酸棒桿菌DSM12866DE-A-19548222公開了lysE基因的超量表達(dá)對(duì)L-賴氨酸生產(chǎn)的有利作用。dapB基因或pyc基因的額外擴(kuò)增表達(dá)，或特別是編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因的額外擴(kuò)增表達(dá)，或尤其是dapA基因的額外擴(kuò)增表達(dá)，會(huì)改善L-賴氨酸的產(chǎn)量。本發(fā)明人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)給定的lysE基因的超量表達(dá)而言，dapA與dapB基因的同時(shí)額外擴(kuò)增表達(dá)進(jìn)一步地為L(zhǎng)-賴氨酸產(chǎn)量帶來(lái)益處。因此，也要求了具有在SEQIDNo．1中顯示的核苷酸序列的能夠復(fù)制的DNA。對(duì)給定的lysE基因的超量表達(dá)而言，dapA以及l(fā)ysE基因的同時(shí)額外擴(kuò)增表達(dá)對(duì)L-賴氨酸產(chǎn)生也是有利的。擴(kuò)增(超量表達(dá))是通過(guò)增加適當(dāng)?shù)幕虻目截悢?shù)，或突變位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)區(qū)，或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以相同的方式工作。在經(jīng)發(fā)酵形成L-賴氨酸期間，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子額外地使增加表達(dá)成為可能。延長(zhǎng)mRNA壽命的手段也改善表達(dá)。此外，酶活性也通過(guò)阻止酶蛋白質(zhì)的降解，將基因或基因構(gòu)建體位于可變拷貝數(shù)質(zhì)粒(穿梭載體)中或者在染色體中整合和擴(kuò)增而得到提高。此外，通過(guò)改變培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)技術(shù)，獲得目標(biāo)基因的超量表達(dá)也是可能的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)從下列文獻(xiàn)中找到有關(guān)說(shuō)明Martin等(生物／技術(shù)5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物／技術(shù)6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，EP-0472869，US4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物／技術(shù)9,-84-87(1991))，Reinscheid等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60，126-132(1994))，LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175，1001-1007(1993))，專利出版物WO96／15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本專利申請(qǐng)公開JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術(shù)和生物工程58，191-195(1998))或者美國(guó)細(xì)菌學(xué)會(huì)“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊(cè)”(華盛頓DC，USA，1981)和公知的遺傳學(xué)與分子生物學(xué)手冊(cè)。本發(fā)明所利用的谷氨酸棒桿菌的基因已被描述，并且可以用已知方法分離，制備或合成。以下文獻(xiàn)特別描述了定點(diǎn)誘變方法Higuchi等(核酸研究16，7351-7367(1988))，Silver等的題為PCR策略的手冊(cè)，Innis，Glefand和Sninsky編輯(學(xué)術(shù)出版社，倫敦，UK，1995)。從谷氨酸棒桿菌分離目的基因的第一個(gè)步驟是在例如大腸桿菌中構(gòu)建這一微生物的基因文庫(kù)，或者也可以是在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建該文庫(kù)?；蛭膸?kù)的構(gòu)建在一般性的公知的教科書和手冊(cè)中有記載?？商峒暗睦邮荳innacker的教科書，題為從基因到克隆，基因技術(shù)導(dǎo)論(VerlagChemie，Weinheim，德國(guó)，1990)或Sambrook等的手冊(cè)，題為分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)。Bathe等(分子和普通遺傳學(xué)，252255-265(1996))描述了利用粘粒載體SuperCosI(Wahl等美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)84，2160-2164(1987))在大腸桿菌K-12NM554(Raleigh等，核酸研究161563-1575(1988))中構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫(kù)。Brmann等(分子微生物學(xué)6(3)，317-326)依次描述了采用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫(kù)。谷氨酸棒桿菌在大腸桿菌中的基因文庫(kù)也可以采用質(zhì)粒如pBR322(Bolivar，生命科學(xué)25，807-818(1979))或pUC19(Norrander等，基因26101-106(1983))構(gòu)建。以相同的方式，也可使用穿梭載體，如pJC1(Cremer等，分子和普通遺傳學(xué)220，478-480(1990))或pECS(Eikmanns等，基因102，93-98(1991))，這樣的載體在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中復(fù)制。限制和／或重組缺陷菌株是特別合適的宿主，例子是大腸桿菌菌株DH5αmcr，該菌株由Grant等(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)87，4645-4649(1990))描述過(guò)。其它例子是限制缺陷的谷氨酸棒桿菌菌株RM3和RM4，它們由Schfer等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60(2)，756-759(1994))描述過(guò)。然后，通過(guò)轉(zhuǎn)化(Hanahan，分子生物學(xué)雜志166，557-580(1983))或電穿孔(Tauch等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊，123343-347(1994))將基因文庫(kù)轉(zhuǎn)移到指示菌株中。指示菌株的特征是其具有目的基因突變，這導(dǎo)致可檢測(cè)的表型，例如營(yíng)養(yǎng)缺陷型。指示菌株或突變體可由公開的來(lái)源或菌株保藏中心(例如耶魯大學(xué)遺傳保藏中心(NewHaven，Connect-icut，USA))獲得，或如果必要特別制備。這樣的指示菌株的例子可提及的是需要內(nèi)消旋二氨基庚二酸的大腸桿菌菌株RDA8(Richaud等，C．R．Acad．Sci．ParisSer．Ⅲ293507-512(1981))，其在dapA基因中攜帶突變(dapA::Mu)。在攜帶目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化指示菌株和目的基因表達(dá)后，就適當(dāng)?shù)奶卣鞫?，指示菌株成為原養(yǎng)型的。如果克隆的DNA片段賦予例如針對(duì)抗代謝物S-(2-氨乙基)半胱氨酸之類的抗性，攜帶重組質(zhì)粒的指示菌株可以通過(guò)在適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基上選擇鑒別。如果目的基因區(qū)的核苷酸序列是已知的或由數(shù)據(jù)庫(kù)可獲得的，則可以用已知方法分離染色體DNA，例如如Eikmanns等(微生物學(xué)140，1817-1828(1994))描述的方法?？梢圆捎煤线m的引物通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成目的基因，并克隆進(jìn)合適的質(zhì)粒載體中，例如Invitrogen的pCRIITOPO(Groningen，荷蘭)。PCR方法的梗概可以從Newton和Graham的題為PCR的書中找到(SpektrumAkademischerVerlag，Heidelberg，德國(guó)，1994)。公眾可利用的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的例子是歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)庫(kù)(EMBL，Heidelberg，德國(guó))或生物技術(shù)信息國(guó)家中心的數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI，Bethesda，MD，美國(guó))。從谷氨酸棒桿菌ATCC13032分離與克隆lysE基因及其核苷酸序列見DE-A-19548222的描述。從谷氨酸棒桿菌各種菌株中分離，克隆以及測(cè)序dapA基因在下列文獻(xiàn)中有描述Cremer等(分子和普通遺傳學(xué)220478-480(1990))，Pisabarro等(細(xì)菌學(xué)雜志1752743-2749(1993))和Bonnassie等(核酸研究186421(1990))。dapA基因的核苷酸序列可以以登記號(hào)X53993獲得。從乳發(fā)酵短桿菌中分離，克隆以及測(cè)序dapB基因由Pisabarro等(細(xì)菌學(xué)雜志1752743-2749(1993))描述過(guò)。dapB基因的核苷酸序列可以以登記號(hào)X67737獲得。編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因和lysC等位基因的分離，克隆以及測(cè)序由幾個(gè)作者報(bào)道過(guò)。就此而言，Kalinowski等(分子和普通遺傳學(xué)224317-324(1990))報(bào)道了來(lái)源于谷氨酸棒桿菌菌株DM58-1的lysC等位基因。DE-A-3943117報(bào)道了谷氨酸棒桿菌菌株MH20lysC等位基因的克隆。Follettie等(細(xì)菌學(xué)雜志1754096-4103(1993))報(bào)道了黃色棒桿菌菌株N13的lysC等位基因，其可以在所說(shuō)的出版物中找到。Kalinowski等(分子微生物學(xué)5，1197-1204(1991))報(bào)道了來(lái)自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的lysC基因。lysC基因和各種lysC等位基因的核苷酸序列可以以登記號(hào)X57226和E06826獲得。然后，可以單獨(dú)或適當(dāng)組合將以這一方法獲得的基因摻入進(jìn)質(zhì)粒載體中，例如pJC1(Cremer等，分子和普通遺傳學(xué)220，478-480(1990))或pEC5(Eikmanns等，基因，102，93-98(1991))，通過(guò)轉(zhuǎn)化例如如Thierbach等(應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)29，356-362(1988))中描述的，或通過(guò)電穿孔，例如如Dunican和Shivnan(生物／技術(shù)7，1067-1070(1989))將其轉(zhuǎn)移到所需的棒狀菌菌株中，例如菌株MH20-22B(Schrumpf等，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)37566-571(1992))，并表達(dá)。待選擇的菌株可以用兩種質(zhì)粒載體同樣好地轉(zhuǎn)化，各質(zhì)粒載體含有所說(shuō)一個(gè)或多個(gè)目的基因，從而獲得除了已知的lysE基因的擴(kuò)增外的兩種或多種基因的有利的同時(shí)擴(kuò)增表達(dá)。這些菌株的例子是菌株MH20-22B／pJC33／pEC7lysE，其中l(wèi)ysE和lysC基因同時(shí)擴(kuò)增表達(dá)，或菌株MH20-22B／pJC50Z／EC7lysE，其中l(wèi)ysE、lysC和dapA基因同時(shí)擴(kuò)增表達(dá)，或菌株MH20-22B／pJC23／pEC7lysE，其中l(wèi)ysE和dapA基因同時(shí)擴(kuò)增表達(dá)，或菌株MH20-22B／pJC23／pEC7dapBlysE，其中l(wèi)ysE，dapA和dapB基因同時(shí)擴(kuò)增表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明制備的微生物可以培養(yǎng)來(lái)連續(xù)生產(chǎn)L-賴氨酸，或者通過(guò)分批發(fā)酵，流加分批方法或重復(fù)流加分批方法不連續(xù)生產(chǎn)L-賴氨酸。已知培養(yǎng)方法的概述在Chmiel的教科書(Bioprozesstechnik1．EinführungindieBioverfahrenstechnik(生物技術(shù)1．生物工程導(dǎo)論)(GustavFischerVerlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科書(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(生物反應(yīng)器和配套設(shè)備)(ViewegVerlag，Brunswick／Wiesbaden，1994))中有描述。所利用的培養(yǎng)基必須適合特定微生物的需要。各種微生物的培養(yǎng)基的描述在美國(guó)細(xì)菌學(xué)學(xué)會(huì)(華盛頓D．C．，USA，1981)的“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊(cè)”中找到?？梢岳锰荚词翘呛吞妓衔铮缙咸烟?，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪，例如大豆油，向日葵油，落花生油和椰子脂肪，脂肪酸，例如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇，例如甘油和乙醇，以及有機(jī)酸，例如乙酸。這些物質(zhì)可以單獨(dú)或混合使用?？梢岳玫词怯袡C(jī)含氮化合物，如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽抽提物，玉米漿，大豆粉和尿素，或無(wú)機(jī)化合物，如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨(dú)或混合使用?？梢岳玫牧自词橇姿岫溻浕蛄姿釟涠浕?qū)?yīng)的鈉鹽。培養(yǎng)基也必須含有金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵，這對(duì)生長(zhǎng)必需的。最后，除以上提及的物質(zhì)之外，可以使用必需的促生長(zhǎng)物質(zhì)如氨基酸和維生素。所說(shuō)的添加物可以一次或分批添加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)的pH通過(guò)適當(dāng)使用堿性化合物，如氫氧化鈉，氫氧化鉀或氨，或酸性化合物，如磷酸或硫酸控制?？梢杂美孟輨?，如脂肪酸聚乙二醇酯控制。質(zhì)粒的穩(wěn)定性可以通過(guò)向培養(yǎng)基中添加合適的選擇性作用物保持，例如抗生素。需氧條件可以通過(guò)向培養(yǎng)基中引入氧或含氧的氣體混合物保持，例如空氣。培養(yǎng)溫度通常是20℃-45℃，優(yōu)選的是25℃-40℃。繼續(xù)培養(yǎng)，直到L-賴氨酸的形成達(dá)到最大值。這一目標(biāo)通常在10小時(shí)-160小時(shí)之內(nèi)達(dá)到。形成的L-賴氨酸的濃度可以借助氨基酸分析儀經(jīng)離子交換層析和與茚三酮的柱后反應(yīng)測(cè)定，如Spackmann等(分析化學(xué)30，1190(1958))描述的。下列微生物按照布達(dá)佩斯條約的條款保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，Brunswick，德國(guó))·大腸桿菌K-12菌株DH5α／pEC7lysE，保藏號(hào)DSM12871·大腸桿菌K-12菌株DH5α／pEC7dapBlysE，保藏號(hào)DSM12875·谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715／pJC23，保藏號(hào)DSM12869·谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD::dapA(MA16)，保藏號(hào)DSM12867·谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD::dapA(MC20)，保藏號(hào)DSM12868借助在0．8％瓊脂糖凝膠上的電泳鑒別攜帶lysE基因的擴(kuò)增的約1．1kbDNA片段，用來(lái)源于Quiagen(Hilden，德國(guó))的QIAquick凝膠抽提試劑盒(產(chǎn)品號(hào)28704)從凝膠上分離并純化。然后借助來(lái)源于Boehringer曼海姆(曼海姆，德國(guó))的T4DNA連接酶將該片段連接至載體pUC18(Norrander等，基因(26)101-106(1983))上。這一過(guò)程通過(guò)以限制性內(nèi)切核酸酶SmaI充分切割載體pUC18，并且用堿性磷酸酶(寶靈格曼海姆，曼海姆，德國(guó))處理來(lái)完成。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆，一種操作方法，Vol．I．IRL-出版社，牛津，華盛頓DC，USA)。通過(guò)在LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，N．Y．)上涂布轉(zhuǎn)化混合物選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞，所說(shuō)的瓊脂上補(bǔ)充有氨芐青霉素50mg／l。從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA，并且通過(guò)用限制酶BamHI處理，其后用瓊脂糖凝膠電泳檢查。該質(zhì)粒稱為pUC18lysE。實(shí)施例2dapB的制備如實(shí)施例1所述，從谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032分離染色體DNA。這樣的來(lái)源于谷氨酸棒桿菌的dapB基因的序列是已知的(登記號(hào)X67737)。然而，所出版的DNA序列僅包括翻譯起始位點(diǎn)上游的56bp，因此翻譯起始位點(diǎn)的5’末端上游被附加測(cè)序。測(cè)序利用在已知dapB序列(登記號(hào)X67737)的區(qū)中結(jié)合的引物寡核苷酸以質(zhì)粒pJC25(EP-B0435132)進(jìn)行。所利用的測(cè)序引物的序列是5′GAACGCCAACCTTGATTCC3′測(cè)序用由Sanger等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，(74)5463-5467(1977)描述的鏈終止方法進(jìn)行。測(cè)序反應(yīng)是借助AutoRead測(cè)序試劑盒(Pharmacia，F(xiàn)reiburg)完成的。對(duì)測(cè)序產(chǎn)品的電泳分析和檢測(cè)用Pharmacia(Freiburg，德國(guó))的A．L．F．DNA測(cè)序儀完成。所獲得的DNA序列用來(lái)選擇第二引物，以獲得轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的進(jìn)一步的序列數(shù)據(jù)。下列引物選擇來(lái)用于該目的5′CTTTGCCGCCGTTGGGTTC3′如上所述進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，dapB基因上游的新序列顯示在SEQIDNo．1中。包括dapB基因核苷酸序列的序列顯示在SEQIDNo．2中。聚合酶鏈反應(yīng)用來(lái)擴(kuò)增dapB基因。對(duì)于這一目的而言，由MWGBiotech合成在dapB基因的已知DNA序列基礎(chǔ)上選擇的兩引物寡核苷酸P-dap5′(AAGCTT)AGGTTGTAGGCGTTGAGC3′dapall5′TTAACTTGTTCGGCCACAGC3′5′引物(引物P-dap)含有HindⅢ切割位點(diǎn)，在以上序列中由括弧表示。如實(shí)施例1進(jìn)行PCR。以這種方法擴(kuò)增約1．1kbDNA片段，其攜帶dapB基因并含有在一個(gè)末端的限制性內(nèi)切核酸酶HindⅢ切割位點(diǎn)。從0．8％瓊脂糖凝膠(QlAquick凝膠抽提試劑盒，來(lái)源于Qiagen，Hilden，德國(guó))純化所獲得的PCR片段，用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，荷蘭，產(chǎn)品號(hào)K4550-01)克隆進(jìn)克隆載體pCR2．1TOPO。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)Invitrogen的大腸桿菌菌株TOP10F′，將轉(zhuǎn)化混合物涂布在含有卡那霉素(50mg／l)，IPTG(0．16mM)和X-Gal(64mg／l)的LB培養(yǎng)基上，分離卡那霉素抗性菌落。借助Qiagen的QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA，用限制酶HindⅢ切割和接下來(lái)的瓊脂糖凝膠電泳檢查。擴(kuò)增的DNA片段的DNA序列通過(guò)測(cè)序檢查。PCR產(chǎn)物的序列與在SEQIDNo．1中顯示的序列匹配。所獲得的質(zhì)粒稱為pCR2．1TOPOdapB。實(shí)施例3將lysE克隆進(jìn)載體pEC7如下所述將來(lái)自質(zhì)粒pUC18lysE(實(shí)施例1)的攜帶lysE的片段插入到載體pEC7中。載體pEC7基于大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC5(Eikmanns等，10293-98(1991))。以下列方式從質(zhì)粒pEC5上除去不位于多接頭上的BamHⅠ切割位點(diǎn)以限制酶BamHⅠ部分切割質(zhì)粒pEC5，從瓊脂糖凝膠分離約7．2kbDNA片段，突出端以Klenow聚合酶(寶靈格曼海姆)填平。將所形成的DNA片段連接(T4連接酶，寶靈格曼海姆)。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α，在含有氯霉素(50mg／l)的LB瓊脂上分離氯霉素抗性菌落。從轉(zhuǎn)化子分離(Qiagen的QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒)質(zhì)粒DNA，并且用限制酶BamHⅠ與PstⅠ限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC6。質(zhì)粒pEC6以限制酶XhoⅠ充分切割。將攜帶trp終止子的DNA片段連接到載體DNA片段上(T4連接酶，寶靈格曼海姆)。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α，在含有卡那霉素(50mg／l)的LB瓊脂上分離卡那霉素抗性菌落。從轉(zhuǎn)化子分離(Qiagen的QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒)質(zhì)粒DNA，并且用限制酶BamHⅠ與XhoⅠ限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC7。將實(shí)施例1中所描述的質(zhì)粒pUC18lysE以限制酶BamHⅠ充分消化，攜帶lysE基因的1．1kbBamHI片段用如實(shí)施例1的方法分離。載體pEC7以限制酶BamHⅠ同樣充分地切割，并用堿性磷酸酶處理。將BamHⅠ載體片段和BamHⅠlysE片段連接(迅速DNA連接試劑盒，寶靈格曼海姆)，并且轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α。在含有氯霉素(10mg／l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。分離質(zhì)粒DNA(Qiagen的QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒)，并且用酶BamHⅠ限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC7lysE(圖1)。通過(guò)將質(zhì)粒pEC7lysE轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α獲得的菌株稱為DH5α／pEC7lysE。實(shí)施例4將dapB克隆進(jìn)載體pEC7從質(zhì)粒pCR2．1TOPOdapB(來(lái)源于實(shí)施例2)分離攜帶dapB基因的約1．1kbDNA片段。為這一目的，質(zhì)粒pCR2．1TOPOdapB以限制酶HindⅢ消化，分離攜帶dapB基因的約1．1kbDNA片段。將攜帶dapB的DNA片段連接到載體pEC7(實(shí)施例3)(T4DNA連接酶，寶靈格曼海姆)上，該載體已經(jīng)以限制酶HindⅢ充分消化，并且用堿性磷酸酶(寶靈格曼海姆)處理。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α，在含有卡那霉素(50mg／l)的LB瓊脂上分離卡那霉素抗性菌落。從轉(zhuǎn)化子分離(Qiagen的QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒)質(zhì)粒DNA，并且用限制酶HindⅢ限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC7dapB(圖2)。所獲得的大腸桿菌菌株稱為DH5α／pEC7dapB。實(shí)施例5制備同時(shí)含有dapB和lysE的質(zhì)粒從含有谷氨酸棒桿菌ATCC13032的dapB基因的質(zhì)粒pCR2．1TOPOdapB分離作為HindⅢ片段的dapB基因。為此，質(zhì)粒以限制酶HindⅢ充分消化，從0．8％瓊脂糖凝膠(Qiagen的QlAquick凝膠抽提試劑盒)分離攜帶dapB的DNA片段。載體pEC7(實(shí)施例3)也以限制酶HindⅢ充分消化，并且利用堿性磷酸酶處理。將含有dapB的1．1kb片段連接到所形成的線型載體片段上(T4連接酶，寶靈格曼海姆)，并將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α。在含有氯霉素(10mg／l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。分離質(zhì)粒DNA(QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒，Qiagen，Hilden，德國(guó))，并且以限制酶HindⅢ限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC7lysEdapB。這一質(zhì)粒能夠在大腸桿菌和在棒桿菌中自我復(fù)制，并且賦予其宿主對(duì)抗生素氯霉素的抗性。如圖3所示，質(zhì)粒pEC7lysEdapB同時(shí)含有dapB基因(其編碼二氫吡啶二羧酸還原酶)以及l(fā)ysE基因(其編碼賴氨酸輸送蛋白)。用pEC7lysEdapB轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α獲得的菌株被稱為DH5α／pEC7lysEdapB。實(shí)施例6轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒pJC1、pJC33和pJC50轉(zhuǎn)化菌株MH20-22B質(zhì)粒pJC1能夠在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中復(fù)制(Cremer等，分子和普通遺傳學(xué)220478-480(1990))。攜帶谷氨酸棒桿菌菌株MH20-22B的lysC(Fbr)基因的質(zhì)粒pJC33(Cremer等，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)57(6)，1746-1752(1991))來(lái)源于該質(zhì)粒。質(zhì)粒pJC50也基于載體pJC1，并且攜帶谷氨酸棒桿菌MH20-22B的lysC(FBR)基因和谷氨酸棒桿菌ATCC13032的dapA基因(DE-A-3943117)。通過(guò)電穿孔法(Haynes和Britz，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊(61)329-334(1989))將質(zhì)粒pJC1，pJC33和pJC50引入菌株MH20-22B。谷氨酸棒桿菌菌株MH20-22B是AEC-抗性賴氨酸生產(chǎn)菌，以保藏號(hào)DSM5715保藏。在含有卡拉霉素15mg／l的選擇瓊脂(LBHIS瓊脂(18．5g／l腦-心浸漬液，0．5M山梨醇，5g／l細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨，2．5g／l細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物的，5g／lNaCl，18g／l細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂))上，分離借助電穿孔法所獲得的轉(zhuǎn)化子。用常規(guī)方法(Peters-Wendisch等，微生物學(xué)144，915-927(1998))分離質(zhì)粒DNA，以合適的限制性內(nèi)切酶切割，并且檢查。所獲得的菌株稱為MH20-22B／pJC1，MH20-22B／pJC33和MH20-22B／pJC50。實(shí)施例7用質(zhì)粒pEC7lysE和pEC7dapBlysE轉(zhuǎn)化其后將第二質(zhì)粒提供給實(shí)施例6中制備的菌株。將質(zhì)粒pEC7lysE和pEC7dapBlysE用電穿孔法方法引入菌株MH20-22B／pJC1，MH20-22B／pJC33和MH20-22B／pJC50中。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌基于它們所含有的質(zhì)粒的抗生素抗性選擇。在選擇瓊脂(LBHIS瓊脂，含有卡那霉素15mg／l以及氯霉素7．5mg／l)上分離借助電穿孔法所獲得的轉(zhuǎn)化子。分離質(zhì)粒DNA，以合適的限制性內(nèi)切酶切割，并且檢查。其是由以下步驟完成的，首先于33℃在具有合適的抗生素的瓊脂平板(腦-心瓊脂，含有卡那霉素(25mg／l)，氯霉素(10mg／l))上培養(yǎng)各種菌株24小時(shí)。將這些瓊脂平板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(100ml錐形瓶中10ml培養(yǎng)基)。完全培養(yǎng)基CgⅢ用作預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基。加入卡那霉素(25mg／l)和氯霉素(10mg／l)。預(yù)培養(yǎng)在搖床上于240rpm下33℃進(jìn)行24小時(shí)。這一預(yù)培養(yǎng)物用來(lái)接種主培養(yǎng)物，以給出初始OD(660nm)0．2。培養(yǎng)基MM用于主培養(yǎng)。培養(yǎng)基MMCSL5gMOPS20g／l葡萄糖50g／l(分別加壓滅菌)鹽硫酸銨25g／l磷酸二氫鉀0．1g／l七水硫酸鎂1．0g／l二水氯化鈣10mg／l七水硫酸亞鐵10mg／l一水硫酸錳5．0mg／l生物素0．3mg／l(過(guò)濾滅菌)硫胺素*HCl0．2mg／l(過(guò)濾滅菌)碳酸鈣25g／l縮寫CSL玉米漿MOPS嗎啉丙烷磺酸CSL，MOPS和鹽溶液以氨水調(diào)整至pH7，并加壓滅菌。然后加入無(wú)菌底物、維生素溶液和干滅菌的碳酸鈣。培養(yǎng)在具有擋板的100ml錐形瓶中的10ml體積中進(jìn)行。加入卡那霉素(25mg／l)和氯霉素(10mg／l)。在33℃和80％大氣濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。在48小時(shí)之后，用Biomek1000(BeckmannInstrumentsGmbH，慕尼黑)在660nm的波長(zhǎng)下測(cè)量OD。所形成的賴氨酸的量借助EppendorfBioTronik(漢堡，德國(guó))的氨基酸分析儀經(jīng)離子交換層析和與茚三酮的柱后衍生化檢測(cè)反應(yīng)測(cè)定。葡萄糖含量用SkalarAnalytikGmbH(Erkelenz，德國(guó))的糖分析儀測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。表1<tablesid="table1"num="001"><table>菌株基因OD(660)賴氨酸-HClg／lDSM5715／pJC1／pEC7lysElysE9．111．1DSM5715／pJC33／pEC7lysElysE，lysC8．712．2DSM5715／pJC50／pEC7lysElysE，lysC，dapA9．112．7DSM5715／pJC23／pEC7lysElysE，dapA10．213．3DSM5715／pJC23／pEC7dapBlysElysE，dapA，dapB，10．915．4</table></tables>實(shí)施例9將aecD基因克隆進(jìn)載體pUC18用限制酶BgⅢ和EcoRV充分消化質(zhì)粒pSIR21(Rossol，博士論文，Bielefeld大學(xué)，1992)，然后分離攜帶谷氨酸棒桿菌ATCC13032的aecD基因(登錄號(hào)M89931)(Rossol和Puhler，細(xì)菌學(xué)雜志，174(9)，2968-2977(1992))的1．4kbDNA片段。根據(jù)Sambrook等所述(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)用T4DNA連接酶將分離出的DNA片段與已預(yù)先用BamHⅠ和SmaⅠ限制性內(nèi)切酶充分消化的質(zhì)粒pUC18連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α。在含有氨芐青霉素(100mg／l)的腦-心瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化子，分離質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒被稱為pUC18::aecD。實(shí)施例10將dapA基因克隆進(jìn)質(zhì)粒pSP72從質(zhì)粒pJC20(Cremer，J．博士論文，1989，Dusseldorf大學(xué))分離作為SphⅠ-BamHⅠ片段的dapA基因片段。載體pSP72(Promega公司，USA)用酶SphⅠ和BamHⅠ充分切割并用堿性磷酸酶處理。將載體和攜帶dapA的片段用T4DNA連接酶連接，并將該DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株SL1Blue(Bullock，F(xiàn)ernandez和Short，生物技術(shù)(5)376-379(1987))。在含100mg／l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒被稱為pSP72::dapA。實(shí)施例11dapA啟動(dòng)子的誘變及質(zhì)粒pSP72::dapA(MC20)和pSP72::dapA(MA16)的制備用Stratagene公司的Quickchange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖羞M(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)的誘變。根據(jù)已有的dapA序列設(shè)計(jì)如下引物用于誘變對(duì)于制備pSP72::dapA(MC20)針對(duì)MC20的引物dap1CCAAATGAGAGATGGTAACCTTGAACTCTATGAGCA針對(duì)MC20的引物dap2GTGCTCATAGAGTTCAAGGTTACCATCTTCCCTCATTTGG對(duì)于制備pSP72::dapA(MA16)針對(duì)MA16的引物dap3CCAAATGAGGGAAGAAGGTATAATTGAACTCTATGAGCA針對(duì)MA16的引物dap4GTGCTCATAGAGTTCAATTATACCTTCTTCCCTCATTTGG根據(jù)廠商(Stratagene)指導(dǎo)用Quickehange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖幸再|(zhì)粒pSP72::dapA(實(shí)施例10)為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。將誘變反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1-Blue。在具有100mg／l羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，用BstEⅡ切割證實(shí)BstEⅡ切割位點(diǎn)的刪除，不再具有BstEⅡ切割位點(diǎn)的質(zhì)粒具有所希望的突變。將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dapA缺陷型大腸桿菌突變體RDA8。轉(zhuǎn)化反應(yīng)物涂布在具有100mg／l羧芐青霉素的LB上，以測(cè)試dapA突變的互補(bǔ)作用。從轉(zhuǎn)化子中分離DNA，所得質(zhì)粒稱為pSP72::dapA(MC20)和pSP72::dapA(MA16)。用反向和通用測(cè)序引物經(jīng)Sanger等，美國(guó)科學(xué)院院刊(74)5463-5467(1977)所述的鏈終止反應(yīng)法測(cè)序質(zhì)粒。測(cè)序反應(yīng)用AutoRead測(cè)序試劑盒(Pharmacia，F(xiàn)reiburg)進(jìn)行。對(duì)測(cè)序產(chǎn)物的電泳分析和檢測(cè)用Pharmacia(Freiburg，德國(guó))的A．L．F．DNA測(cè)序儀完成。質(zhì)粒pUC18aecD::dapA(MC20)和pUC18aecD::dapA(MA16)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ部分酶切并用SalⅠ酶充分酶切，以獲得3．0kb的攜帶aecD::dapA(MA16)或aecD::dapA(MC20)的片段。用T4DNA連接酶將該片段與經(jīng)酶切并經(jīng)堿性磷酸酶處理的載體pK19mobsacB(Schafer等，基因(145)69-73(1994))連接。連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5(Hanahan(1985)，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，IRL出版社，Oxford，美國(guó)華盛頓特區(qū))。在具有50mg／l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。由此獲得質(zhì)粒pK19mobsacBaecD::dapA(MC20)和pK19mobsacBaecD::dapA(MA16)。用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株S17-1(Simon，Priefer和Puhler，生物／技術(shù)，(1)784-791(1983))。在具有50mg／l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA并檢查。獲得的菌株稱為S17-1／pK19mobsacBaecD:dapA(MC20)和S17-1／pK19mobsacBaecD::dapA(MA16)。實(shí)施例13制備氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD::dapA(MC20)和DSM5715aecD::dapA(MA16)用接合方法(Schafer等，細(xì)菌學(xué)雜志(172)1663-1666(1990))將S17-1／pK19mobsacBaecD::dapA(MC20)和S17-1／pK19mobsacBaecD::dapA(MA16)(實(shí)施例12)中的質(zhì)粒pK19mobsacBaecD::dapA(MC20)和pK19mobsacBaecD::dapA(MA16)轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715中。將接合混合物涂布在具有萘啶酮酸和卡那霉素的腦一心培養(yǎng)基上以選擇接合轉(zhuǎn)移子。將所得接合轉(zhuǎn)移子在10ml腦一心培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，將培養(yǎng)基等份涂布在含有蔗糖的培養(yǎng)基平板上(含10％蔗糖的腦一心瓊脂)，以根據(jù)對(duì)蔗糖的敏感性篩選。分離蔗糖抗性菌落并在含氯霉素和卡那霉素的瓊脂平板(含15mg／l卡那霉素的腦一心培養(yǎng)基和含10mg／l氯霉素的腦一心培養(yǎng)基)再檢查。分離具有下述表型的菌落蔗糖抗性卡那霉素敏感性氯霉素敏感性經(jīng)Southern印跡(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)證實(shí)dapA片段插入aecD基因中。實(shí)施例14制備谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD::dapA(MC20)／pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7和DSM5715/pEC7將實(shí)施例3的lysE基因插入載體pEC7中，經(jīng)電穿孔(Haynes，1989，F(xiàn)EMS微生物通信61329-334)將質(zhì)粒pEC7lysE或質(zhì)粒pEC7導(dǎo)入菌株DSM5715aecD::dapA(MC20)，DSM5715aecD::dapA(MA16)和DSM5715(實(shí)施例13)中，獲得谷氨酸棒桿菌DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7和DSM5715/pEC7。在具有25mg／l卡那霉素的腦一心瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA并證實(shí)。以此方式獲得如下菌株DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7和DSM5715/pEC7。實(shí)施例15用實(shí)施例14中制得的菌株制備賴氨酸如實(shí)施例8所述，將菌株DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7lysE，DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7，DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7和DSM5715/pEC7在培養(yǎng)基CgⅢ(Kase&amp;Nakayama，農(nóng)業(yè)和生物化學(xué)36(9)1611-1621(1972)中預(yù)培養(yǎng)，然后在生產(chǎn)培養(yǎng)基MM中培養(yǎng)。48小時(shí)后測(cè)660nm光密度和所形成的L-賴氨酸濃度。表2示出結(jié)果。表2<tablesid="table2"num="002"><table>菌株OD賴氨酸-HCl(g／l)DSM5715aecD::dapA(MC20)／pEC7lysE13．313．8DSM5715aecD::dapA(MA16)／pEC7lysE12．414．3DSM5715／pEC713．311．5DSM5715aecD::dapA(MA16)／pEC713．312．9DSM5715aecD::dapA(MC20)／pEC714．012．8</table></tables>序列表&lt;110&gt;德古薩-于爾斯股份公司于利希研究中心有限公司&lt;120&gt;生產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌及制備L-賴氨酸的方法&lt;130&gt;990058BT&lt;140&gt;&lt;141&gt;&lt;160&gt;&lt;170&gt;PatentInVer,2.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;795&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;谷氨酸棒桿菌&lt;220&gt;&lt;221&gt;-35信號(hào)&lt;222&gt;(774)．．(779)&lt;220&gt;&lt;223&gt;DNAupstreamfromdapB&lt;400&gt;1ctgcagcaatgagaccgagtaatttcggggttgaccagatacaccaatgagaacttggga60acgggcttcaaaaatactggtgaagttgatgtcttcaacaatgcctgcaccaggatatga120tccggtatcgatacctggaacgacaacctgatcaggatatccagtgccttgaatattgac180gttgaggaaggaatcaccagccatctcaactggaagacctgacgcctgctgaattggatc240agtggcccaatcgacccaccaaccaggttggccattaccggcgatatcaaaaacaactcg300tgtgaacgtttcgtgctcggcaacgcggatgccagcgatcgacatatcggagtcaccaac360ttgagcctgctgcttctgatccatcgacggggaacccaacggcggcaaagcagtggggga420aggggggagtttggtgcactctgaaccgagtggtctctgaagtggtaggcgacggggcag480ctatctgaaggcgtgcgagttgtggtgaccgggttagcggtttcagtttctgtcacaact540ggagcaggactagcagaggttgtaggcgttgagccgcttccatcacaagcacttaaaagt600aaagaggcggaaaccacaagcgccaaggaactactgcggaacgggcggtgaagggcaact660taagtctcatatttcaaacatagttccacctgtgtgattaatccctagaacggaacaaac720tgatgaacaatcgttaacaacacagaccaaaacggtcagttaggtatggatatcagcacc780ttctgaacgggtacg795&lt;210&gt;2&lt;211&gt;1815&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;谷氨酸棒桿菌&lt;220&gt;&lt;221&gt;-35信號(hào)&lt;222&gt;(774)．．(779)&lt;220&gt;&lt;221&gt;-10-信號(hào)&lt;222&gt;(798)．．(803)&lt;220&gt;&gt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(851)．．(1594)&lt;400&gt;2ctgcagcaatgagaccgagtaatttcggggttgaccagatacaccaatgagaacttggga60acgggcttcaaaaatactggtgaagttgatgtcttcaacaatgcctgcaccaggatatga120tccggtatcgatacctggaacgacaacctgatcaggatatccagtgccttgaatattgac180gttgaggaaggaatcaccagccatctcaactggaagacctgacgcctgctgaattggatc240agtggcccaatcgacccaccaaccaggttggccattaccggcgatatcaaaaacaactcg300tgtgaacgtttcgtgctcggcaacgcggatgccagcgatcgacatatcggagtcaccaac360ttgagcctgctgcttctgatccatcgacggggaacccaacggcggcaaagcagtggggga420aggggggagtttggtgcactctgaaccgagtggtctctgaagtggtaggcgacggggcag480ctatctgaaggcgtgcgagttgtggtgaccgggttagcggtttcagtttctgtcacaact540ggagcaggactagcagaggttgtaggcgttgagccgcttccatcacaagcacttaaaagt600aaagaggcggaaaccacaagcgccaaggaactactgcggaacgggcggtgaagggcaact660taagtctcatatttcaaacatagttccacctgtgtgattaatccctagaacggaacaaac720tgatgaacaatcgttaacaacacagaccaaaacggtcagttaggtatggatatcagcacc780ttctgaacgggtacgtctagactggtgggcgtttgaaaaactcttcgccccacgaaaatg840aaggagcataatgggaarcaaggttggcgttctcggagccaaaggccgt889MetGlyIleLysValGlyValLeuGlyAlaLysGlyArg1510gttggtcaaactattgtggcagcagtcaatgagtccgacgatctggag937ValGlyGlnThrIleValAlaAlaValAsnGluSerAspAspLeuGlu152025cttgttgcagagatcggcgtcgacgatgatttgagccttctggtagac985LeuValAlaGluIleGlyValAspAspAspLeuSerLeuLeuValAsp30354045aacggcgctgaagttgtcgttgacttcaccactcctaacgctgtgatg1033AsnGlyAlaGluValValValAspPheThrThrProAsnAlaValMet505560ggcaacctggagttctgcatcaacaacggcatttctgcggttgttgga1081GlyAsnLeuGluPheCysIleAsnAsnGlyIleSerAlaValValGly657075accacgggcttcgatgatgctcgtttggagcaggttcgcgactggctt1129ThrThrGlyPheAspAspAlaArgLeuGluGlnValArgAspTrpLeu808590gaaggaaaagacaatgtcggtgttctgatcgcacctaactttgctatc1177GluGlyLysAspAsnValGlyValLeuIleAlaProAsnPheAlaIle95100105tctgcggtgttgaccatggtcttttccaagcaggctgcccgcttcttc1225SerAlaValLeuThrMetValPheSerLysGlnAlaAlaArgPhePhe110115120125gaatcagctgaagttattgagctgcaccaccccaacaagctggatgca1273GluSerAlaGluValIleGluLeuHisHisProAsnLysLeuAspAla130135140ccttcaggcaccgcgatccacactgctcagggcattgctgcggcacgc1321ProSerGlyThrAlaIleHisThrAlaGlnGlyIleAlaAlaAlaArg145150155aaagaagcaggcatggacgcacagccagatgcgaccgagcaggcactt1369LysGluAlaGlyMetAspAlaGlnProAspAlaThrGluGlnAlaLeu160165170gagggttcccgtggcgcaagcgtagatggaatcccggttcatgcagtc1417GluGlySerArgGlyAlaSerValAspGlyIleProValHisAlaVal175180185cgcatgtccggcatggttgctcacgagcaagttatctttggcacccag1465ArgMetSerGlyMetValAlaHisGluGlnValIlePheGlyThrGln190195200205ggtcagaccttgaccatcaagcaggactcctatgatcgcaactcattt1513GlyGlnThrLeuThrIleLysGlnAspSerTyrAspArgAsnSetPhe210215220gcaccaggtgtcttggtgggtgtgcgcaacattgcacagcacccaggc1561AlaProGlyValLeuValGlyValArgAsnIleAlaGlnHisProGly225230235ctagtcgtaggacttgagcattacctaggcctgtaaaggctcatttcagcagc1614LeuValValGlyLeuGluHisTyrLeuGlyLeu240245gggtggaattttttaaaaggagcgtttaaaggctgtggccgaacaagttaaattgagcgt1674ggagttgatagcgtgcagttcttttactccacccgctgatgttgagtggtcaactgatgt1734tgagggcgcggaagcactcgtcgagtttgcgggtcgtgcctgctacgaaacttttgataa1794gccgaaccctcgaactgcttc1815&lt;210&gt;3&lt;211&gt;248&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;谷氨酸棒桿菌&lt;400&gt;3MetGlyIleLysValGlyValLeuGlyAlaLysGlyArgValGlyGln151015ThrIleValAlaAlaValAsnGluSerAspAspLeuGluLeuValAla202530GluIleGlyValAspAspAspLeuSerLeuLeuValAspAsnGlyAla354045GluValValValAspPheThrThrProAsnAlaValMetGlyAsnLeu505560GluPheCysIleAsnAsnGlyIleSerAlaValValGlyThrThrGly65707580PheAspAspAlaArgLeuGluGlnValArgAspTrpLeuGluGlyLys859095AspAsnValGlyValLeuIleAlaProAsnPheAlaIleSerAlaVal100105110LeuThrMetValPheSerLysGlnAlaAlaArgPhePheGluSerAla115120125GluValIleGluLeuHisHisProAsnLysLeuAspAlaProSerGly130135140ThrAlaIleHisThrAlaGlnGlyIleAlaAlaAlaArgLysGluAla145150155160GlyMetAspAlaGlnProAspAlaThrGluGlnAlaLeuGluGlySer165170175ArgGlyAlaSerValAspGlyIleProValHisAlaValArgMetSer180185190GlyMetValAlaHisGluGlnValIlePheGlyThrGlnGlyGlnThr195200205LeuThrIleLysGlnAspSerTyrAspArgAsnSerPheAlaProGly210215220ValLeuValGlyValArgAsnIleAlaGlnHisProGlyLeuValVal225230235240GlyLeuGluHisTyrLeuGlyLeu245&lt;210&gt;4&lt;211&gt;79&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;谷氨酸棒桿菌&lt;220&gt;&lt;223&gt;dapA野生型啟動(dòng)子&lt;400&gt;4gttaggttttttgcggggttgtttaacccccaaatgagggaagaaggtaaccttgaactc60tatgagcacaggtttaaca79&lt;210&gt;5&lt;211&gt;79&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;合成序列的描述具有MC20突變的谷氨酸棒桿菌的dapA啟動(dòng)子&lt;220&gt;&lt;221&gt;突變&lt;222&gt;(45)&lt;400&gt;5gttaggttttttgcggggttgtttaacccccaaatgagggaagatggtaaccttgaactc60tatgagcacaggtttaaca79&lt;210&gt;6&lt;211&gt;80&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;合成序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;合成序列的描述具有MA16突變的谷氨酸棒桿菌dapA啟動(dòng)子&lt;220&gt;&lt;221&gt;突變&lt;222&gt;(35)．．(53)&lt;400&gt;6gttaggttttttgcggggttgtttaacccccaaaatgagggaagaaggtataattgaact60ctatgagcacaggtttaaca80附圖有下列附圖·圖1pEC7lysE·圖2pEC7dapB·圖3pEC7dapBlysE用于附圖的縮寫定義如下Cm氯霉素抗性基因dapB谷氨酸棒桿菌的dapB基因lysE谷氨酸棒桿菌的lysE基因pyc谷氨酸棒桿菌的pyc基因OriE質(zhì)粒編碼的大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)pBL質(zhì)粒pBL1的DNA片段EcoRⅠ限制酶EcoRⅠ切割位點(diǎn)EcoRⅤ限制酶EcoRⅤ切割位點(diǎn)HincⅡ限制酶HincⅡ切割位點(diǎn)HindⅢ限制酶HindⅢ切割位點(diǎn)KpnⅠ限制酶KpnⅠ切割位點(diǎn)SalⅠ限制酶SalⅠ切割位點(diǎn)SmaⅠ限制酶SmaⅠ切割位點(diǎn)SphⅠ限制酶SphⅠ切割位點(diǎn)PvuⅡ限制酶PvuⅡ切割位點(diǎn)BamHⅠ限制酶BamHⅠ切割位點(diǎn)權(quán)利要求1．生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀菌，其具有擴(kuò)增的lysE基因，在這些菌株中，選自包括dapA基因，lysC基因，pyc基因和dapB基因的組的附加基因分別或一起得到擴(kuò)增，尤其是超量表達(dá)。2．如權(quán)利要求1中所要求的棒狀菌，其中dapB基因得到擴(kuò)增，尤其是超量表達(dá)。3．如權(quán)利要求1中所要求的棒狀菌，其中額外含有SEQIDNO．1所示的dapB基因翻譯起點(diǎn)上游的5′末端的dapB基因是擴(kuò)增的，尤其是超量表達(dá)的。4．如權(quán)利要求1中所要求的棒狀菌，其含有SEQIDNo．5和SEQIDNo．6中所示的dapA啟動(dòng)子的MC20或MA16突變。5．優(yōu)選地為重組的DNA，其來(lái)源于棒狀菌，并且能夠在棒狀菌中復(fù)制，該DNA至少含有SEQIDNo．1中所示的額外編碼dapB基因翻譯區(qū)上游的5’末端的核苷酸序列。6．如權(quán)利要求5中所要求的能夠復(fù)制的DNA，其具有SEQIDNo．1中所示的核苷酸序列。7．如權(quán)利要求1中所要求的棒狀菌，其中dapA基因和1ysC基因是擴(kuò)增的，尤其是超量表達(dá)的。8．一種通過(guò)發(fā)酵具有擴(kuò)增的lysE基因的棒狀菌制備L-賴氨酸的方法，其中使用這樣的細(xì)菌，其編碼選自包括dapA，lysC，pyc和dapB的組的基因的核苷酸序列分別或一起得到擴(kuò)增，尤其是超量表達(dá)。9．如權(quán)利要求8的方法，其中使用這樣的細(xì)菌，其dapA基因和lysC同時(shí)得到擴(kuò)增，尤其是超量表達(dá)。10．如權(quán)利要求8的方法，其中使用這樣的細(xì)菌，其dapA基因和dapB基因同時(shí)得到擴(kuò)增，尤其是超量表達(dá)。11．如權(quán)利要求8的方法，其中使用由一種或多種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，所說(shuō)的質(zhì)粒載體攜帶有待擴(kuò)增的基因的核苷酸序列。12．如權(quán)利要求9的方法，其中使用由一種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，所說(shuō)的質(zhì)粒載體攜帶有編碼選自包括dapA，lysC和lysE基因的核苷酸序列。13．如權(quán)利要求11的方法，其中使用由一種或多種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，所說(shuō)的質(zhì)粒載體分別或一起攜帶編碼dapA，lysC，pyc和lysE基因的核苷酸序列。14．如前述一或多項(xiàng)權(quán)利要求所要求的方法，其中使用谷氨酸棒桿菌的細(xì)菌。15．如前述一或多項(xiàng)權(quán)利要求所要求的通過(guò)發(fā)酵制備L-賴氨酸的方法，該方法包括以下步驟a)發(fā)酵L-賴氨酸生產(chǎn)菌，在這些細(xì)菌中，所描述的基因得到了擴(kuò)增，b)在培養(yǎng)基中或在細(xì)菌細(xì)胞中富集L-賴氨酸，和c)分離L-賴氨酸。16．大腸桿菌K-12菌株DH5α／pEC7lysE，保藏號(hào)為DSM12871。17．大腸桿菌K-12菌株DH5α／pEC7dapBlysE，保藏號(hào)為DSM12875。18．谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715／pJC23，保藏號(hào)為DSM12869。19．谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD::dapA(MA16)，保藏號(hào)為DSM12867。20．谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD::dapA(MC20)，保藏號(hào)為DSM12868。21．谷氨酸棒桿菌DM678菌株，保藏號(hào)為DSM12866。全文摘要本發(fā)明涉及棒狀菌的生產(chǎn)L－賴氨酸的菌株,其具有擴(kuò)增的lysE基因(賴氨酸輸送載體基因),在這些菌株中,選自包括dapA基因(二氫吡啶二羧酸合酶基因),lysC基因(天冬氨酸激酶基因),dapB基因(二氫吡啶二羧酸還原酶基因)和pyc基因的組的附加基因,特別是dapA基因和lysC基因(天冬氨酸激酶基因)得到擴(kuò)增,尤其是超量表達(dá)。本發(fā)明也涉及制備L－賴氨酸的方法。文檔編號(hào)C12P13/08GK1280184SQ00109840公開日2001年1月17日申請(qǐng)日期2000年7月7日優(yōu)先權(quán)日1999年7月7日發(fā)明者貝蒂娜·默克爾,瓦爾特·普費(fèi)弗勒,卡羅琳·克羅伊策,斯特凡·漢斯,梅希特希爾德·里平,洛塔爾·埃格林,赫爾曼·扎姆,米羅斯拉夫·帕特克申請(qǐng)人:德古薩－于爾斯股份公司,于利希研究中心有限公司