專利名稱：新的成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白結合蛋白及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及編碼人Creaml的cDNA序列，該基因編碼產(chǎn)物是一種新的轉錄調控因子，也是成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白(Rb蛋白)的結合蛋白。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
成視網(wǎng)膜細胞瘤基因也被簡稱為Rb基因，它是第一個發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因(Goodrich和Lee,1993,Biochim.Biophy.Acta 1155:43-61)。Rb基因編碼Rb蛋白(成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白)。在細胞周期中，Rb蛋白是細胞周期G1期關卡的重要組成成分。Rb蛋白功能的喪失會導致腫瘤發(fā)生和發(fā)育缺陷(Weinberg,Cell 81,323-330(1995)；Lin等人，Cancer Biol.7,279-89(1996)；Tan和Wang,Trends.Cell Biol.8,116-20(1998))。
數(shù)種DNA腫瘤病毒的轉化蛋白，包括SV40的大T抗原、腺病毒的E1a和16型乳頭瘤病毒的E7蛋白，會在病毒感染時直接與Rb的T抗原結合域作用。這一步驟對于隨后轉化宿主細胞而言是至關重要的。這一作用導致一些對細胞周期進展關鍵的Rb結合蛋白(如E2F1)發(fā)生解離，從而繞過正常細胞的作用機理(在正常機理中，在G1后期只有Rb被“細胞周期蛋白依賴性激酶”磷酸化時，這些因子才被釋放)。因此，細胞周期失去了正常的調控機制，這是腫瘤細胞的特點。天然發(fā)生的腫瘤細胞則采用使Rb因突變而失活的策略。結果，發(fā)現(xiàn)Rb功能的各種不同突變存在于100％視網(wǎng)膜細胞瘤、以及其他一些腫瘤(如骨肉瘤、肺癌、和膀胱癌)中(Goodrich和Lee,1993,Biochim.Biophy.Acta1155:43-61)。
此外，最近的研究還發(fā)現(xiàn)Rb蛋白在早期的胚胎發(fā)育和組織分化方面也有非常重要的作用。Rb缺陷型小鼠會在胚胎第14和15天死亡，并且有神經(jīng)生成和造血方面的異常(Lin等人，同上)。
Rb在小鼠的脂肪形成過程中也是需要的。與Rb在細胞周期中常見的抑制作用不同，Rb似乎通過直接作用而激活C/EBP，從而調節(jié)脂肪細胞的分化(Chen,P.L.等人，Genes.Dev.10,2794-2804(1996))。
此外，在沒有功能性的Rb蛋白時，鼠骨骼肌細胞不能充分分化，因為分化的肌細胞會再進入細胞周期(Gu,W.等人，Cell 72,309-324(1993)；Zacksenhaus等人，Genes.Dev.10,3051-3064(1996))。Rb可能是通過激活MyoD而發(fā)揮其在肌形成過程中的作用。此外，Rb和轉錄抑制因子HBP1的化學計量比對于成肌細胞的分化也有作用(Shih,H.H.等人，Mol.Cell.Biol.18,4732-4743(1998))。
研究已表明，Rb蛋白是脊椎動物細胞周期和發(fā)育中重要的調控蛋白。它是通過直接與細胞周期進行和分化中所涉及的蛋白因子發(fā)生作用而發(fā)揮其功能的。
轉錄因子TFⅡ-Ⅰ是一種多功能的轉錄調節(jié)物。它最初被鑒定為起始子的結合因子，通過結合無TATA(TATA-less)啟動子中的起始子位點而參與轉錄調控(Roy,A.L.Nature365,355-359(1993))。TFⅡ-Ⅰ有6個保守的重復序列(Roy,A.L.,等人，EMBO.J.16:7091-7104(1997)；Grueneberg,D.A.等人，Genes Dev.11:2482-2493(1997))。盡管重復序列的生理作用尚不清楚，但是螺旋-環(huán)-螺旋樣結合域的存在暗示它們可能參與DNA結合(Roy,A.L.等人，同上)。已表明，TFⅡ-Ⅰ可結合于不同的DNA序列。另一方面，TFⅡ-Ⅰ還與其他各種轉錄因子直接作用，例如c-myc(Roy A.L.,Nature 365,359-361(1993))、USFl(Roy,A.L.,等人，EMBO.J.16:7091-7104(1997))、SRF和PhoX1(Grueneberg,D.A.等人，Genes Dev.11:2482-2493(1997))、以及STAT1和STAT2(Kim D.W.Mol.Cell.Biol.18,3310-3320(1998))。此外，TFⅡ-Ⅰ(也稱為“BAP-135”)可結合于Bruton氏酪氨酸激酶(btk)[btk是正常的B細胞發(fā)育所需的一種細胞質酪氨酸激酶]，并且根據(jù)btk的活化而使酪氨酸被磷酸化(Yang,W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94:604-609(1997))。TFⅡ-Ⅰ的酪氨酸磷酸化，對于TFⅡ-Ⅰ的起始子依賴性的轉錄活性而言是至關重要的(Novian,C.D.等人，J.Biol.Chem.273,33443-33448(1998))。這些特性暗示，TFⅡ-Ⅰ的作用可能是協(xié)調基本的轉錄機制以及一組響應某些信號途徑的上游調控因子。最后，半合子狀態(tài)(hemizygosity)的TFⅡ-Ⅰ與Williams綜合癥有關(Perez-Jurado,L.A.等人，Hum.Mol.Genet.7,325-334(1998))。
Williams綜合癥是一種先天的神經(jīng)性紊亂綜合癥。Williams綜合癥的癥狀包括多種系統(tǒng)的缺陷，例如智力發(fā)育遲緩等，尤其表現(xiàn)為認知的障礙。該疾病在世界人口中發(fā)病率約1∶20,000。為了減少該疾病的發(fā)病率，人們迫切需要開發(fā)新的有效的產(chǎn)前診斷方法。
由于，Rb蛋白和/或“Rb蛋白結合蛋白”的異常與一些疾病相關，因此，為治療目的研究和開發(fā)Rb蛋白的結合蛋白，即與Rb蛋白發(fā)生相互作用的蛋白具有重要意義。
本發(fā)明旨在解決已有技術的這些和其它的問題，提供了一種Rb蛋白結合蛋白以及該蛋白在診斷Williams綜合癥等方面的應用。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼一種Rb蛋白結合蛋白，本發(fā)明的新的Rb蛋白結合蛋白基因被命名為人Creaml基因。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的Rb蛋白結合蛋白，該蛋白被命名為人Creaml蛋白。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產(chǎn)所述的新的人的Creaml多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種人的Creaml核酸序列和多肽的應用，尤其在診斷Williams綜合癥的應用方面的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人Creaml蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸8-2887位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQID NO.1中從核苷酸8-2887位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.1中從核苷酸8-2887位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的人Creaml蛋白多肽，它包括具有SEQ IDNO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種產(chǎn)生具有人Creaml蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人Creaml蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人Creaml蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸8-2887位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人Creaml蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人Creaml蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人Creaml蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗人Creaml蛋白多肽活性的化合物，以及抑制人Creaml蛋白多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人Creaml蛋白多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了用上述化合物來調節(jié)人Creaml蛋白在體內、體外活性的方法。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與人Creaml蛋白多肽異常表達相關的疾病或疾病易感性(尤其是William綜合癥)的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變，或者檢測基因組中Creaml基因是否處于半合狀態(tài)。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進人Creaml蛋白多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人Creaml蛋白多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人Creaml蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人Creaml蛋白多肽以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療William綜合癥、癌癥、心血管疾病等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
在本申請，使用以下縮寫B(tài)D: Gal 4的DNA結合域Ccr1-3: Creaml蛋白的保守區(qū)1-3Cr1-5: Creaml蛋白的重復序列1-5EST表達序列標志IIF直接免疫熒光Inr起始子MBP麥芽糖結合蛋白NLS核定位信號SIEc-sis血小板衍生生長因子誘導元件SRE血清應答元件Tcr1-3 TFⅡ-1的保守區(qū)1-3TnIs 慢肌纖維特異性肌鈣蛋白ⅠTr1-6TFⅡ-Ⅰ的重復序列1-6在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為683個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于8-2887位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發(fā)明中，術語“人Creaml蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人Creaml蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中8-2887位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框8-2887位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中8-2887位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQID NO.2所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.1中從核苷酸8-2887位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸8-2887位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％。最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人Creaml相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5＇和/或3＇端添加數(shù)個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質或多肽是指其至少占樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術語“人Creaml蛋白多肽”指具有人Creaml蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與人Creaml相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人Creaml蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人Creaml DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人Creaml多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人Creaml多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人Creaml多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人Creaml多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。作為人Creaml多肽的可溶性片段的一種用途，它們可以被用作免疫原性的抗原來免疫動物，以制備抗Creaml多肽的抗體。
發(fā)明還提供人Creaml蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人Creaml多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人Creaml保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明還包括人Creaml多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內人Creaml的表達。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人Creaml多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人Creaml的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人Creaml核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應于人Creaml多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于” 意味著相鄰近，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞， 昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人Creaml DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人Creaml基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人Creaml基因產(chǎn)物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制人Creaml蛋白的分子，也包括那些并不影響人Creaml蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人Creaml基因產(chǎn)物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人Creaml基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人Creaml或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495,1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies andT Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人Creaml功能的抗體以及不影響人Creaml功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人Creaml基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人Creaml基因產(chǎn)物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人Creaml核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得含有關序列的DNA。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中的各種DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
可以將本發(fā)明的多肽和拮抗劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機構所給出的指示性提示，該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷售的政府管理機構許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內的給藥途徑。Creaml以有效地治療和/或預防具體的適應癥的量來給藥。施用于患者的Creaml的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。
人Creaml蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g可用于治療由于Creaml的無表達或異常/無活性的Creaml的表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的Creaml，以抑制內源性的Creaml活性。例如，一種變異的Creaml可以是縮短的、缺失了信號傳導功能域的Creaml，雖可與下游的底物結合，但缺乏信號傳導活性。因此重組的基因治療載體可用于治療Creaml表達或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將Creaml基因轉移至細胞內。構建攜帶Creaml基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook,et al.)。另外重組人Creaml蛋白基因可包裝到脂質體中然后再轉移至細胞內。
抑制人Creaml蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學或酶進行特異性切割，并進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析。
本發(fā)明還提供了針對人Creaml蛋白抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產(chǎn)生的片段。
抗人Creaml蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人Creaml蛋白。
與人Creaml蛋白結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預防與人Creaml蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人Creaml蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設計針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如人Creaml蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人Creaml蛋白陽性的細胞。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人Creaml蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
人Creaml蛋白單克隆抗體可用雜交瘤技術生產(chǎn)(Kohler and Milstein.Nature,1975,256:495-497)。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結合的嵌合抗體可用已有的技術生產(chǎn)(Morrison等，PNAS,1985,81:6851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(U.S.PatNo.4946778)也可用于生產(chǎn)抗人Creaml蛋白的單鏈抗體。
能與人Creaml蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人Creaml蛋白分子進行標記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人Creaml蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人Creaml蛋白水平，可以用作解釋人Creaml蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷Creaml起作用的疾病。
Creaml的多聚核苷酸可用于Creaml相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，Creaml的多聚核苷酸可用于檢測Creaml的表達與否或在疾病狀態(tài)下Creaml的異常表達。如CreamlDNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷Creaml的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Mlcroarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用Creaml特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測Creaml的轉錄產(chǎn)物。
檢測Creaml基因的突變也可用于診斷Creaml相關的疾病。Creaml突變的形式包括與正常野生型Creaml DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明多肽和多核苷酸的上述及其他用途包括例如，本發(fā)明多肽可用于肽指紋圖譜鑒定；本發(fā)明的人Creaml蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應；或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。根據(jù)本發(fā)明的教導，這些應用對于本領域技術人員而已是顯而易見的。
Creaml蛋白是本發(fā)明人鑒定出的一個新的與Rb結合的候選蛋白。它能在體外條件下通過C端與Rb特異性地結合，因此是一種Rb蛋白結合蛋白。
在結構上，Creaml蛋白是一個廣泛表達的含有959個氨基酸，分子量約120Kda的核蛋白，有一個與SV40大T抗原核定位信號相似的核定位信號。Creaml的氨基酸序列含有5個與多功能轉錄調節(jié)因子TFⅡ-Ⅰ有一定同源性的重復序列。除了這5個重復序列外，Creaml另外還有3個與TFⅡ-Ⅰ高度同源的區(qū)域。TFⅡ-Ⅰ在無TATA盒的轉錄起始體系中起著重要的作用，而且它受一些信號傳導通路的調控。但是不同之處在于，Creaml能形成同二聚體，而與TFⅡ-Ⅰ不能形成異二聚體。
此外，Creaml與最近發(fā)現(xiàn)的一個新的肌肉細胞增強子結合蛋白MusTRD1高度同源，但MusTRD1只含有Creaml的N端的458個氨基酸，造成這種結果的原因是MusTRDl cDNA編碼區(qū)多一個“G”，導致讀框移碼。它們之間的關系暗示著Creaml可能參與肌肉細胞的基因表達調控。
除此之外，Creaml基因位于染色體7q11.23區(qū)域上，含27個外顯子，結果基因總長度超過150Kb。該基因位于Williams綜合癥病人的染色體缺失區(qū)內。該基因在一條染色體上的缺失有可能是Williams綜合癥中某些病癥的病因。因而，該基因可用于Williams綜合癥的產(chǎn)前診斷。
綜上所述，Creaml蛋白很可能是處于Rb調控之下的一種普遍存在的轉錄調節(jié)因子。由于本發(fā)明的Creaml具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種的同族蛋白相比，預計在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。
在附圖中，


圖1顯示了Creaml cDNA核苷酸序列和推測的氨基酸序列。
(A)Creaml不同的cDNA克隆，克隆S22在1,406核苷酸位置上有一個“G”的缺失；克隆S21缺失了1,977-2,021的核苷酸序列。最后一個克隆是完整的核苷酸序列，黑框區(qū)域表示編碼區(qū)，并標明了構建質粒所用的限制性酶切位點。
(B)cDNA序列以及推測的Creaml氨基酸序列。劃線的部分是推測的核定位信號及一串絲氨酸。推導的NLS被框出。
圖2顯示了TFⅡ-Ⅰ和Creaml之間序列的比較。其中，圖2A顯示了兩個蛋白質的結構特性，相同形式的框代表同源區(qū)。圖2B顯示了TFⅡ-Ⅰ(Tr1-6)和Creaml(Cr1-5)這11個重復序列的序列比較。在保守序列中，出現(xiàn)頻率高的列在第一行，而其它相近的氨基酸殘基列在第二行(下列氨基酸被視為同源L、V和I,Y和F,S和T,K和R,E和D)。劃粗線部分代表在所有的重復序列中最保守的區(qū)域，長度含有80個氨基酸殘基。圖2C顯示了Tcr13和Ccr1-3保守區(qū)域的氨基酸順序。劃線的氨基酸是參與二聚體形成的“疏水拉鏈”結構中的疏水性氨基酸。
圖3A顯示了Creaml基因結構圖。Creaml的基因結構是根據(jù)華盛頓大學醫(yī)學院基因組測序中心的R.H.Waterston博士公布在Genbank中的DJ0665P05號基因克隆(約133Kb,Genbank的登錄號是AC004851)和DJ1186P10(約149Kb,Genbank的登錄號是AC005231)排列成的。這個基因目前分布于四個片段中，它們之間有3段未知長度的間隔。每個外顯子的第一個和最后一個核苷酸都按照它們在cDNA上的排列位置表示出來。外顯子的長度沒有按比例畫出來。圖3B顯示了Creaml中的外顯子-內含子邊界。
圖4顯示了Creaml基因在Williams綜合癥的關鍵區(qū)域內。在這個關鍵區(qū)域已知的基因包括ELN(編碼彈性蛋白)，LIMK1(編碼LIM激酶1)，RFC2(編碼復制因子C)，F(xiàn)ZD3(編碼frizled同源物)，STX1A(編碼突出融合蛋白1A)，以及GTF21(編碼TFⅡ-Ⅰ)。
(A)A圖顯示由其它研究人員發(fā)表的基因連鎖圖譜。黑框部分代表Williams綜合癥的關鍵區(qū)域，GTF2IP是GTF2I的假基因拷貝。
(B)RH圖譜是從公布在NIH網(wǎng)站上的98年基因圖譜中人類第7號染色體從D7S2415-D7S669的區(qū)域內獲得的。Distance代表到染色體短臂端粒的距離，序列標記的位點(STS)，以及相應的基因的名稱也已列出。
圖5顯示了Creaml能與Rb在體外條件下結合。
(A)在這個體系使用的與多聚組氨酸(His6)融合的p56Rb。圖5A圖顯示的是His6p56Rb從細菌裂解液中純化后，經(jīng)過10％SDS聚丙烯酰胺電泳后，通過抗多聚組氨酸的單克隆抗體經(jīng)免疫印記法顯示的帶。該圖顯示了His6-P56RB的大小以及純度。
(B)圖5B圖顯示的是不同的FLAG融合蛋白，通過8％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用抗FLAG的單克隆抗體經(jīng)免疫印跡法顯出的帶。它表示出在膜上不同蛋白質的相應含量。
(C)圖5C圖表示的是與B圖同樣的膜經(jīng)過與“RB夾心物”(即1μgHis6P56RB,1μg抗His6的單克隆抗體以及1μl堿性磷酸酯酶耦聯(lián)的羊抗兔IgG所形成的免疫復合物)在冰上溫育3小時后，經(jīng)免疫印跡法顯示的帶。箭頭所指為不同F(xiàn)LAG融合蛋白的位置，其它帶為細菌蛋白。
(D)圖5D圖顯示的是該體系所用的兩個Creaml突變體的結構。
圖6顯示了抗Creaml多克隆抗體T8的特異性。
(A)．泳道2是12％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后經(jīng)考馬斯亮蘭染色顯示的蛋白條帶，泳道1是MBP-p05融合蛋白，泳道2是用十因子酶切后的MBP-P05(下面兩條約30KDa左右的帶是P05，即免疫兔子產(chǎn)生抗Creaml多克隆抗體的抗原；中間一條是MBP。)。泳道3是酶切后的MBP-P05與免疫前血清經(jīng)免疫印跡法顯色后的結果，沒有出現(xiàn)蛋白帶，說明免疫前血清不能識別抗原。泳道4是酶切后的MBP-P05與T8經(jīng)免疫印跡法顯色后的結果，說明T8能特異性地識別抗原(P05)。
(B)泳道1,3,5是Creaml的突變體FLAG-Ap32，泳道2,4,6是全長的His6-TFⅡ-Ⅰ，泳道1-2是與抗體T8經(jīng)免疫印跡后的結果，泳道3-4是與抗多聚組氨酸的單克隆抗體經(jīng)免疫印跡后的結果，泳道5-6是與抗FLAG的單克隆抗體經(jīng)免疫印跡后的結果，該圖表示抗體T8只特異地識別FLAG-Ap32，而不識別TFⅡ-Ⅰ。
圖7．(A)在CV1(非洲綠猴腎細胞)細胞裂解液中鑒定出Creaml是120KDa大小的蛋白質。泳道1,3,5是MBP-P05融合蛋白，泳道2,4,6是CV1細胞裂解液。泳道1,2是與抗體T8經(jīng)免疫印跡的結果。與泳道3,4反應的抗體T8預先與5μgMBP-P05溫育過，與泳道5,6反應的抗體T8預先和5μgMBP溫育過。A圖說明T8識別的120KDa的蛋白是特異性的，應是creaml。
(B)泳道1是CV1細胞裂解液，泳道2是細菌裂解液中的FLAG-Creaml。B圖是通過與抗體T8免疫印跡法顯示處的蛋白帶。說明FLAG-Creaml與細胞中的野生型的Creaml大小相同，因而我們克隆到的cDNA是全長的。
圖8顯示了CV1核提取物中USEB1-蛋白復合物的形成。CV1核提取物與放射性標記的含有MusTRD1結合位點的USEB1探針混合。用遷移率分析來檢測復合物的形成。利用50,100,300倍的未標記的USEB1,USEB1b(-突變的雙鏈核苷酸)作為競爭者。特異結合條帶用箭頭指示，非特異結合條帶(NS)用箭頭表示。
圖9顯示了Creaml的核定位信號的鑒定。其中，圖9A、融合蛋白FLAG-AP32和FLAG-AP32N的結構。圖9B、表達FLAG-AP32和FLAG-AP32N的質粒轉化到CV1細胞中，經(jīng)過48小時，細胞用-20℃的冰甲醇固定，然后與抗FLAG的單克隆抗體(圖片1,3,5)和抗Creaml的多克隆抗體T8的混合物溫育2小時，再與藕聯(lián)有熒光素的羊抗鼠或羊抗兔的二抗溫育1小時，用免疫熒光顯微鏡觀察、拍照。圖片1和2是表達FLAG-AP32的細胞，圖片3,4也是表達FLAG-AP32的細胞，但與它反應的抗體混合物預先與mbp-p5溫育過。圖片5和6是表達FLAG-AP32N的細胞。從B圖可看出，抗FLAG的單抗和抗Creaml的多克隆抗體識別的蛋白在細胞中的定位是一致的。FLAG-AP32是核蛋白，而去掉核定位信號的FLAG-AP32N是細胞質蛋白，從這個現(xiàn)象可以說明FLAG-AP32N缺失的那一段核苷酸的序列含有Creaml的核定位信號。
圖10顯示了在酵母雙雜交體系中Creaml能形成二聚體。
(A)A圖顯示的是在這個系統(tǒng)中使用的各種TFⅡ-1和Creaml的突變體的結構。AD代表激活區(qū)域，它有激活報告基因轉錄的作用。DB代表結合DNA的區(qū)域，這個區(qū)域能使蛋白質結合到DNA上。
(B)結果顯示。列出的β半乳糖苷酶活性是兩個隨機挑選的克隆，通過ONPG方法測得的平均值。His-補償表示的通過選擇性培養(yǎng)基篩選的結果，+表明陽性結果，-陰性結果。從B圖可見CreamlN和CreamlN易形成二聚體，AP32和AP2也能形成二聚體，但之間的相互作用轉弱。而Creaml和TFⅡ-1之間不能形成異二聚體。
圖11顯示了Creaml能在體內與Rb結合。CV1細胞用表達Rb和FLAG-Creaml的質粒共轉染。48小時后裂解細胞并用圖中指定的抗體進行免疫共沉淀(IP)和免疫印跡。使用抗Rb的單克隆抗體不僅能沉淀下Rb蛋白(泳道1)，而且還能得到Creaml(泳道3)。相比之下，對照抗體(抗CD4)抗體則不能沉淀Rb(泳道2)和Creaml(泳道4)。
圖12A和12B分別顯示了質粒pFLAP2和pFCreaml的結構圖。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用F說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人Creaml的cDNA序列的克隆和測定最初的cDNA片段Ap-2，是從HeLa表達cDNA文庫中用純化的Rb蛋白為探針分離出的(Shan,B.Mol Cell.Biol.12,5620-5631(1992))。該片段被放射性標記，以進一步篩選更長的cDNA克隆。由于在所用的文庫中ZZ cDNA的豐度低，因此，將胎盤cDNA文庫(Clontech)的質粒DNA和人胎脾的Marathon cDNA(Clontech)用作模板，用PCR法獲得5＇編碼序列。
對于pACT2文庫，用引物Gal-p(5＇-CTATTCGATGATGAAGATACCCCA-3＇)和2p-r3(5′-GGCCGACTCAGGCCCAGGTCGCT-3＇)進行第一輪PCR，然后用引物Gal-p和2p-r4(5′-CTTCCTGCTTGAGCTCTCGGATG-3＇)進行第二輪。
對于人胎脾的Marathon cDNA(Clontech)，用引物2p-r5(5′-GTACACATCTGAGCCATGTTCCA-3＇)和引物AP1(由Clontech提供)進行第一輪PCR，然后用引物2p-r6(5＇-ACCTCCTTCGGGTGCTDTGCCT-3＇)和引物AP2(由Clontech提供)進行第二輪PCR。
PCR片段被亞克隆入pGEM-T Easy載體(Promega)中，用Southern印跡法進行挑選。為了避免因PCR而引入突變，對每種產(chǎn)物的至少3個獨立克隆進行測序。挑選出具有多數(shù)克隆共有序列的cDNA片段，構建出全長cDNA(SEQ ID NO:1)。
含有整個編碼區(qū)的cDNA(8-2884)亦通過PCR從人胎脾的Marathon cDNA(Clontech)中擴增出來。擴增出的片段可直接用于構建pFCreaml。所用酶為Pfu DNA多聚酶(Sangon)。引物為引物1:5＇CATGGCCTTGCTGGGTAAGCGCTGTGAC 3＇引物2:5＇CTAGTAATTAAGAGGTCCCGGGAGCTGC 3＇質粒構建(1)用于在哺乳動物細胞中表達FLAG-標記的Creaml的質粒。
為了表達全長的、帶有FLAG表位標記的Creaml蛋白，將NcoⅠ-ScaⅠ限制性片段(含核苷酸6-2893)，用Klenow酶填平末端后連入pCEP4F載體(Zhu，X.Mol.Cell.Biol.15,5017-5029(1995))的NheⅠ位點，從而構建出質粒pFCreaml(
圖12B)。
以類似方式，用含核苷酸762-2893的NcoⅠ-ScaⅠ限制性片段構建質粒pFAP32。該質粒表達FLAG-Ap32(含氨基酸253-959)。
用PCR法構建質粒pFAP32N。該質粒FLAG-Ap32N(含氨基酸253-897)。
(2)用于在大腸桿菌中表達FLAG-標記的Creaml的質粒。
為了在大腸桿菌中表達FLAG-Ap32，先將來自pFAP32的2.1kb的NcoⅠ-XhoⅠ限制性片段插入用相同限制性內切酶消化的pTrcHisA(Invitrogen)中。
為了表達全長FLAG-Creaml蛋白，將全長cDNA按閱讀框連入pTrcHisA(Invitrogen)，得到質粒pFLAP2(
圖12A)。
用PstⅠ切割pFLAP2，然后自我連接，形成質粒pFLCreamlp，該質粒表達FLAG-Creamlp(含氨基酸1-455)。
(3)用于酵母雙雜交分析的質粒將NcoⅠ-SacⅠ限制性片段(含核苷酸8-2887)，插入pAS2-1(Clontech)的NcoⅠ和SalⅠ位點(用Klenow酶填平)之間，以表達BD-Creaml(含氨基酸1-959)。
將PstⅠ片段缺失掉以表達BD-Creamlp(含氨基酸1-455)。
將cDNA克隆Ap-2的EcoRⅠ片段插入pY1(Sadowski,I.,Gene 118,137-141(1992))，以表達BD-Ap2(含氨基酸463-959)。
(4)用于在大腸桿菌中表達其他蛋白的質粒為了表達具有聚組氨酸標記的全長TFⅡ-Ⅰ(His6-TFⅡ-Ⅰ)，將來自pI3-CX的3.4kbNotⅠ(用綠豆核酸酶切割)-BamHⅠ片段，連入用NheⅠ和BamHⅠ切割并填平pTrcHisA(Invitrogen)中。通過限制性消化和Western印跡分析而鑒別出所需的構建物pHisⅡ-Ⅰ。
為了表達FLAG-E2F1(含氨基酸123-437)，將pGST-SH5(Shan B.等人，Mol.Cell.Biol.12,5620-5631(1992))的1.1kb BamHⅠ-EcoRⅠ片段連入用BglⅡ和XhoⅠ消化過的pFLAGl(IBI)。在連接前用Klenow酶填平EcoRⅠ和XhoⅠ末端。
為了表達FLAG-mitosin10N，將來自pMBP-10/H(Zhu,X.等人，Mol.Cell.Biol.15,5017-5029(1995))1.3kb的EcoRⅠ-HindⅢ限制性片段(用Klenow酶填平)克隆入pFLAG1的EcoRⅠ和SalⅡ位點之間(用Klenow酶填平)，得到質粒pF10N。
為了表達His6-p56Rb，用BamHⅠ和EcoRⅠ切割質粒pGEX-2T-RBS(Goodrich,D.W.等人，Biochim.Biophy.Acta 1155,43-61(1993))，該質粒表達有功能的56kDa形式的Rb蛋白。然后將cDNA片段如上插入pTrcHisA(Invitrogen)，得到質粒pTrcHisA-RBS。
抗體的產(chǎn)生將Ap-2的0.5kb的EcoRⅠ-AvaⅠ限制性片段(部分消化并用Klenow酶填平)，即核苷酸1394-1925，插入用PstⅠ和EcoRⅠ消化的pMAL-c載體(New England Biolabs)中。形成的質粒pMAL-P05被用于表達MBP融合蛋白MBP-P05。在用直鏈淀粉交聯(lián)的瓊脂糖珠(NewEngland Biolabs)進行親和純化后(方法參照廠家的說明)，用因子Xa(New EnglandBiolabs)切割融合蛋白。在12％SDS-PAGE后，將免疫原(P05)印跡在Western PVDF膜(Schleicher & Schuell)。將含免疫原的部分切下，按Knudsen,K.A.Anal Biochem.147,285-288(1985)所述的方法免疫兔子。
此外，按Smith,D.E.J.Cell.Biol.99,20-28(1984)所述的方法，用固定在Hybond-C膜(Amersham)上的MBP-P05，從血清中純化出特異性的抗體。
體外Rb-結合分析按Zhu,X.Mol.Cell.Biol.15,5017-5029(1995)所述的方法，用大腸桿菌BL21株為宿主，表達FLAG-標記或His-標記的融合蛋白。His6-p56Rb用TALON金屬親和樹脂(Clontech)純化(按照廠家提供的方法)，并用100mM EDTA(pH8.0)洗脫。對含F(xiàn)LAG-Creamlp、FLAG-Ap32、FLAG-mitosin10N和FLAG-E2F1的細胞裂解液進行8％SDS-PAGE,然后電印跡至Optitran BA-S膜(Schleicher & Schuell)?；景碨han,B.等人，Mol.Cell.Biol.12,5620-5631(1992)所述的方法，進行體外Rb結合分析。其中Rb夾心復合物的制備是通過將1微克His6-p56Rb、1微升抗-聚組氨酸單克隆抗體(Sigma)和1微升偶聯(lián)有堿性磷酸酶的羊抗鼠IgG(Promega)混入1毫升結合緩沖液。用CDP-Star化學熒光底物(Promega)顯色。
細胞培養(yǎng)和轉染將正常的猴腎細胞CV1、人胃癌細胞SGC-7901、人肺腺癌細胞SPC-A1和人卵巢癌細胞H0-8901，維持在補充有10％小牛血清的DMEM(Gibico)培養(yǎng)液中并處于含5％二氧化碳的空氣下。用常規(guī)的磷酸鈣法進行轉染。
共免疫沉淀、免疫印跡和間接免疫熒光研究將約2×107個用1∶1的pFCreaml和pCepRB(由Dr.W.-H.Lee提供)共轉染的CV1細胞，在1毫升緩沖液A(20mM Tris-HCl,pH 7.5,100mM KCl,0.1％Nonidet P40,1mM EDTA，1mM二硫蘇糖醇、10％甘油、50mM NaF和蛋白酶抑制劑)中裂解。離心去除細胞碎片之后，將一半裂解液與5微克抗-Rb單克隆抗體3C8(由Dr.W.-H.Lee提供)一起在4℃孵育過夜，而另一半裂解液與等量的抗-CD4單克隆抗體(Dako)一起孵育。將預先與10微克兔抗-鼠IgG(Anogen)孵育過的25微升A蛋白-Sepharose(Pharmacia)加入，放置2小時。用1毫升緩沖液B(20mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM KCl,0.5％Nonidet P40,1mM EDTA,1mM二硫蘇糖醇、10％甘油、50mM NaF和蛋白酶抑制劑)洗滌3次。對樣品進行8％SDS-PAGE并免疫印跡。
免疫印跡和間接免疫熒光(ⅡF)顯微檢測是用適當?shù)囊患壙贵w，按Zhu,X.等人，Mol.Cell.Biol.15,5017-5029(1995)所述的方式進行。酶偶聯(lián)的二級抗體購自Promega。偶聯(lián)有FITC的二級抗體購自Sino-America Biotechnology Company,Shanghai,China?？?FLAG M2和抗-聚組氨酸單克隆抗體分別購自Kodak和Sigma公司。在競爭性試驗中，將一級抗體與5微克MBP-P05或MBP孵育30分鐘，然后進行免疫印跡或ⅡF染色。ⅡF圖像用Olympus BX50熒光顯微鏡記錄在Kodak GoldⅢ(ASA400)膠片上。
酵母轉化和β-半乳糖苷酶活性分析按照廠商Clontech所建議的條件，用適當?shù)馁|粒通過乙酸鋰法轉染酵母Y190株(Clontech)。轉化子在缺乏色氨酸的合成培養(yǎng)基上進行篩選。對隨機挑選的克隆，用ONPG法測定β-半乳糖苷酶活性。數(shù)據(jù)如
圖10B所示。
結果分析Creaml是一種與TFⅡ-Ⅰ相關的新蛋白根據(jù)cDNA序列而推導出的氨基酸序列(SEQ ID NO:2和
圖1)表明，該新穎的多肽具有3段保守重復序列，每段重復序列有86個氨基酸。因此，該全長的蛋白被命名為Creaml(protein containing repetirive eighty-six amino-acid motif)。
因為Northern印跡分析表明，存在一普遍表達的約3kb的mRNA(數(shù)據(jù)未示出)，因此用32P-標記的Ap-2為探針來篩選成視網(wǎng)膜細胞瘤Y79 cDNA文庫。兩個最長的克隆S21(2.2kb)和S22(2.2kb)被進一步研究(
圖1A)。序列分析表明，克隆S21缺失了核苷酸1974-2018，但是不破壞閱讀框(數(shù)據(jù)未示出)，這可能是由于其他剪接方式所造成的。克隆S22在未知1406處缺失了一個“G”，這導致閱讀框移動。對其他cDNA文庫的進一步篩選沒有發(fā)現(xiàn)更長的片段。因此，用PCR對人胎盤cDNA庫(Clontech)進行擴增，其中一個引物對應于載體上的序列，而另一引物對應于S22的5＇端區(qū)域。
然而，最長的PCR產(chǎn)物(B18,0.6kb)仍缺少約200bp的某些編碼序列。因此，用人肽脾的Marathon cDNA(Clontech)作為模板進行第二輪PCR擴增，獲得了320bp的PCR片段(克隆A1)。拼接后得到SEQ ID NO:1所示的3043bp的核苷酸序列，其開放閱讀框位于8-2887，編碼959個氨基酸的Creaml蛋白(
圖1)。然后構建一cDNA克隆，其中核苷酸1-289來自克隆A1，核苷酸290-762來自克隆B18，核苷酸763-1239來自克隆S22，核苷酸1240-1522來自克隆S2l，其余核苷酸來自Ap-2。所有這些片段都加以測序以排除可能的序列變化。
以讀框兩側的序列為引物，用PCR也從胎脾Marathon cDNA(Clontech)中擴增出了同樣的cDNA。由于Creaml表達的廣泛性，該cDNA亦可通過常規(guī)的RT-PCR法從人的組織或細胞的mRNA中擴增出來。
本發(fā)明的Creaml與多功能轉錄調控因子TFⅡ-Ⅰ(也稱為BAP-1335或SPIN)有顯著的相似性(圖2)。首先，Creaml具有一組5個保守重復序列即Cr1-Cr5，這與TFⅡ-Ⅰ的6個重復序列(Tr1-Tr6)是相似的(圖2A和2B)。事實上，每個重復序列中的80個殘基區(qū)域在兩種蛋白之間是保守的(圖2B，下劃線部分)。
其次，Creaml的N端部分(氨基酸30-88，即Ccr1)與TFⅡ-Ⅰ對應的Tcr1(氨基酸22-80)是高度同源的(圖2A和2C)。Ccr1和Tcr1都含有在蛋白質-蛋白質作用所涉及的保守的疏水拉鏈樣基序(圖2C)(Roy,A.L.等人，EMBO.J.16,7091-7104(1997))。
此外，Creaml中從氨基酸499-510的Ccr2和從氨基酸527-532的Ccr3，也分別對應于TFⅡ-Ⅰ中從氨基酸801-812的Tcr2和從氨基酸224-229的Tcr3(圖2A和2C)。這些相似性表明，這兩種蛋白屬于同一個新的蛋白質家族。
然而，Creaml還具有其獨特的特征。其中包括在氨基酸912-923處有一端12個絲氨酸的片段，并且在898-905位有推定的核定位信號(NLS)(
圖1B)。該NLS與SV40的大T抗原的NLS相似。
有趣的是，編碼一種新的肌肉增強子-結合蛋白(MusTRD1)的cDNA(O＇Mahoney,J.V.等人，Mol.Cell.Biol.18,6641-6652(1998))，與Creaml cDNA基本相同。然而，MusTRD1僅長458氨基酸，因為在對應于Creaml cDNA的1307-1309位區(qū)域插入了一個額外的“G”而導致閱讀框移動。因此，MusTRD1僅含有Creaml的2個重復序列。根據(jù)對克隆S21、S22和其他已有EST的序列分析，沒有一種序列含有MusTRD1 CDNA所特有的“G”插入。因此，MusTRD1的這種差別可能是在肌肉中的一種特殊形式，也有可能是因為突變或人為因素所導致。
Creaml的基因結構和基因座還確定了Creaml的完整基因結構(圖2D)。結構基因Creaml被發(fā)現(xiàn)位于基因組克隆DJ0665P05(約133kb,Genbank登錄號AC004851)和DJ1186P10(約149kb,Genbank登錄號AC005231)中。這兩個克隆已經(jīng)幾乎被測序完畢并登錄于Genbank中。
Creaml位于4個獨立的毗連群中。該基因由位于至少150kb范圍內的27個外顯子構成(圖2D和表1)。外顯子2含第一個ATG，并且與外顯子3一起編碼疏水的拉鏈樣區(qū)域Ccr1。保守區(qū)域Ccr2和Ccr3的編碼序列分別位于外顯子13和14。此外，每個Creaml重復序列由3個相鄰外顯子編碼。例如，Cr1由外顯子4-6編碼；Cr2由外顯子8-10編碼；Cr3由外顯子16-18編碼；Cr4由外顯子20-22編碼；Cr5由外顯子23-25編碼。在每套3個外顯子中，中間一個外顯子的程度固定為184bp，除了外顯子24為193bp(圖2D，表1)。
本發(fā)明Creaml cDNA對應于人UniGene Hs.21075。其對應基因被定位于人染色體7q11.23(NIH網(wǎng)點http://www.ncbi.nlm.nih.gov于1998年公布的基因圖)。用于定位Creaml的序列標志位點(sts-AA019591)，部分位于外顯子26和27之間的內含子中并且部分延伸入外顯子27中。
重要的是，Creaml基因座位于LIM-激酶和xyntaxin 1A之間。由于這兩種基因在William綜合癥中經(jīng)常缺失(Frangi skakis,J.M.等人，Cell 86,59-69(1996)；Osborne，L.R.等人，Am.J.Hum.Genet.61,449-52(1997))，因此這表明Creaml在該疾病中也常缺失。因此，通過檢測Creaml基因的缺失與否，以及Creaml蛋白含量是否異常，可以檢測William綜合癥。
Creaml是一種普遍表達的120kDa蛋白質為了探究Creaml的生化性質，用細菌表達的Creaml多肽抗原(P05)(含氨基酸463-640)來制備兔多克隆抗體。先表達約70kDa麥芽糖結合蛋白融合物(MBP-P05)(圖3A，泳道1)。在用因子Xa處理后，MBP-P05被切成2部分單獨的MBP(約40kDa)和P05(圖3A，泳道2)。P05表現(xiàn)約為30和31kDa的雙聯(lián)體形式，這可能是由于降解或因子Xa在該蛋白上還有別的切割位點的緣故。因為cDNA插入片段并不破壞pMAL-c(New EnglandBiolabs)中LacZα基因的閱讀框，因此P05也含有一部分β-gal(約60個殘基)。如圖3所示，免疫前血清中檢測不到蛋白(泳道3)。免疫血清可特異性地識別P05雙聯(lián)體和微量的完整MBP-P05分子，但是不識別MBP盡管其豐度很高(泳道4)。
因為P05含有與TFⅡ-Ⅰ同源的第三重復序列和2個額外區(qū)域(
圖1和2)，因此對抗體進行測試以確定是否與TFⅡ-Ⅰ交叉反應。如圖3B所示，在總細菌裂解液中，無論用抗-Creaml多克隆抗體T8(泳道1)還是用抗-FLAG M2單克隆抗體(泳道5)檢測，Creaml突變體FLAG-Ap32都可作約為90kDa的片段被特異地檢測出。然而，這兩種抗體都不識別全長的聚組氨酸標記的TFⅡ-Ⅰ(His6-TFⅡ-Ⅰ)(泳道2和6)。相反，抗-組氨酸單克隆抗體可檢測出120kDa的TFⅡ-Ⅰ(泳道4)。這些結果表明，抗-Creaml多克隆抗體T8是高度特異的。
然后用T8抗體來檢測非洲綠猴CV1細胞中的內源性Creaml(圖4)。該抗體可特異地識別細菌裂解液中的MBP-P05(圖4A，泳道1)和CV1總細胞裂解液中的約120kDa的蛋白(泳道2)。為了測試該120kDa的蛋白是Creaml，將抗體與pMAL-c載體表達的MBP或MBP-P05一起預孵育。被MBP-P05所中和后的抗體不能檢測MBP-P05(泳道3)，也不能檢測出120kDa的蛋白(泳道4)。而與MBP一起預孵育對抗體卻無影響(泳道5和6)。因此，這些結果表明在CV1細胞中的Creaml在SDS-PAGE中以120kDa蛋白形式遷移。此外，同一蛋白還在各種不同的人細胞系和組織中被檢測到，其中包括胚胎腎細胞HEK293、胃癌SGC-7901、肺癌SPC-A1、卵巢癌HO-8901、胎兒和成人骨骼肌、心臟、和胎腦(數(shù)據(jù)未示出)。通常，該蛋白在所測試樣品中的水平都很低。
為了測試Creaml cDNA是否含有完整的閱讀框，將細胞中的Creaml與大腸桿菌中表達的FLAG-標記的全長Creaml(FLAG-Creaml)的遷移率進行比較(圖4)。結果表明，兩者遷移率相近，而且FLAG-Creaml(泳道2)遷移比CV1細胞中內源Creaml(泳道1)稍慢(因為存在FLAG標記)。這證實了SEQ ID NO:1所示的cDNA含有了完整的Creaml編碼序列。
Creaml在體內和體外都結合于Rb蛋白分離的Creaml是一種候選的Rb-結合蛋白，最初被命名為Rbap2(Rb-associatedprotein 2,Rb相關蛋白2)。為了證實篩選結果，測試其與Rb相互作用。
為了方便起見，用親和純化的聚組氨酸-標記的Rb(His6-p56Rb)來制備“Rb夾心”(圖5A)。含mitosin蛋白氨基酸2484-2927的FLAG-mitosin10N(圖5B，泳道1)被作為陰性對照(圖5C，泳道1)。FLAG-E2F1(含殘基123-437)(圖5B，泳道3)被用作陽性對照(圖5C，泳道3)。測試了Creaml的兩種重迭缺失變異體FLAG-Creamlp和FLAG-Ap32(圖5D)。FLAG-Ap32可明顯與Rb探針作用(圖5C，泳道2)。FLAG-Creamlp(圖5B，泳道4)卻是陰性(圖5C，泳道4)。因為克隆Ap2所編碼的多肽包括氨基酸463-959，因此這些結果表明，在體外Rb可特異性地與Creaml的C末端部分發(fā)生作用。
體內試驗。由于內源Creaml的水平低，因此將FLAG-Creaml和Rb在CV1細胞中共表達，以提高這兩種蛋白質的局部濃度。用ⅡF染色法檢測FLAG-Creaml的表達。當共表達細胞的裂解液用抗-Rb單克隆抗體進行共沉淀后(圖ll，泳道1)，可用抗-FLAGl單克隆抗體M2在多個試驗中輕易地檢測出FLAG-Creaml(泳道3)。與之相反，對照抗體(抗-CD4單克隆抗體)不能使Rb(泳道2)或Creaml(泳道4)沉淀。
這表明，Creaml可在體內結合于Rb。我們還進一步證明Creaml亦能與Rb在體內結合(
圖11)。為增加細胞內的蛋白濃度，我們利用共轉染的辦法在細胞內表達了Rb和Creaml?？筊b抗體不僅能沉淀Rb蛋白(泳道1)，還使Creaml也隨之沉淀下來(泳道3)；作為對照的抗CD4抗體則不沉淀Rb或Creaml。這說明Creaml確為Rb在細胞內的結合蛋白之一。
Creaml的NLS與SV40大T抗原的NLS相似作為潛在的轉錄調控因子，Creaml應是一種核蛋白。根據(jù)氨基酸序列分析，Creaml含有一個與SV40大T抗原的NLS相似的NLS(
圖1B)。將表達FLAG-Ap32和FLAG-Ap32N的質粒分別轉入CV1細胞。在轉染后48小時，用冷甲醇固定細胞，然后用抗-FLAG抗體M2(泳道1、3、5)和兔抗-Creaml抗體T8(泳道2、4、6)進行雙重ⅡF染色。
結果如圖7所示。FLAG-Ap32表現(xiàn)出典型的核定位情況(泳道1用抗-FLAG抗體顯色；和泳道2用抗-Creaml抗體顯色)。為了排除標記過程中抗體間可能的交叉反應，將MBP-P05加至一級抗體混合物中以限選擇性地中和抗-Creaml抗體。這種處理導致用抗-Creaml抗體標記明顯下降(泳道3)，但卻不影響抗-FLAG抗體的標記(泳道4)。這表明，這兩種抗體獨立地識別各自的表位。
當用全長FLAG-Creaml表達時，也觀察到了核定位現(xiàn)象。此外，當推定的NLS被缺失掉時，相應的變異蛋白FLAG-Ap32N(圖7A)就成為細胞質類型的蛋白(圖7B，泳道5和6)，這表明，Creaml的確使用NLS序列。
Creaml具有內在的激活活性為了測試Creaml是否含有激活結合域，將Creaml的不同部分與Gal4的DNA結合域(BD)融合，然后檢測所形成的融合蛋白在酵母中的反式激活作用。酵母株Y190含有處于Gal4-應答型啟動子控制下的β-半乳糖苷酶報道基因。結果如圖8所示，用β-半乳糖苷酶活性測定表明，在Y190中表達BD-Creaml可有力地殘基報道基因的轉錄。含Creaml的氨基酸1-455的BD-Creamlp仍然具有活性。相反，含氨基酸463-959的融合蛋白(即BD-Ap2)僅表現(xiàn)出比背景稍高的轉錄活性。因此，激活結構域似乎位于Creaml的N端部分。
Creaml的潛在功能由于Creaml在多種不同的細胞系和組織中普遍表達，而且其結構與TFⅡ-Ⅰ很相似，因此這表明Creaml是一種作用廣泛的轉錄調控物，很可能是一種新的介導某些無TATA啟動子轉錄的結合Inr的因子。
另一方面，Creaml和TFⅡ-Ⅰ的功能是由不同的機理調控的。TFⅡ-可結合于btk(一種src超家族的B細胞特異性胞質酪氨酸激酶)(Yang,W.美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94,604-609(1997))。一旦B細胞抗原受體介入，TFⅡ-Ⅰ就會在酪氨酸殘基上發(fā)生磷酸化。此外，TFⅡ-Ⅰ對c-fos啟動子的刺激作用取決于ras-信號傳導途徑(Kim,D.W.,Mol.Cell.Biol.18,3310-3320(1998))。而且TFⅡ-Ⅰ的src自我磷酸化位點對于Vβ啟動子的TFⅡ-Ⅰ依賴性轉錄激活是至關重要的(NoVina,C.D.J.Biol.Chem.273,33443-33448(1998))。
然而，Creaml明顯缺乏src磷酸化位點，而且它也不與btk反應(數(shù)據(jù)未示出)。然而，它可以被MAP激酶通過潛在的磷酸化位點調控(
圖1)。此外，數(shù)據(jù)表明Creaml可以通過與Rb的締合而被調控。根據(jù)其廣泛的表達譜，Creaml可能是一種在細胞周期進程中涉及的廣泛的轉錄調控因子。此外，因為Rb對于骨骼肌的最終分化很關鍵，因此，Creaml可能在肌肉分化中也在Rb控制下發(fā)揮作用。
William綜合癥是一種先天性疾病，特征是小精靈樣面容和精神發(fā)育遲緩，并常伴有心血管和肌肉骨骼缺陷。染色體7q11.23的半合子狀態(tài)是該病的致病原因(Ewart,A.K.等人，Nat.Genet.5,11-16(1993))。常見的缺失斷裂點位于彈性蛋白基因兩側約lcM處。目前為止，已發(fā)現(xiàn)一些基因在William病的主要人群中呈半合子狀態(tài)。其中包括彈性蛋白基因、LIM-激酶、復制因子C、syntaxin 1A、TFⅡ-Ⅰ、Wscrl和Fkbp6等。盡管高濃度的LIM-激酶(一種主要在腦中表達的蛋白激酶)似乎對于該疾病是至關重要的，但是其余基因對該綜合癥的病理也有作用。
重要的是，Creaml基因座位于LIM-激酶和xyntaxin 1A之間。由于這兩種基因在William綜合癥中經(jīng)常缺失，因此這表明Creaml在該疾病中也常缺失。進一步研究表明，在William綜合癥病人中，的確有一個拷貝的Creaml基因存在缺失。因此，通過檢測Creaml基因的缺失與否，以及Creaml蛋白活性或功能是否異常，可以檢測William綜合癥。
由于Creaml在腦中表達(數(shù)據(jù)未給出)，因此其含量下降可能會影響對神經(jīng)發(fā)育至關重要的其他蛋白。此外，研究還表明Creaml的半合狀態(tài)與William綜合癥相關的某些心血管和骨骼肌肉異常也存在關聯(lián)性。
本發(fā)明的人Creaml除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人Creaml還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人Creaml的C端與其他物種的Creaml的C端進行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人Creaml的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化結合蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人Creaml核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人Creaml的表達水平或者抑制人Creaml的過度表達。本發(fā)明的人Creaml蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人Creaml缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱新的成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白結合蛋白及其制法和用途(ⅲ)序列數(shù)目2(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度3043bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.1ggcgaccatg gccttgctgg gtaagcgctg tgacgtcccc accaacggct gcggacccga 60ccgctggaac tccgcgttca cccgcaaaga cgagatcatc accagcctcg tgtctgcctt 120agactccatg tgctcagcgc tgtccaaact gaacgccgag gtggcctgtg tcgccgtgca 180cgatgagagc gcctttgtgg tgggcacaga gaaggggaga atgttcctga atgcccggaa 240ggagctacag tcagacttcc tcaggttctg ccgagggccc ccgtggaagg atccggaggc 300agagcacccc aagaaggtgc agcggggcga gggtggaggc cgtagcctcc ctcggtcctc 360cctggaacat ggctcagatg tgtaccttct gcggaagatg gtagaggagg tgtttgatgt 420tctttatagc gaggccctgg gaagggccag tgtggtgcca ctgccctatg agaggctgct 480cagggagcca gggctgctgg ccgtgcaggg gctgcccgag ggcctggcct tccgaaggcc 540agccgagtat gaccccaagg ccctcatggc catcctggaa cacagccacc gcatccgctt 600caagctcaag aggccacttg aggatggcgg gcgggactcg aaggccctgg tggagctgaa 660tggtgtctcc ctgattccca aggggtcacg ggactgtggc ctgcatggcc aggcccccaa 720ggtgccaccc caggacctgc ccccaaccgc cacctcctcc tccatggcca gcttcctgta 780cagcacggcg ctccccaacc acgccatccg agagctcaag caggaagCAC CTTCCTGCCC 840CCTTGCCCCC AGCGACCTGG GCCTGAGTCG GCCCATGCCA GAGCCCAAGG CCACCGGTGC 900CCAAGACTTC TCCGACTGTT GTGGACAGAA GCCCACTGGG CCTGGTGGGC CTCTCATCCA 960GAACGTCCAT GCCTCCAAGC GCATTCTCTT CTCCATCGTC CATGACAAGT CAGAGAAGTG 1020GGACGCCTTC ATAAAGGAAA CCGAGGACAT CAACACGCTC CGGGAGTGTG TGCAGATCCT 1080GTTTAACAGC AGATATGCGG AAGCCCTGGG CCTGGACCAC ATGGTCCCCG TGCCCTACCA 1140GAAGATTGCC TGTGACCCGG AGGCTGTGGA GATCGTGGGC ATCCCGGACA AGATCCCCTT 1200CAAGCGCCCC TGCACTTATG GAGTCCCCAA GCTGAAGCGG ATCCTGGAGG AGCGCCATAG 1260TATCCACTTC ATCATTAAGA GGATGTTTGA TGAGCGAATT TTCACAGGGA ACAAGTTTAC 1320CAAAGACACC ACGAAGCTGG AGCCAGCCAG CCCGCCAGAG GACACCTCTG CAGAGGTCTC 1380TAGGGCCACC GTCCTTGACC TTGCTGGGAA TGCTCGGTCA GACAAGGGCA GCATGTCTGA 1440AGACTGTGGG CCAGGAACCT CCGGGGAGCT GGGCGGGCTG AGGCCGATCA AAATTGAGCC 1500AGAGGATCTG GACATCATTC AGGTCACCGT CCCAGACCCC TCGCCAACCT CTGAGGAAAT 1560GACAGACTCG ATGCCTGGGC ACCTGCCATC GGAGGATTCT GGTTATGGGA TGGAGATGCT 1620GACAGACAAA GGTCTGAGTG AGGACGCGCG GCCCGAGGAG AGGCCCGTGG AGGACAGCCA 1680CGGTGACGTG ATCCGGCCCC TGCGGAAGCA GGTGGAGCTG CTCTTCAACA CACGATACGC 1740CAAGGCCATT GGCATCTCGG AGCCCGTCAA GGTGCCGTAC TCCAAGTTTC TGATGCACCC 1800GGAGGAGCTG TTTGTGGTGG GACTGCCTGA AGGCATCTCC CTCCGCAGGC CCAACTGCTT 1860CGGGATCGCC AAGCTCCGGA AGATTCTGGA GGCCAGCAAC AGCATCCAGT TTGTCATCAA 1920GAGGCCCGAG CTGCTCACTG AGGGAGTCAA AGAGCCCATC GTGGATAGTC AAGGAACTGC 1980CTCCTCACTT GGCTTCTCTC CCCCTGCCCT GCCCCCAGAG AGGGATTCCG GGGACCCTCT 2040GGTGGACGAG AGCCTGAAGA GACAGGGCTT TCAAGAAAAT TATGACGCGA GGCTCTCACG 2100GATCGACATC GCCAACACAC TAAGGGAGCA GGTCCAGGAC CTTTTCAATA AGAAATACGG 2160GGAAGCCTTG GGCATCAAGT ACCCGGTCCA GGTCCCCTAC AAGCGGATCA AGAGTAACCC 2220CGGCTCCGTG ATCATCGAGG GGCTGCCCCC AGGAATCCCG TTCCGAAAGC CCTGTACCTT 2280CGGCTCCCAG AACCTGGAGA GGATTCTTGC TGTGGCTGAC AAGATCAAGT TCACAGTCAC 2340CAGGCCTTTC CAAGGACTCA TCCCAAAGCC TGATGAAGAT GACGCCAACA GACTCGGGGA 2400GAAGGTGATC CTGCGGGAGC AGGTGAAGGA ACTCTTCAAC GAGAAATACG GTGAGGCCCT 2460GGGCCTGAAC CGGCCGGTGC TGGTCCCTTA TAAACTAATC CGGGACAGCC CAGACGCCGT 2520GGAGGTCACG GGTCTGCCTG ATGACATCCC CTTCCGGAAC CCCAACACGT ACGACATCCA 2580CCGGCTGGAG AAGATCCTGA AGGCCCGAGA GCATGTCCGC ATGGTCATCA TTAACCAGCT 2640CCAACCCTTT GCAGAAATCT GCAATGATGC CAAGGTGCCA GCCAAAGACA GCAGCATTCC 2700CAAGCGCAAG AGAAAGCGGG TCTCGGAAGG AAATTCCGTC TCCTCTTCCT CCTCGTCTTC 2760CTCTTCCTCG TCCTCTAACC CGGATTCAGT GGCATCGGCC AACCAGATCT CACTCGTGCA 2820ATGGCCAATG TACATGGTGG ACTATGCCGG CCTGAACGTG CAGCTCCCGG GACCTCTTAA 2880TTACTAGACC TCAGTACTGA ATCAGGACCT CACTCAGAAA GACTAAAGGA AATGTAATTT 2940ATGTACAAAA TGTATATTCG GATATGTATC GATGCCTTTT AGTTTTTCCA ATGATTTTTA 3000CACTATATTC CTGCCACCAA GGCCTTTTTA AATAAGTAAA AAA 3043(2)SEQ ID NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度959個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.2MALLGKRCDV PTNGCGPDRW NSAFTRKDEI ITSLVSALDS MCSALSKLNA EVACVAVHDE 60SAFVVGTEKG RMFLNARKEL QSDFLRFCRG PPWKDPEAEH PKKVQRGEGG GRSLPRSSLE 120HGSDVYLLRK MVEEYFDVLY SEALGRASVV PLPYERLLRE PGLLAVQGLP EGLAFRRPAE 180YDPKALMAIL EHSHRIRFKL KRPLEDGGRD SKALVELNGV SLIPKGSRDC GLHGQAPKVP 240PQDLPPTATS SSMASFLYST ALPNHAIREL KQEAPSCPLA PSDLGLSRPM PEPKATGAQD 300FSDCCGQKPT GPGGPLIQNV HASKRILFSI VHDKSEKWDA FIKETEDINT LRECVQILFN 360SRYAEALGLD HMVPVPYQKI ACDPEAVEIV GIPDKIPFKR PCTYGVPKLK RILEERHSIH 420FIIKRMFDER IFTGNKFTKD TTKLEPASPP EDTSAEVSRA TVLDLAGNAR SDKGSMSEDC 480GPGTSGELGG LRPIKIEPED LDIIQVTVPD PSPTSEEMTD SMPGHLPSED SGYGMEMLTD 540KGLSEDARPE ERPVEDSHGD VIRPLRKQVE LLFNTRYAKA IGISEPVKYP YSKFLMHPEE 600LFVVGLPEGI SLRRPNCFGI AKLRKILEAS NSIQFVIKRP ELLTEGVKEP IVDSQGTASS 660LGFSPPALPP ERDSGDPLVD ESLKRQGFQE NYDARLSRID IANTLREQVQ DLFNKKYGEA 720LGIKYPVQVP YKRIKSNPGS VIIEGLPPGI PFRKPCTFGS QNLERILAVA DKIKFTVTRP 780FQGLIPKPDE DDANRLGEKV ILREQVKELF NEKYGEALGL NRPVLVPYKL IRDSPDAVEV 840TGLPDDIPFR NPNTYDIHRL EKILKAREHV RMVIINQLQP FAEICNDAKV PAKDSSIPKR 900KRKRVSEGNS VSSSSSSSSS SSSNPDSVAS ANQISLVQWP MYMVDYAGLN VQLPGPLNY 959
權利要求
1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人Creaml蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸8-2887位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸8-2887位的核苷酸序列雜交。
2．如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3．如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.1中從核苷酸8-2887位的核苷酸序列，或SEQ ID NO.1中從核苷酸1-3043位的核苷酸序列。
4．一種分離的人Creaml蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5．如權利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽選自下組具有SEQ ID NO.2序列的多肽，具有SEQ ID NO:2中氨基酸253-959的多肽，具有SEQ ID NO:2中氨基酸253-897的多肽，具有SEQ ID NO:2中氨基酸1-455的多肽，或具有SEQID NO:2中氨基酸463-959的多肽。
6．一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA。
7．一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8．一種產(chǎn)生具有人Creaml蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人Creaml蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人Creaml蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸8-2887位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人Creaml蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人Creaml蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人Creaml蛋白活性的多肽。
9．一種能與權利要求4所述的人Creaml蛋白多肽特異性結合的抗體。
10．一種探針分子，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
11.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列,它是編碼Creaml(protein containing repetitive eighty－six amino－acid motif)的cDNA序列,該基因編碼產(chǎn)物是一種新的轉錄調控因子,也是成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白(Rb蛋白)的結合蛋白。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號C12N15/63GK1303861SQ0011142
公開日2001年7月18日 申請日期2000年1月7日 優(yōu)先權日2000年1月7日
發(fā)明者朱學良, 鄢秀敏, 錢敏 申請人:中國科學院上海細胞生物學研究所