專利名稱：用于感染性疾病乙肝病毒、梅毒螺旋體、愛滋病毒和丙肝病毒診斷的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因芯片，尤其涉及一種感染性疾病診斷的基因芯片。
基因芯片是二十世紀(jì)九十年代發(fā)展起來的一項前沿生物技術(shù)。將大量的靶基因片段有序地、高密度地(點與點之間的距離一般小于500μm)排列在玻璃、硅等載體上，稱之為基因芯片?；蛐酒瑥闹谱魃峡煞譃閮纱箢愒缓铣煞?DNAchip)和微矩陣法(DNA mircoarray)，原位合成法由Affymetrix公司的Fodor等發(fā)明，他們將半導(dǎo)體中的光蝕刻技術(shù)運用到DNA合成化學(xué)中，用單核苷酸或其它生物大分子為底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，每次循環(huán)都有特定的核苷酸結(jié)合上去，直到設(shè)定的寡核苷酸長度，每個寡核苷酸片段代表了一種特定的基因，存在于DNA芯片的特定位置上。微矩陣法最早由Stanford大學(xué)的P.Brown等發(fā)明，將PCR等方法得到的cDNA用針點或噴點的方法直接排列到玻片等介質(zhì)上，從而制備成芯片。
基因芯片可以用熒光檢測和計算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較和分析，以達(dá)到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。
基因芯片的概念可追溯到southernblot雜交技術(shù)，即DNA-DNA之間通過堿基配對機(jī)制形成互補(bǔ)鏈。隨后又發(fā)展出northernblot雜交和點雜交技術(shù)。這三種技術(shù)都是將核酸樣品固定在濾膜上，樣品容易擴(kuò)散，因此在單位面積上點樣的密度受到限制，無法進(jìn)行大規(guī)模、高通量的DNA雜交。同時，由于濾膜面積較大而需較多探針量，檢測靈敏度較低。為了提高點樣密度和檢測靈敏度，降低探針用量，以玻璃、硅等材料為載體的基因芯片技術(shù)逐步得到了發(fā)展。
美國affymetrix公司于二十世紀(jì)八十年代末至90年代初，率先開展了這方面的研究。1992年，該公司運用半導(dǎo)體照相平板技術(shù)，在1cm2左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，誕生了世界上第一塊基因芯片。同時，探針的熒光標(biāo)記，激光共聚焦掃描和計算機(jī)分析等技術(shù)也隨之發(fā)展。1995年，第一塊以玻璃為載體的基因芯片(微矩陣)在美國Stanford大學(xué)誕生，這標(biāo)志著基因芯片技術(shù)步入了廣泛研究和應(yīng)用的時期。
原位合成寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等優(yōu)點，適用于DNA序列測定、SNP分析等。但其缺點是合成寡聚核苷酸長度有限，因而基因特異性差，而且隨長度的增加合成錯誤率隨之增高，作為基因表達(dá)譜研究遠(yuǎn)不如cDNA芯片。cDNA芯片是將微量cDNA片段在玻璃等載體上按矩陣密集排列并固化，也叫微矩陣(Microarray)。基因點樣密度雖不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用傳統(tǒng)載體，如混合纖維素濾膜或尼龍膜的點樣密度要高得多，可達(dá)到每張載玻片4萬個基因。而cDNA芯片最大的優(yōu)點是靶基因檢測特異性非常好，用作表達(dá)譜研究結(jié)果可靠。目前許多國家實驗室和大制藥公司都用此類芯片。
基因芯片最早是由于高通量、大規(guī)模研究基因功能的需求而產(chǎn)生的，但隨著基因芯片技術(shù)的日漸成熟，人們驚喜地發(fā)現(xiàn)基因芯片在傳染性疾病和遺傳病的診斷上有獨特的應(yīng)用前景和巨大的商業(yè)市場。感染性病原體診斷芯片就是將待測病原體的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成芯片，將從病人血清中抽提出病原體的DNA或RNA經(jīng)擴(kuò)增標(biāo)記螢光后與芯片進(jìn)行雜交，雜交信號由掃描儀掃描，再經(jīng)計算機(jī)分析，判斷陰陽性。診斷芯片區(qū)別于其他檢測手段的優(yōu)越性在于(1)檢測樣品為各類致病基因片段，提高了檢測效率；(2)因無需機(jī)體免疫反應(yīng)，能及早診斷，且待測樣品用量較少；(3)診斷芯片技術(shù)是DNA雜交技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的分子診斷方法，有極高的靈敏度、特異性和可靠性；(4)自動化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
在疾病診斷方面，已有一些單一疾病基因診斷芯片產(chǎn)品上市，例如美國的Affymetrix公司已利用基因芯片進(jìn)行愛滋病(HIV)的研究工作，并有商業(yè)化的GeneChipHIVPRT診斷芯片上市，用于愛滋病的早期診斷。
但芯片技術(shù)在疾病診斷上的應(yīng)用尚處于起步階段，還未大面積推廣，原因主要有(1)基因芯片技術(shù)是一項全新的技術(shù)，對人才、技術(shù)、資金的要求很高，目前只有一小部分的科研機(jī)構(gòu)和高科技公司完全掌握了該項技術(shù)。
(2)現(xiàn)有芯片通常只能診斷一種疾病，芯片檢測成本較貴，目前很難取代常規(guī)檢測方法。
(3)芯片技術(shù)，特別是在多疾病檢測的質(zhì)量保證和檢測監(jiān)控方面有待于發(fā)展和創(chuàng)新。多疾病診斷芯片是一種多基因的反應(yīng)系統(tǒng)，因此對傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增引物設(shè)計在檢出率方面提出了更高的要求；由于多疾病診斷芯片反應(yīng)系統(tǒng)的復(fù)雜化，對反應(yīng)結(jié)果的檢測監(jiān)控也提出了新的技術(shù)要求。
在威脅人類健康的各種疾病中，感染性疾病一直占有重要位置。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)99年報告，98年全球共計5390萬人死亡，其中死于感染性疾病計1300萬人，占總?cè)藬?shù)的25％，相當(dāng)于平均每小時就有1500人死于該類疾病，僅次于死于心血管疾病的31％，遠(yuǎn)高于死于癌癥的13％。這1300萬人中有50％發(fā)生在發(fā)展中國家。各種肝炎一直是威脅人類生命健康的常見病、多發(fā)病。近年來，愛滋病和各種性病的傳播也呈快速增長的態(tài)勢。
尤其是血站的血液檢測，乙型肝炎、丙型肝炎、愛滋病、梅毒四種感染性疾病是血液檢測的常規(guī)項目，但現(xiàn)有的檢測手段無法在同一時間內(nèi)通過一次實驗確診上述四種疾病，檢測成本高而效率比較低。為此，開發(fā)研究一種用于多種感染性疾病診斷的基因芯片，對多種感染性疾病的進(jìn)行準(zhǔn)確、高效的早期診斷已成為當(dāng)務(wù)之急。
本發(fā)明的目的之一在于提供一種在一塊芯片上同時固定多種疾病基因，能夠同時檢測HBV、TP、HIV和HCV四種感染性疾病的，并具有多疾病的質(zhì)量保證和檢測監(jiān)控體系的基因芯片；本發(fā)明的目的之二在于公開四組與上述四種感染性病毒基因組序列的保守區(qū)相對應(yīng)的高檢出率的新引物。
發(fā)明的構(gòu)思是這樣的(1)本發(fā)明在一塊芯片上同時固定多種疾病基因，包括但不限于HBV、TP、HIV和HCV的基因片段，只用5-100μl血清，就可以在一天內(nèi)及時準(zhǔn)確地確認(rèn)被檢者是否患有上述四種感染性疾病、患何種病，既提高了效率，也降低了成本，在診斷實踐上也大有益處；(2)多疾病診斷基因芯片涉及多種復(fù)雜的物理過程和生物化學(xué)反應(yīng)，如點樣，RNA和DNA模板的制備、PCR擴(kuò)增、熒光標(biāo)記、雜交、洗滌、檢測等過程，以及在各步驟中可能的污染，本發(fā)明在芯片上配備相應(yīng)的質(zhì)量保證和檢測監(jiān)控體系，該質(zhì)量保證和檢測監(jiān)控體系采用陰陽對照的方法進(jìn)行監(jiān)測，以確保檢測的準(zhǔn)確性，減少誤差；(3)各種感染性疾病如乙型肝炎、丙型肝炎、愛滋病、梅毒等，同一種疾病又具有不同的亞型。對于多疾病診斷基因芯片而言，需要對各種亞型的感染情況都能概括地檢測出結(jié)果。因此，我們將各種感染性疾病的具有代表性的保守區(qū)片段作為靶基因固定在基因芯片上時，由于多疾病診斷基因芯片是一個多對引物PCR反應(yīng)系統(tǒng)，需要高檢出率的用于RNA、DNA模板擴(kuò)增的PCR引物。我們?yōu)榇烁鶕?jù)同種病毒不同亞型之間保守序列的同源性，通過計算機(jī)分析和實驗篩選，設(shè)計出用于診斷基因芯片的適合各種亞型擴(kuò)增的高檢出率的新引物。
本發(fā)明亦是這樣實現(xiàn)的所說的基因芯片包括兩個系統(tǒng)，第一部分為檢測監(jiān)控系統(tǒng)，第二部分為疾病診斷系統(tǒng)。
檢測監(jiān)控系統(tǒng)至少包括四個對照元素，分別為1．點樣液，為陰性對照(1)，若雜交后檢測無信號，表明正常；若有雜交信號，表明點樣液有污染；2．植物基因a，為陰性對照(2)，若雜交后檢測無信號，表明正常；若有雜交信號表明系統(tǒng)有污染；1或2其中之一出現(xiàn)雜交信號，該芯片不能使用；3．植物基因b，為陽性對照(1)，該植物基因的RNA在抽提血RNA時按一定的比例加入到待檢的血清樣品中，并隨著實驗流程進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。若雜交后該樣品有雜交信號為正常；若無雜交信號，表明RNA抽提過程有問題或逆轉(zhuǎn)錄不正常；4．植物基因c，為陽性對照(2)，該植物基因DNA在PCR擴(kuò)增摻入熒光底物時按一定的比例加入到逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物中，以檢測熒光底物的摻入效率。若雜交后該樣品有雜交信號為正常；若無雜交信號，表明標(biāo)記效果不理想。
所說的點樣液為一種包含離子多聚物的緩沖液，可以采用美國Telechem公司生產(chǎn)的、商品名為Micro-Spotting Solution的點樣液；所說的植物基因a的基因序列如下述的植物基因a Sequence a所示植物基因a Sequence aArabidopsis thaliana(擬南芥)SUPERMAN(sup)geneAATTGCCAACAGGATCATGATTATCTTCTAGGGTTTTCATGGCCACCAAGATCCTACACTTGCAGCTTCTGCAAAAGGGAATTCAGATCGGCTCAAGCACTTGGTGGCCACATGAATGTTCACAGAAGAGACAGAGCAAGACTCAGATTACAACAGTCTCCATCATCATCTTCAACACCTTCTCCTCCTTACCCTAA-CCCTAATTACTCTTACTCAACCATGGCAAACTCTCCTCCTCCTCATCATTCTCCTCTAACCCTATTTCCAACCCTTTCTCCTCCATCCTCACCAAGATATAGGGCAGGTTTGATCCGTTCCTTGAGCCCCAAGTCAAAACATACACCAGAAAACGCTTGTAAGACTAAGAAATCATCTCTTTTAGTGGAGGCTGGAGAGGCTACAAGGTTCACCAGTAAAGATGCTTGCAAGATCCTGAGGAATGATGAAATCATCAGCTTGGAGCTTGAGATTGGTTTGATTAACGAATCAGAGCAAGATCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAATTAGATGGTAATAACTTTATCCATAAAGGATTCG--AAGTTCACAATTCTAGAAGATATGATGCTTCTCTAAGGTTAATTAGTTTCATCCATATGAAATTCTCTAAGCTTGCTATTTAGTAGAACG該植物基因a可通過對擬南芥SUPERMAN(sup)gene克隆獲得，此為已有技術(shù)。
所說的植物基因b的基因序列如下述的植物基因b Sequence b所示植物基因b Sequence b(陰影部分為其PCR擴(kuò)增引物序列)水稻Usn 5sRNA gene AGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGAGCGAGCTCAATGGCTACAGGACCAACCTTATCAAAGAGAGCATCAGAATGGGTTACAATGACATTGGTGANGGCTTCTATGCTCATGGCCACCTTTCAGATGCCTTCAAAAGCTACATCCGTACACGTGATTATTGTACCACTTCCAAGCATATAGTTCAGATGTGTATGAATGTGATTCT 該植物基因b可通過對水稻Usn 5sRNA gene克隆獲得，此為已有技術(shù)。
所說的植物基因c的基因序列如下述的植物基因c Sequence c所示植物基因c Sequence c(陰影部分為其PCR擴(kuò)增引物序列)水稻Usn 5sRNA gene ACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATNNCGTCGACCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTACTAAGAGTTACTATGCATCACAGTACCAGCTCTAAGCATTTATATTTTAAAAAATAGCTTGGCCTCAAATGTGACAGATCGTTCTGTCAAGTCTCTAGATGCTTAAATATCCAGAGCTGTTTACACAGCATCATATTTAAAACCACA
該植物基因c可通過對水稻Usn 5sRNA gene克隆獲得，此為已有技術(shù)。
疾病診斷系統(tǒng)至少將四種感染性疾病病原體的保守區(qū)中的兩種作為靶基因固定在芯片上，具體如下HBV病毒靶基因選自HBV病毒的保守區(qū)，共設(shè)計了2個保守區(qū)段。若其中一個雜交有信號，即表明該血清樣品含有HBV病毒，為陽性血清；若2個均沒有雜交信號，則為陰性血清；梅毒螺旋體TP病毒靶基因選自TP病毒的保守區(qū)，共設(shè)計了4個保守區(qū)段。若其中一個雜交有信號，即表明該血清樣品含有TP病毒，為陽性血清；若4個均沒有雜交信號，則為陰性血清；HIV病毒靶基因選自HIV病毒的保守區(qū)，共設(shè)計了4個保守區(qū)段。若其中一個雜交有信號，即表明該血清樣品含有HIV病毒，為陽性血清；若4個均沒有雜交信號，則為陰性血清；HCV病毒靶基因選自HCV病毒的保守區(qū)，共設(shè)計了4個保守區(qū)段。若其中一個雜交有信號，即表明該血清樣品含有HCV病毒，為陽性血清；若4個均沒有雜交信號，則為陰性血清；所說的HBV、TP、HIV、HCV病毒保守區(qū)靶基因為已有公開技術(shù)，其基因序列如下HBV保守區(qū)HBV sequence 1250 TCTAGATACCGCCTCAGCTCTATATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTTAGTTATGTTAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAAATCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACAGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCAC 543HBV sequence233 CTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCG 211TP保守區(qū)TP sequence193CGCAGACTGCTTGGTAGAGAGCGCCAGCGCGCTTTCCCGGCGTTGGGGGATCAGCGAAGCGCTCCTGGGCGCCACGCTCGTGAGCCTGGGCACCACCACCCCCGAGGCAGCCGTGTCTGTATACGCTGCGCTCTGCGGCAACGCCGACTTAGCACTCGGAAACGCCATAGGATCCATCGTGTGGATACCGGTTTCATTCTCGGACTCGGGGCACTCCTTGCACGCCCCGGGCTCGCGCTC GACACACACTTGATGCGCCGGCACGCGCGGGTGCAATTGTTCGTCGTATGCGCGC 388TP sequence2681 AGC CGCAACCATC ATCGCCTTTGGCACCAGCGTGCCAGAACTCGTCTCTGCCATCACCGCAGTACGCCGCGGACACGGCGCACTGGCAGTGGGAAACATAGTAGGTGCGGATATCCTCAATGTGCTGTTTGTAGTCGGAGCTG CCGCGTCTCT TACGCCACAC GGCCTGCCGG TGCCAAAAATCTTTTCTCTG CTACACCTGC CTGCCATGCT GTTAGTCGTG GGAATCTTTCACGCGTGCGCACTCGGCCGCAGGACCCTCACCCGCCCTGCCGGTGTGCTCCTGTGCGCGGTATATGGGCTGTTCGTGCTGCTAAACGGATTGCTCAGGGGCACAGGACCCTAATCGGAGTCAGAGAGCGGTCCAGGCTTTCCATTCATGTCCGCAAGATATCCTGCAAGGGTGTGGCACG TTGCGCGCGCCTCTGCCAGT TTCTTGCGCT CTGCGGTCAC 1113TP sequence3118 A ATACAGGACT TCCAGCGCAT GGCCGTACGT GTGTTGTACG TACAGCCTGCTCTACCTAGG CTTTCAGGGT AGCACCAAGC ATCCAAATGG CCTTTCCCAACGTCCTCAGT ATGTCTGTGA TAATGCCGTC AGTCACTGCA TCCCCACTTTCAGCTGCAAG TACTTGCGTT TGGCTGAATC GCGTACTTAG GTATTCAAAATCCCGCTTTA CGCGCGCAAG CGCAGAGACG ATAGTGATCT CTTTCTCCGTCTCTTCTGCA ATTCCACTCA ACGCAAGGTA TTCAGCCATA GACGCA 414TP sequence4598CGCAGATAGCAGCAATGGCACGAGCGTCCGGTACACCGGGGGCGCTGGCTCCAACTGCAGCGCTCGTGGCGGTGCTGTGGTATTTTTTTCCATCTGTACACATGTTCATCGTTCTTTCTCCTCCAAACTTTAAAGCAAAAACCATGCCAACAAAAAATCGAAAGAAATGGAGCATAACCACTGTCTTTTTGGACTTTTCCCGGCTTTTTTTCACCGATTGGTAAAATAATCATTTATTTTCACCGAGATTTCGTGAAGTTTCAGCGAAATCTTTTTTCCAGGAGACGTAATTCTCAATCCACCAAGCCTC C 908HIV保守區(qū)HIV sequence1
225 AGCTCT CTCGACGCAG GACTCGGCTT251 GCTGAAGCGC GCACGGCAAG AGGCGAGGGG CGGCGACTGG TGAGTACGCC301 AAAAATTTTG ACTAGCGGAG GCTAGAAGGA GAGAGATGGG TGCGAGAGCG351 TCAGTATTAA GCGGGGGAGA ATTAGATCGA TGGGAAAAAA TTCGGTTAAG401 GCCAGGGGGA AAGAAAAAAT ATAAATTAAA ACATATAGTA TGGGCAAGCA451 GGGAGCTAGA ACGATTCGCA GTTAATCCTG GCCT 484HIV sequence2762 GTACATCAG GCCATATCAC CTAGAACTTT AAATGCATGG801 GTAAAAGTAG TAGAAGAGAA GGCTTTCAGC CCAGAAGTGA TACCCATGTT851 TTCAGCATTA TCAGAAGGAG CCACCCCACA AGATTTAAAC ACCATGCTAA901 ACACAGTGGG GGGACATCAA GCAGCCATGC AAATGTTAAA AGAGACCATC951 AATGAGGAAG CTGCAGAATG G 971HIV sequence34267GGTA AGAGATCAGG CTGAACATCT TAAGACAGCA4301 GTACAAATGG CAGTATTCAT CCACAATTTT AAAAGAAAAG GGGGGATTGG4351 GGGGTACAGT GCAGGGGAAA GAATAGTAGA CATAATAGCA ACAGACATAC4401 AAACTAAAGA ATTACAAAAA CAAATTACAA AAATTCAAAA TTTTCGGGTT4451 TATTACAGGG ACAGCAGAAA TCCACTTTGG AAAGGACCAG CAAAGCTCCT4501 CTGGAAAGGT GAAGGGGCAG TAGTAATACA AGATAATAGT GACATAAAAG4551 TAGTGCCAAG AAGAAAAGCA AAGATCATTA GGGATTATGG AAAACAGATG4601 GCAGGTGATG ATTGTGTGGC AAGTAGACAG GAT 4633HIV sequence47244GAACCAT7251 TAGGAGTAGC ACCCACCAAG GCAAAGAGAA GAGTGGTGCA GAGAGAAAAA7301 AGAGCAGTGG GAATAGGAGC TTTGTTCCTT GGGTTCTTGG GAGCAGCAGG7351 AAGCACTATG GGCGCAGCCT CAATGACGCT GACGGTACAG GCCAGACAAT7401 TATTGTCTGG TATAGTGCAG CAG 7423HCV保守區(qū)HCV sequence1261 GCCTTGTGGT ACTGCCTGAT AGGGTGCTTG CGAGTGCCCC301 GGGAGGTCTC GTAGACCGTG CACCATGAGC ACGAATCCTA AACCTCAAAG AAAAACCAAA361 CGTAACACCA ACCGCCGTCC ACAGGACGTC AAGTTCCCGG GCGGTGGTCA GATCGTTGGT421 GGAGTTTACC TGTTGCCGCG CAGGGGCCCC AGGTTGGGTG TGCGCGCGCT CAGGAAGACTHCV sequence24651 GGCTTTACCG GCGACTTTGA CTCAGTGATC4681 GACTGTAACA CATGTGTCAC CCAAACAGTC GATTTCAGCT TGGACCCTAC CTTCACCATT4741 GAGACGACGA CCGTGCCCCA AGACGCAGTG TCGCGCTCGC AACGGCGAGG CAGGACTGGT4801 AGGGGCAGGA GAGGCATCTA CAGGTTTGTG ACTCCGGGAG AGCGGCCCTC GGGCATGTTC4861 GATTCCTCGG TCCTGTGTGA GTGCTATGAC GCGGGCTGTG CTTGGTATGA GCT 4913HCV sequence36117 CACG6121CACTATGTGC CTGAGAGCGA CGCCGCAGCG CGTGTCACTC AGATCCTCTC CAGCCTTACC6181 ATCACCCAGC TGTTGAAGAG GCTCCACCAG TGGATTAACG AGGACTGCTC CACGCCATGC6241 TCCGGTTCGT GGCTAAGGGA TGTTTGGGAC TGGATATGCA CGGTGT 6286HCV sequence48424 AAGCGGC GTGCTGACGA CTAGCTGCGG TAATACCCTT8461 ACATGTTACT TGAAGGCCTC TGCGGCCTGT CGAGCTGCAA AGCTCCAGGA CTGCACGATG8521 CTCGTGTGCG GAGACGACCT CGTCGTTATC TGTGAAAGCG CGGGAACCCA AGAGGACGCG8581 GCGAGCCTAC GAGTCTTCAC GGAGGCCATG ACTAGGTACT CTGCCCCCCC CGGGGACCCG8641 CCCCAACCAG AATACGACCT GGAGCTGATA ACATCATGCT CCTCGAATGT GTCGGTCGCG8701 CACGATGCAT CCGGCAAGAG AGTATACTAC CTCACCCGTG 8740所說的基因芯片中，上述作為靶基因的保守區(qū)序列可通過DNA合成儀合成或克隆取得，并經(jīng)PCR擴(kuò)增，以上方法為常規(guī)方法，具體方法可見〖分子克隆實驗指南〗，科學(xué)出版社98版上公開的技術(shù)，此處不再贅述。擴(kuò)增產(chǎn)物可以采用常規(guī)方法點樣(點樣的具體方法可見Cartisian7500點樣儀的使用)于特殊處理的玻片上。
同時，為檢測出血清中可能存在的多種RNA、DNA病原體，亦需同時制備血清中多種感染性病原體的RNA、DNA模板，該制備方法為常規(guī)方法。但上述步驟所獲得的血清中多種感染性病原體的RNA、DNA模板，必須進(jìn)行PCR擴(kuò)增并熒光標(biāo)記探針，才能與芯片上的靶基因進(jìn)行雜交。為此，本發(fā)明設(shè)計了一系列針對所需診斷的感染性疾病病毒靶基因的高檢出率的引物，分別表述如下1．HBV擴(kuò)增引物的設(shè)計一共設(shè)計了二對引物，其序列如下HBV primer1HBV1:5′ TCT AGA TAC CGC CTC AGC TC 3 pre c 和 c geneHBV 1 C:5 GTG CGA ATC CAC ACT CCG AA 3 pre c 和 c geneHBV primer2HBV2: 5 CTA GGA GGC TGT AGG CAT AA 3 pre c 和c geneHBV2C: 5 CGA GAG TAA CTC CAC AGT AG 3 pre c 和 c gene2．TP擴(kuò)增引物的設(shè)計一共設(shè)計了四對引物，其序列如下TP primer1TP1: 5 CGC AGA CTG CTT GGT AGA GA 3 gene Tp1034TP1C:5 GCG CGC ATA CGA CGA ACA AT 3 gene Tp1034TP primer2TP2: 5 AGC CGC AAC CAT CAT CGC CT 3 gene Tp1034TP2C: 5 GTG ACC GCA GAG CGC AAG AA 3 gene Tp1034TP primer3TP3: 5 AAT ACA GGA CTT CCA GCG CA 3 gene TYF1TP3C: 5 TGC GTC TAT GGC TGA ATA CC 3 gene TYF1TP primer4TP4: 5 CGC AGA TAG CAG CAA TGG CA 3 gene TYF1TP4C: 5 GGA GGC TTG GTG GAT TGA GA 3 gene TYF13．HIV擴(kuò)增引物的設(shè)計一共設(shè)計了四對引物，其序列如下HIV primer1HIV1: 5 AGC TCT CTC GAC GCA GGA CT3HIV1C: 5 AGG CCA GGA TTA ACT GCG AA3HIV primer2HIV2: 5 GTA CAT CAG GCC ATA TCA CC 3HIV2C: 5 CCA TTC TGC AGC TTC CTC AT 3HIV primer3HIV3: 5 GGT AAG AGA TCA GGC TGA AC 3HIV3C: 5 ATC CAG TCT ACT TGC CAC AC 3HIV primer4HIV4: 5 GAA CCA TTA GGA GTA GCA CC 3HIV4C: 5 CTG CTG CAC TAT ACC AGA CA 34．HCV擴(kuò)增引物的設(shè)計一共設(shè)計了四對引物，其序列如下HCV primer1HCV1: 5 GCC TTG TGG TAC TGC CTG AT 3HCV1C: 5 ACC GCT CGG AAG TCT TCC TG 3HCV primer2HCV2: 5 GGC TTT ACC GGC GAC TTT GA 3HCV2C: 5 AGC TCA TAC CAA GCA CAG CC 3HCV primer3HCV3: 5 CAC GCA CTA TGT GCC TGA GA 3HCV3C: 5 ACA CCG TGC ATA TCC AGT CC 3HCV primer4HCV4: 5 AAG CGG CGT GCT GAC GAC TA 3HCV4C: 5 CAC GGG TGA GGT AGT ATA CTC T 3上述引物可以采用DNA合成儀人工合成并經(jīng)HPLC純化，該方法為一種現(xiàn)有的技術(shù)，本發(fā)明不再贅述。
所說的引物的可以對同一病原體的各種亞型進(jìn)行擴(kuò)增，大大提高了診斷芯片上病原體檢出率。擴(kuò)增采用〖分子克隆實驗指南〗，科學(xué)出版社98版上公開的技術(shù)，此處不再贅述。以下將通過附圖對本發(fā)明所說的基因芯片作詳細(xì)的說明。


圖1為所說的基因芯片的示意圖。圖中A--------------檢測監(jiān)控系統(tǒng)B--------------疾病診斷系統(tǒng)1--------------點樣液2--------------植物基因a3--------------植物基因b4--------------植物基因c5--------------HBV病毒靶基因6--------------HCV病毒靶基因7--------------HIV病毒靶基因
8--------------TP病毒靶基因圖2為用于基因芯片診斷疾病的操作流程圖。
由
圖1可見，檢測監(jiān)控系統(tǒng)A由點樣液1、植物基因a2、植物基因b3和植物基因c4所組成；疾病診斷系統(tǒng)B由HBV病毒靶基因5、HCV病毒靶基因6、HIV病毒靶基因7和TP病毒靶基因8所組成；每一種病毒靶基因均由每一種病毒的若干保守區(qū)所構(gòu)成。
用上述公開的新的引物擴(kuò)增并熒光標(biāo)記探針，并與所說的基因芯片進(jìn)行雜交，即可對人體的感染性病毒進(jìn)行診斷，用熒光掃描儀掃描，并使用分析軟件分析雜交結(jié)果。掃描結(jié)果顯示正對照有熒光信號；負(fù)對照沒有熒光信號，根據(jù)信號的有無來判斷待測樣品是陰性還是陽性。
由上述公開的技術(shù)方案可見，由于所說的芯片可以同時對多種感染性病毒進(jìn)行檢測，大大縮短了診斷時間，并大大提高了診斷的準(zhǔn)確性又降低了診斷成本。將具有十分深遠(yuǎn)的意義。
以下將通過實施例對本發(fā)明的有關(guān)細(xì)節(jié)作進(jìn)一步的闡述，但實施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實施例1HBV擴(kuò)增引物一共設(shè)計了兩對引物，其中HBV primer1序列如下HBV primer1HBV1:5′TCT AGA TAC CGC CTC AGC TC 3 pre c和c geneHBV 1 C:5 GTG CGA ATC CAC ACT CCG AA 3 pre c和c gene上述序列可采用DNA合成儀進(jìn)行人工合成并用HPLC純化，具體見〖分子克隆實驗指南〗第538頁，科學(xué)出版社98版。
所有其他的擴(kuò)增引物亦可采用以上方法合成。
實施例2診斷芯片探針制備2.1目的從病人血液中制備RNA病毒標(biāo)本，通過反轉(zhuǎn)錄等步驟使樣品帶有Cy3或Cy5的熒光標(biāo)記，同時制備血清中多種感染性病原體DNA和RNA模板。2.2制備方法2.2.1制備步驟1血清樣品DNA、RNA抽提前處理液配制成120ul/管(其中10％為焦碳酸二乙酯(DEPC),90％為無水乙醇)步驟1．10ul前處理液加100ul血清、植物基因b 0.1ng一起混勻。2．37℃,6分鐘。3．沸水浴10分鐘。4．65℃烘干15分鐘。(烘干時把管子蓋子打開)。5．15000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，備用。注65℃烘干必須用水浴鍋，烘干時把水浴鍋蓋子打開。2.2.2制備步驟2反轉(zhuǎn)錄制備模板DNA2.2.2.1向步驟1制備含的DNA、RNA沉淀的eppendorf管內(nèi)，依次加入下列試劑Milli-Q H2O(超純水) 11μl15μmol/l HCV、HIV、植物基因b反轉(zhuǎn)錄引物2μl用手指彈eppendorf管底部充分溶解沉淀，混勻樣品，5000rpm離心5sec，置于70℃水浴鍋內(nèi)保溫5min。2.2.2.2取出該eppendorf管，置于冰上1min,5000rpm離心5sec。2.2.2.3向該eppendorf管內(nèi)依次加入以下試劑0.1mol/l DTT(二硫蘇糖醇) 2μl逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(buffer) 4μl10mmol/l dATP-dGTP-dCTP-dTTP昆和物 1μl用手指彈eppendorf管底部10次，混勻樣品，5000rpm離心5分鐘，置于42℃水浴鍋內(nèi)保溫2分鐘。
其中，逆轉(zhuǎn)錄緩沖液buffer配方如下配45ml,165ul/管10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 6mlDEPC-H2O 39ml,10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液配方如下配40ml,pH8.2,1M Tris-HCl 10ml
1M Kcl 20ml10mg/ml明膠4mlDEPC-H2O 6ml2.2.2.3向該eppendorf管內(nèi)加入0.5μl SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶，用手指彈eppendorf管底部10次，混勻樣品，5000rpm離心5分鐘，置于42℃水浴鍋內(nèi)保溫20分鐘。2.2.2.4從水浴鍋內(nèi)取出eppendorf管，備用。2.2.3制備步驟3PCR標(biāo)記探針2.2.3.1吸取5μl步驟2中制備的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和10mM的HBV、TP、植物基因c各1μl于0.2ml薄壁管管中，并依次加入下列試劑ddH2O 28.5μl10×PCR Buffer 5μl25mmol/l MgCl224μl10mmol/l dATP-dGTP-dCTP昆合物1μl1mmol/l dTTP 1μl0.1mmol/l Cy3-dUTP 1μl0.1mmol/l Cy5-dUTP 1μl15μmol/l HBV、HCV、HIV、TP、植物基因b、植物基因c引物混合物1μlTaq酶 0.5μl用手指彈eppendorf管底部10下，混勻樣品。2.2.3.2將薄壁管置于MJ Research PTC-225 PCR儀中按下列程序進(jìn)行PCR反應(yīng)①95℃1.5min②95℃20sec③55℃20sec④72℃2min⑤goto②for 39 cycles⑥72℃5min
⑦4℃forever(待機(jī))⑧END2.2.3.3取出薄壁管，-20℃蔽光保存。2.2.4 制備步驟4產(chǎn)物DNA的純化使用MicroSpin S-200 Columes試劑盒提供的S-200純化柱純化DNA。2.2.5 制備步驟5標(biāo)記效果檢查2.2.5.1用10μl移液器吸取微量(0.5μl)的標(biāo)記產(chǎn)物，分點3個于一個干凈的玻片上。2.2.5.2將點上樣品的玻片置于80℃烘箱中干燥1分鐘。2.2.5.3將干燥的玻片用ScanArray 3000掃描儀掃描，觀察標(biāo)記效果，與標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較，讀出標(biāo)記核苷酸的濃度(Cn)，按如下公式換算標(biāo)記探針的總量(T):T=50Cn。ScanArray 3000掃描儀使用方法見附錄。2.3質(zhì)量指標(biāo)檢測出的探針總量(T)應(yīng)大于0.5ng(暫定)。
實施例3基因芯片的應(yīng)用及結(jié)果分析感染性病原體診斷芯片是將待測病原體的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成芯片，將從病人血清中抽提出病原體的DNA或RNA經(jīng)擴(kuò)增標(biāo)記螢光制成探針，與芯片進(jìn)行雜交，雜交信號由掃描儀掃描，再經(jīng)計算機(jī)分析，判斷陰陽性。診斷基因芯片的應(yīng)用步驟包括生物信息分析、芯片設(shè)計、模板DNA制備、靶基因PCR、點樣、診斷芯片探針制備、雜交、結(jié)果分析等步驟，具體流程見圖2。1．生物信息分析，芯片設(shè)計，具體內(nèi)容見本文技術(shù)方案；2．病毒基因保守區(qū)DNA、RNA的選擇與模板的制備，具體內(nèi)容見本文技術(shù)方案；3．靶基因PCR(PCR步驟見“分子克隆實驗指南”科學(xué)出版社98版)3.1于0.2ml薄壁管內(nèi)加入ddH2O 36.3μl150ng/μl模板DNA1μl25μmol/L引物 1μl輕彈管壁2次以混勻樣品。3.2 將薄壁管置于MJ RESEARCH PR PTC 225 PCR儀中95℃變性2min。3.3 立即置于冰上，在每孔中加入酶混合液10×buffer5μl25mmol/L MgCl24μl10mmol/L dNTP 2μlTaq酶 0.7μl用槍來回吸打3次，充分混勻樣品。3.4 將薄壁管置于MJ RESEARCH PCT 225 PCR儀按下列順序進(jìn)行擴(kuò)增①95℃20sec②55℃20sec③72℃ 2min④循環(huán)①-③步驟39次⑤72℃5min⑥4℃ forever(待機(jī))⑦END3.5 從PCR儀中取出反應(yīng)管，取1μl走電泳。通常每管PCR產(chǎn)物總量應(yīng)達(dá)到2-5μg。3.6 取2-5次相同PCR產(chǎn)物合并到一1.5ml eppendorf管中，加入1/10vol3MNaAC(PH5.2)，或加入等體積異丙醇，來回吸排混勻，20℃過夜。3.7 4℃12000rpm離心10min。3.8 棄上清，加入500μl 75％乙醇顛倒洗滌3次，4℃12000rpm離心5min。3.9 輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，室溫干燥10min。4．診斷芯片探針制備，具體內(nèi)容見實施例2。5．點樣5.1 Poly Lysine玻片上的點樣5.1.1 將干燥的PCR產(chǎn)物溶于8μl ddH2O中，取出0.5μl走1％瓊脂糖膠電泳，估計濃度，濃度應(yīng)大于1μg/μl。5.1.2 向溶解的PCR產(chǎn)物加入等體積的2×Spot溶液中(Sigma)，再用1×Spot溶液調(diào)整濃度為0.5μg/μl,Biofuge fresco離心機(jī)12000rpm離心10min。]5.1.3 用Carstisian 7500點樣儀進(jìn)行點樣。5.1.4 將點樣后的玻片置濕潤的鋁質(zhì)飯盒中2hr，進(jìn)行再水合。5.1.5 100℃強(qiáng)烈干燥1min,4℃保存或進(jìn)行以下操作。5.1.6 置紫外交聯(lián)儀中，能量值設(shè)定60mj/cm2，時間設(shè)置5min。5.1.7 將玻片插入盛有0.2％SDS(十二烷基硫酸鈉)的染色缸內(nèi)2min。5.1.8 在芯片上覆蓋200μl琥珀酸酐溶液處理15min。5.1.9 置于盛有ddH2O的染色缸內(nèi)浸泡5min，重復(fù)2次。5.1.10晾干，密封存于4℃冰箱或立即使用。5.2 硅化玻片上的點樣5.2.1 將干燥的PCR產(chǎn)物溶于8μl ddH2O中，取出0.5μl走1％瓊脂糖凝膠電泳，估計濃度，濃度應(yīng)大于1μg/μl。5.2.2 向溶解的PCR產(chǎn)物加入等體積的2×Spot溶液中(Sigma)，再用1×Spot溶液調(diào)整濃度為0.5μg/μl,Biofuge fresco離心機(jī)12000rpm離心10min。5.2.3 用Carstisian 7500點樣儀進(jìn)行點樣。5.2.4 將點樣后的玻片置濕潤鋁質(zhì)飯盒中4 hr，進(jìn)行再水合。4℃保存或進(jìn)行以下操作。5.2.5 置于紫外交聯(lián)儀中，能量值設(shè)定65mj/cm。5.2.6 置于盛有0.2％SDS溶液的染色缸內(nèi)浸泡5min。5.2.7 在芯片上覆蓋300-500μl 0.2mol/L硼氫化鈉溶液處理5min。5.2.8 用ddH2O 1-2ml沖洗一下。5.2.9 95℃水浴鍋內(nèi)變性2min。5.2.10 迅速置于盛有95％乙醇的染色缸內(nèi)浸泡30sec。6．雜交6.1 將制備的經(jīng)抽干的探針加入6.5μl預(yù)熱的6×SSPE+0.4％SDS+10xDenhardt溶液，在避光條件下充分振蕩溶解DNA，加入6.5μlFormamide(甲酰胺)溶液振蕩混勻，5000rpm離心10sec。6.2 將溶解的探針和待雜交的玻片置于95℃的水浴鍋內(nèi)變性2min。6.3 將變性好的探針避光冰浴。6.4 將玻片插入到盛有無水乙醇的染色缸內(nèi)室溫放置30sec，取出置于95℃水浴鍋外罩上烤干。6.5 用鑷子上端取12μl的上述探針，滴于玻片上，用鑷子上端將18×18mm蓋玻片蓋于其上，玻片置于專用玻片盒中，封上PARAFILM。6.6 將玻片盒置于6層紗布的濕潤的飯盒內(nèi)，將飯盒置于Robbins Mode11000雜交爐內(nèi)，42℃雜交，3hr。6.7 立即放入盛有2×SSC+0.2％SDS溶液的燒杯中，使蓋玻片自然脫落。6.8 準(zhǔn)備三個染色缸，分別裝有2×SSC+0.2％SDS,1×SSC+0.2％SDS,0.1×SSC+0.2％SDS放入50℃水浴鍋中。6.9 將玻片依次浸入以上三個染色缸中洗滌10min。6.10再將玻片浸入裝有0.1×SSC的染色缸中涮洗10sec，避光晾干后掃描。注Cy5對光敏感，因此操作時盡量避光。
上述Denhardt為封閉劑(50×Denhardt溶液中含5克聚蔗糖及5克聚乙烯吡咯酮和5克牛血清蛋白加水至500ml)。SSC是氯化鈉與檸檬酸鈉的混和的標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液。7． 結(jié)果分析將玻片用ScanArray 3000掃描儀掃描，并使用Imagene軟件分析雜交結(jié)果。
掃描結(jié)果顯示正對照有熒光信號；負(fù)對照沒有熒光信號，根據(jù)信號的有無來判斷待測樣品是陰性還是陽性，由此可知被檢血清是否感染有隨檢的病毒。
權(quán)利要求
1．用于感染性疾病HBV、TP、HIV和HCV診斷的基因芯片，其特征在于，該基因芯片包括檢測監(jiān)控系統(tǒng)(A)和疾病診斷系統(tǒng)(B)兩個系統(tǒng)所說的檢測監(jiān)控系統(tǒng)(A)至少包括四個對照元素，分別為陰性對照點樣液(1)、陰性對照植物基因a(2)、陽性對照植物基因b(3)和陽性對照植物基因c(4)；所說的疾病診斷系統(tǒng)(B)設(shè)有四種感染性疾病病原體核酸的保守區(qū)序列，分別為HBV病毒靶基因，選自HBV病毒的核酸保守區(qū)；梅毒螺旋體TP病毒靶基因，選自TP病毒的核酸保守區(qū)；HCV病毒靶基因，選自HCV病毒的核酸保守區(qū)；HIV病毒靶基因，選自HIV病毒的核酸保守區(qū)。
2．如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，每個病原體靶基因選擇有2-4個核酸保守區(qū)序列。
3．如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于所說的點樣液為一種包含離子多聚物的緩沖液；所說的植物基因a的基因序列如Sequence a所示；所說的植物基因b的基因序列如Sequence b所示；所說的植物基因c的基因序列如Sequence c所示。
4．如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，配備有四組針對芯片所需診斷的感染性疾病病毒靶基因的高檢出率的擴(kuò)增引物，分別為一組HBV擴(kuò)增引物，其核苷酸序例如HBV primer 1或HBV primer 2所示；一組HCV擴(kuò)增引物，其核苷酸序例如HCV primer 1、HCV primer2、HCV primer 3或HCV primer4所示；一組HIV擴(kuò)增引物，其核苷酸序例如HIV primer1、HIV primer2、HIV primer3或HIV primer4所示；一組TP擴(kuò)增引物，其核苷酸序例如TP primer 1、TP primer 2、TP primer 3或TP primer4所示。
5．一組HBV擴(kuò)增引物，其特征在于，其核苷酸序例如HBV primer 1或HBVprimer 2所示。
6．一組HCV擴(kuò)增引物，其特征在于，其核苷酸序例如HCV primer 1、HCVprimer 2、HCV primer 3或HCV primer4所示。
7．一組HIV擴(kuò)增引物，其特征在于，其核苷酸序例如HIV primer 1、HIVprimer2、HIV primer3或HIV primer4所示。
8．一組TP擴(kuò)增引物，其特征在于，其核苷酸序例如TP primer1、TPprimer 2、TP primer3或TP primer4所示。
9．如權(quán)利要求1-4任一所述的基因芯片的應(yīng)用，其特征在于，可用于多種感染性病毒的診斷。
10．如權(quán)利要求1-4任一所述的基因芯片的應(yīng)用，其特征在于，可用于HBV病毒、梅毒螺旋體TP病毒、HCV病毒或HIV病毒的診斷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于感染性疾病HBV、TP、HIV和HCV診斷的基因芯片,并提供了用于診斷基因芯片的適合各種亞型擴(kuò)增的高檢出率的新引物。該基因芯片包括檢測監(jiān)控系統(tǒng)(A)和疾病診斷系統(tǒng)(B)兩個系統(tǒng)。由于所說的芯片可以同時對多種感染性病毒進(jìn)行檢測,并設(shè)有檢測監(jiān)控系統(tǒng),不僅大大縮短了診斷時間,且大大提高了診斷的準(zhǔn)確性,降低了診斷成本,尤其可以用于血站的血液檢測,將具有十分深遠(yuǎn)的意義。
文檔編號C12Q1/04GK1310236SQ0011170
公開日2001年8月29日 申請日期2000年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月21日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅, 李瑤 申請人:上海博道基因技術(shù)有限公司