專利名稱：狐米草細(xì)胞工程苗大規(guī)模繁殖技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。我國(guó)擁有5億多畝的鹽土資源，其中3億畝在海灘。要開發(fā)各類鹽土資源，引種耐鹽經(jīng)濟(jì)植物，實(shí)施鹽土農(nóng)業(yè)具有戰(zhàn)略意義。
狐米草(Spartina patens)是一種耐鹽優(yōu)質(zhì)牧草，但由于結(jié)實(shí)率很低，種子萌發(fā)率也很低，難以大規(guī)模繁殖推廣。
美國(guó)特拉華大學(xué)的鹽生植物生物技術(shù)中心(HBC)對(duì)狐米草種子(未涉及幼穗和其他外植體)進(jìn)行了組織培養(yǎng)誘導(dǎo)分化再生植株的研究，發(fā)表了一篇論文(Xianggan Li，et al.，1995.Plant regeneration from callus cultures of salt marsh hay，Spartina patens，and its cellular-based salt tolerance，Aquatic botany 51，1995，103-113)，敘述了其組培試驗(yàn)全過(guò)程和各階段培養(yǎng)基的主要成分，未涉及實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模生產(chǎn)再生苗的技術(shù)(如報(bào)道植株再生的頻率和獲得再生植株的數(shù)量)，更缺乏實(shí)驗(yàn)室外的苗床無(wú)土栽培擴(kuò)繁和灘涂實(shí)施技術(shù)。
目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)狐米草細(xì)胞工程苗大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)及灘涂引種的成套技術(shù)研究及相關(guān)專利的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是運(yùn)用本項(xiàng)發(fā)明技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)狐米草耐鹽優(yōu)質(zhì)細(xì)胞工程苗，以克服該植物結(jié)實(shí)率低、種子萌發(fā)率也低，阻滯大規(guī)模繁殖推廣的弊端，適應(yīng)我國(guó)海岸帶耐鹽牧草引種開發(fā)的迫切需要，從而推動(dòng)我國(guó)鹽土農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本發(fā)明的技術(shù)方案是1.狐米草組培細(xì)胞工程苗快繁技術(shù)利用狐米草種子和幼穗進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過(guò)激素調(diào)控，可使其愈傷組織誘導(dǎo)頻率提高至60％～90％以上。
愈傷組織的繼代培養(yǎng)是決定其能否順利進(jìn)入分化的關(guān)鍵。通過(guò)調(diào)整改善光照、激素條件、瓊脂類別、氮源和有機(jī)化合物等因子，在遏止愈傷組織的褐化方面取得了成功，促使其繼代增殖的正常進(jìn)行，從而獲得綠色致密的胚性愈傷組織。
本項(xiàng)技術(shù)已建立了狐米草優(yōu)質(zhì)胚性細(xì)胞系，從綠色致密的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化，植株再生頻率為100％(平均一塊愈傷組織可產(chǎn)生20多個(gè)再生植株)。
在以上研究的基礎(chǔ)上，本項(xiàng)技術(shù)建立了狐米草組織培養(yǎng)再生苗的技術(shù)體系如下(1)在添加2，4-D和IAA激素條件下由狐米草外植體(種子和幼穗)誘導(dǎo)愈傷組織；(2)在添加2，4-D、NAA、BA、CW等激素條件下，進(jìn)行愈傷組織的繼代培養(yǎng)；(3)在添加BA和IAA等激素條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)再生植株；(4)在添加IBA、KT和AC等激素條件下，培養(yǎng)出完整的(生根的)再生植株；
該體系技術(shù)性能穩(wěn)定，試驗(yàn)重復(fù)性好，試管再生苗分蘗、叢生性狀良好，優(yōu)質(zhì)試管再生苗年生產(chǎn)能力為100萬(wàn)株。各培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基配方(激素配比)如下表狐米草組培各階段的培養(yǎng)基配方
在試管苗生產(chǎn)過(guò)程中，各個(gè)培養(yǎng)階段的基本培養(yǎng)基均為MS大量元素、微量元素，B5維生素，蔗糖3％，Gelrite或Phytagel 0.2％。
采用這一技術(shù)體系，種子發(fā)芽率從5％提高到50％以上；以種子為外植體材料，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)57％以上，以幼穗為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率在90％以上；綠色顆粒狀愈傷組織繼代培養(yǎng)增殖周期為20天，增殖率為1∶8；綠色愈傷組織再生植株的頻率達(dá)100％，平均每塊愈傷組織分化植株4～5叢計(jì)20多株；試管苗的生根率達(dá)90％以上。2.狐米草再生苗擴(kuò)繁技術(shù)用上述優(yōu)質(zhì)試管苗轉(zhuǎn)移至無(wú)土栽培苗床，配以疏松型培養(yǎng)基(宜采用鋸木屑碳渣型培養(yǎng)基，二者體積比為10∶1)和海水性營(yíng)養(yǎng)液，經(jīng)2個(gè)月的育苗栽培，效果較好，幼苗成活率超過(guò)80％，擴(kuò)繁倍數(shù)為20～30，根長(zhǎng)超過(guò)30cm，完全達(dá)到耐鹽優(yōu)質(zhì)苗水準(zhǔn)。這類優(yōu)質(zhì)苗引種到蘇北鹽城海岸帶被海水浸潤(rùn)的灘涂，經(jīng)10種生境條件的探索研究，立苗成活率可達(dá)80％。
狐米草無(wú)土栽培所用的營(yíng)養(yǎng)液為海水性營(yíng)養(yǎng)液，實(shí)際上是間隔澆灌植物營(yíng)養(yǎng)液和人工海水。植物營(yíng)養(yǎng)液(改進(jìn)的Hogland營(yíng)養(yǎng)液)和人工海水配方如下表所示植物營(yíng)養(yǎng)液配方
人工海水配方
狐米草細(xì)胞工程苗出瓶后經(jīng)2個(gè)月以上的無(wú)土栽培，已達(dá)優(yōu)質(zhì)分蘗苗的標(biāo)準(zhǔn)，其株高在80～100cm，根長(zhǎng)超過(guò)30cm，分蘗數(shù)也超過(guò)30，其增殖倍數(shù)為20～30。
運(yùn)用本項(xiàng)技術(shù)出瓶的4000株細(xì)胞工程苗，經(jīng)無(wú)土栽培共培育出60000株優(yōu)質(zhì)分蘗苗。
在鹽城灘涂(大豐海豐農(nóng)場(chǎng)自強(qiáng)養(yǎng)殖公司灘涂基地、射陽(yáng)鹽場(chǎng)送水道灘涂和大豐斗龍港等灘涂)進(jìn)行了11次狐米草再生苗的引種栽培，共計(jì)60000株苗，建立了面積為10畝的以狐米草為代表的的鹽土農(nóng)業(yè)示范區(qū)。
引種栽培的成功與否取決于育苗的健壯(主要是根系)、狐米草生活習(xí)性的掌握和灘涂環(huán)境情況(具體種植情況如下表所示)。
表4不同條件下狐米草再生植株的引種栽培對(duì)比 本發(fā)明效果是采用這一技術(shù)體系，種子發(fā)芽率從5％提高到50％以上；以種子為外植體材料，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)57％以上，以幼穗為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率在90％以上；綠色顆粒狀愈傷組織繼代培養(yǎng)增殖周期為20天，增殖率為1∶8；綠色愈傷組織再生植株的頻率達(dá)100％，平均每塊愈傷組織分化植株4～5叢計(jì)20多株；試管苗的生根率達(dá)90％以上。
狐米草細(xì)胞工程苗出瓶后經(jīng)2個(gè)月以上的無(wú)土栽培，已達(dá)優(yōu)質(zhì)分蘗苗的標(biāo)準(zhǔn)，其株高在80～100cm，根長(zhǎng)超過(guò)30cm，分蘗數(shù)也超過(guò)30，其增殖倍數(shù)為20～30。
通過(guò)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)研究，大規(guī)模生產(chǎn)狐米草的細(xì)胞工程苗，并用細(xì)胞工程等技術(shù)改良狐米草的農(nóng)藝品質(zhì)，以利于推廣開發(fā)。如有足夠投資，用此技術(shù)方案，可年生產(chǎn)狐米草試管苗100萬(wàn)株，從而年產(chǎn)細(xì)胞工程苗2000萬(wàn)株以上。這樣，不僅每年從細(xì)胞工程苗可獲直接經(jīng)濟(jì)收入200萬(wàn)元，而且可實(shí)現(xiàn)直接推廣面積1000畝左右。鹽土農(nóng)業(yè)非常適合我國(guó)的國(guó)情，有利于解決我國(guó)地少人多、食物和蛋白質(zhì)短缺的問(wèn)題，也可以緩解西部草場(chǎng)的生境壓力。因?yàn)楹}沼的光能利用率是溫帶草地的10倍；海灘鹽沼植被的生產(chǎn)力是溫帶草原的10-15倍；開發(fā)海灘鹽土非但不占良田，還可增加農(nóng)業(yè)用地；因此，充分利用鹽土和海水資源，大力開發(fā)耐鹽耐海水優(yōu)質(zhì)牧草等植物資源，有望為我國(guó)的海洋產(chǎn)業(yè)創(chuàng)造巨大的新增效益。
權(quán)利要求
一、狐米草細(xì)胞工程苗快繁技術(shù)，其特征是利用狐米草種子和幼穗進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，其技術(shù)體系為(1)添加2，4-D和IAA激素條件下由狐米草外植體(種子和幼穗)誘導(dǎo)愈傷組織；(2)在添加2，4-D、NAA、BA、CW等激素條件下，進(jìn)行愈傷組織的繼代培養(yǎng)；(3)在添加BA和IAA等激素條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)再生植株；(4)在添加IBA、KT和AC等激素條件下，培養(yǎng)出完整的(生根的)再生植株；
二、狐米草再生苗擴(kuò)繁技術(shù)，其特征是用權(quán)利要求一產(chǎn)出的優(yōu)質(zhì)狐米草試管苗轉(zhuǎn)移至無(wú)土栽培苗床，間隔澆灌植物營(yíng)養(yǎng)液和人工海水，無(wú)土栽培2-3個(gè)月，可達(dá)優(yōu)質(zhì)分蘗苗標(biāo)準(zhǔn)。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。運(yùn)用狐米草組培細(xì)胞工程苗快繁技術(shù)和狐米草再生苗擴(kuò)繁技術(shù),大規(guī)模生產(chǎn)狐米草耐鹽優(yōu)質(zhì)細(xì)胞工程苗,以克服該植物結(jié)實(shí)率低、種子萌發(fā)率也低,阻滯大規(guī)模繁殖推廣的弊端,適應(yīng)我國(guó)海岸帶耐鹽牧草引種開發(fā)的迫切需要,從而推動(dòng)我國(guó)鹽土農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1296075SQ0011252
公開日2001年5月23日 申請(qǐng)日期2000年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月12日
發(fā)明者欽佩, 佘建明, 蔡小寧, 謝民, 楊永華, 尹金來(lái), 李寬鈺 申請(qǐng)人:南京大學(xué), 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物遺傳生理研究所, 江蘇省沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所