專利名稱：一種雞的球蟲體外細胞培養(yǎng)模型及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞的球蟲體外細胞培養(yǎng)模型及應(yīng)用該模型對抗球蟲藥物的藥效進行篩選及藥效監(jiān)測的方法。
傳統(tǒng)的同類研究，主要是集中在對雞球蟲的細胞組織培養(yǎng)研究方面，目前，尚未發(fā)現(xiàn)有將這種組織培養(yǎng)系統(tǒng)地應(yīng)用于對抗球蟲藥物的篩選和藥效監(jiān)測的應(yīng)用研究。而且，由于采用以往組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基時球蟲的卵囊產(chǎn)量低，影響了抗球蟲藥物效評價的準確度，從而使該藥物的篩選無法正常進行。
本發(fā)明的第一個目的是提供一種能有效地應(yīng)用于抗球蟲藥物的藥效評價及篩選的雞球蟲體外細胞培養(yǎng)模型。
本發(fā)明的第二個目的是為上述模型提供用于評價和篩選目的的抗球蟲藥物助溶劑從而實現(xiàn)對抗球蟲藥物的藥效評價與篩選。
本發(fā)明的第三個目的是在工藝操作上提高評價與篩選的效果。
本發(fā)明的第四個目的是建立評價抗球蟲藥效的評價指標。
本發(fā)明的第一個目的是這樣實現(xiàn)的一種雞的球蟲體外細胞培養(yǎng)模型，其包括在帶有雞腎細胞團組織的培養(yǎng)基上加入經(jīng)純化的球蟲子孢子，在雞體外培養(yǎng)球蟲第一、二代裂殖體，直至形成卵囊，其特征在于培養(yǎng)基的成份是在α-MEM培養(yǎng)基(市面有售)中加入動物血清3％-7％，溶液PH值為6.7-7.6。其中，加入動物血清的目的是增加球蟲繁殖所需要的營養(yǎng)；血清濃度采用3％-7％為基本有效濃度；5％濃度左右為佳。上述PH值為球蟲繁殖環(huán)境所需要。
本發(fā)明上述方案可以這樣完善動物血清是雞的血清。加入微量胰島素及葉酸。加入維生素B6 0.003mg/ml至0.007mg/ml。采用雞血清作為營養(yǎng)成份最利于球蟲的生長、繁殖；加入微量的胰島素、葉酸、維生素B6能有效地改善球蟲的生長、繁殖生理環(huán)境；對卵囊數(shù)量的有效增加起到很大的作用；胰島素、葉酸的加入可以采用在調(diào)好培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上滴入的辦法，例如在α-MEM培養(yǎng)基中加入5％的雞血清、0.05μg/ml胰島素、0.005mg/ml葉酸及0.005mg/ml維生素B6。
本發(fā)明的第二個目的是這樣實現(xiàn)的一種在權(quán)利要求1所述的模型上進行抗球蟲藥物篩選的方法，其特征在于加入抗球蟲藥物及其相應(yīng)的助溶劑?？骨蛳x藥物只有在溶解狀態(tài)下才能發(fā)揮作用，所以，要用助溶劑溶解該藥物。
上述方案中的采用不同的抗球蟲藥物必須用不同的助溶劑，因此本發(fā)明有針對性地進行了篩選，篩選結(jié)果表明抗生素類抗球蟲藥物采用無水乙醇為助溶劑為好。非水溶性化學合成類抗球蟲藥物采用二甲基亞砜為助溶劑為好。水溶性抗球蟲藥物采用Hank’s液為助溶劑為好。
為了在工藝操作上提高平價與篩選的效果?？骨蛳x藥物的投入與球蟲子孢子的投入可以同時進行。實踐證明投藥于球蟲培養(yǎng)全期(與子孢子接種同時投藥)比接種后再投藥的效果要好，能更準確地評價藥物的藥效(當子孢子感染時，藥效也同時產(chǎn)生)。
本發(fā)明的第四個目的是這樣實現(xiàn)的一種權(quán)利要求5所述的方法的抗球蟲藥物藥效評價方法，其特征在于以第二代球蟲裂殖體數(shù)量或/和球蟲卵囊數(shù)量為評價指標。采用兼顧球蟲第二代裂殖體數(shù)量和卵囊數(shù)量的原則，即以前者為第一指標，后者為第二指標；以第一指標判斷藥物對患雞治療的效果(第二代裂殖階段是造成雞只死亡的主要階段)，以第二指標判斷藥物對病源控制的效果(隨患雞糞便排出的卵囊是健康雞群的傳染源)。兼顧兩個指標就能對藥物的效果作出定量、準確的判斷。
本發(fā)明由于采用了添加了動物血清(尤其是雞血清)、胰島素、葉酸、維生素B6的α-MEM培養(yǎng)基，因此形成了對監(jiān)測、篩選抗球蟲藥物有良好效果的雞的球蟲體外細胞培養(yǎng)模型；又由于解決了不同類型抗球蟲藥物助溶劑的篩選與藥物投入時機的選擇使上述模型得到了完善。又由于成功地確定了球蟲第二代裂殖體數(shù)量與卵囊數(shù)量作為判斷藥物效果的指標，使上述模型的藥物評價、篩選得到定量化、精確化、標準化。
實施例1、用藥為離子載體型抗生素抗球蟲劑1、雞腎原代細胞團的制備在無菌狀態(tài)下，采集3-15天齡健康小雞腎臟，經(jīng)含0.25％胰蛋白酶的Hank s液消化兩次，第一次5分鐘，第二次15分鐘，收集第二次消化后且含一定細胞團的腎上皮細胞，用稀釋成每毫升1.5×105個細胞，置24孔培養(yǎng)板中在40℃，5％CO2條件下培養(yǎng)2.5-3天，待細胞覆蓋面積達70％時，進行接種。
2、無菌高純度高活力子孢子的制備E.tenella的孢子化卵囊溶液經(jīng)Clorox處理后，去除雜質(zhì)和腸組織，再用滅菌Hank’s液洗滌5次，再經(jīng)梯度離心收集純度高的卵囊。卵囊用0.5毫米直徑的玻璃珠擊打，釋放出孢子囊，孢子囊經(jīng)0.25％胰蛋白酶+0.75％TDCHank’s液，PH6.7，40℃消化40-60分鐘。子孢子脫囊率達80-95％后，采用G3玻璃漏斗過濾，去除雜質(zhì)及未孢子化卵囊、卵囊；最后采用2000r/min離心，收集足夠的純化子孢子供接種應(yīng)用。
3、α-MEM培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)培養(yǎng)基為α-MEM，添加成分為5％雞血清、0.005mg/ml葉酸、0.005mg/mlVitB6，培養(yǎng)條件為PH7.4。
4、藥物離子載體型抗生素抗球蟲劑。
5、助溶劑的篩選將無水乙醇、二甲基亞砜、Hank’s溶液三種類型的助溶劑多種分別對上述抗球蟲劑進行溶解試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無水乙醇助溶性能最好。
6、接種及投藥處理在配好的α-MEM培養(yǎng)基上進行子孢子的接種，同時投放上述抗球蟲劑及其助溶劑無水乙醇。
7、藥物效果評價及藥物篩選以用無水乙醇助溶的多種上述離子載體型抗生素抗球蟲劑分別對多個上述模型培養(yǎng)基進行上述接種、投藥，藥效充分發(fā)揮(即球蟲培養(yǎng)全期完成)之后，以模型培養(yǎng)基中所用藥物后第二裂殖體與卵囊的數(shù)量均最少的那種藥物的評價值為最高，從而篩選出該藥為該球蟲的用藥。
實施例2、用藥為非水溶性化學合成類抗球蟲劑選出二甲基亞砜為助溶劑，其余的與實施例1相同。
實施例3、用藥為水溶性抗球蟲劑選出Hank’s溶液為助溶劑，其余的與實施例1相同。
權(quán)利要求
1.一種雞的球蟲體外細胞培養(yǎng)模型，其包括在帶有雞腎細胞團組織的培養(yǎng)基上加入經(jīng)純化的球蟲子孢子，在雞體外培養(yǎng)球蟲第一、二代裂殖體，直至形成卵囊，其特征在于培養(yǎng)基的成份是在α-MEM培養(yǎng)基中加入動物血清3％-7％，溶液PH值為6.7-7.6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模型，其特征在于動物血清是雞的血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的模型，其特征在于加入微量胰島素及葉酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的模型，其特征在于加入維生素B6 0.003mg/ml至0.007mg/ml。
5.一種在權(quán)利要求1所述的模型上進行抗球蟲藥物篩選的方法，其特征在于加入抗球蟲藥物及其相應(yīng)的助溶劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于抗生素類抗球蟲藥物采用無水乙醇為助溶劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于非水溶性化學合成類抗球蟲藥物采用二甲基亞砜為助溶劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于水溶性抗球蟲藥物采用Hank’s液為助溶劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求5、6、7或8所述的方法，其特征在于抗球蟲藥物的投入與球蟲子孢子的接種同時進行。
10.一種權(quán)利要求5所述的方法的抗球蟲藥物藥效評價方法，其特征在于以第二代球蟲裂殖體數(shù)量或/和球蟲卵囊數(shù)量為評價指標。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于抗雞球蟲藥物的藥效評價及藥物篩選的生物組織培養(yǎng)模型及其具體應(yīng)用。本發(fā)明模型的主要技術(shù)特征在于:在傳統(tǒng)的α－MEM培養(yǎng)基上加入以動物血清為主,配以微量胰島素、葉酸、維生素B6組成。對藥物進行評價與篩選時,將球蟲的子孢子接種于培養(yǎng)基,同時加入抗球蟲藥物,以球蟲培養(yǎng)全期完成時第二代裂殖體數(shù)量及卵囊數(shù)量均最少為佳,篩選出針對性好的藥物。
文檔編號C12N5/06GK1309179SQ00114070
公開日2001年8月22日 申請日期2000年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月18日
發(fā)明者謝明權(quán), 張健騑, 吳惠賢, 謝宏料, 彭新宇, 魏文康 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所