專利名稱：增效蛋白在原核生物中的表達(dá)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在原核生物中表達(dá)粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白，含有粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的質(zhì)粒，用這種重組質(zhì)粒在原核生物中產(chǎn)生粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白的方法，以及表達(dá)的昆蟲病毒增效蛋白C末端截短蛋白在農(nóng)林業(yè)中的應(yīng)用。
現(xiàn)在已知，昆蟲病毒增效蛋白(enhancin)是由昆蟲病毒基因編碼能顯著提高病毒殺蟲活性的一種功能性蛋白質(zhì)。1998年，美國學(xué)者(Zhong，J.and R.R.Grandos1998.VIIth International Colloguium on Invertebrate Pathology and Microbial ControlIVth Internatiol Conference on Bacillus thuringensis.Ausgust 23-2865)已將粉紋夜蛾顆粒體病毒(Trichoplusia ni granulosis virus簡稱TnGV)增效蛋白基因克隆于核型多角體病毒AcNPV，構(gòu)建了重組病毒工程毒株，并用該毒株與野生型病毒混合使用，可顯著提高Tn的殺蟲效果。然而，這種工程病毒受到其宿主范圍及其毒力的影響，因此在應(yīng)用上有著局限。
本發(fā)明的目的是提供一種新型的含有粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的工程菌株，該菌株的構(gòu)建方法、用途以及用該茵株生產(chǎn)增效蛋白的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下一種工程菌株，E.coli M15(pQE-TnGVEnNp85)，該菌株含有攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的重組質(zhì)粒pQE-TnGVEnNp85，這種菌種命名為E.coli M15(pQE-TnGVEnNp85)，已于2000年5月17日保藏于湖北省武漢市武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記入冊號為CCTCC M200010，所含重組質(zhì)粒pQE-TnGVEnNp85由下列DNA元件組成(1)粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因；(2)大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)；(3)氨芐青霉素抗性基因；卡那霉素抗性基因；(4)六個連續(xù)組氨酸編碼區(qū)；本發(fā)明用于構(gòu)造工程菌株的原始材料有如下幾種(1)粉紋夜蛾顆粒體病毒(TnGV)，由美國湯姆·杰弗遜大學(xué)贈送。
(2)受體大腸桿菌E.coli M15菌株，購自QIA-GEN公司。
(3)pQE載體，購自Promega公司。
用來表達(dá)顆粒體病毒增效蛋白的重組質(zhì)粒通過基因工程方法獲得，其構(gòu)建方法是采用堿裂解酚提取法提取TnGV DNA，并經(jīng)HindIII消化用作模板，設(shè)計(jì)引物為P15’GAC TCT GCA GTA CAA AGT GAT 3’，P25’CGT GAA GCT TAA CTC GTTTTC 3’，由上海生工公司合成。
反應(yīng)條件模板DNA煮沸3min，迅速冷卻至0℃；反應(yīng)混合物94℃變性60S，50退火120S，73℃延伸180S，循環(huán)30次；終循環(huán)于73℃延伸7min。
用Pst I/HindIII雙酶切消化，得到截短的約2.1Kb片段，與pQE質(zhì)粒上用相同酶消化的切口，用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建pQE-TnGVNp85表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli M15菌株，經(jīng)篩選得到含TnGVC末端截短基因的工程菌株。該工程菌株定名為E.coli M15 pQE-TnGVNp85，已保藏于中國武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記號為CCTCC M200010。
將重組獲得的攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白的工程菌株CCTCC M200010單菌落挑到內(nèi)含100μg/ml的Amp(氨芐青霉素)和25μg/ml Kan(卡那霉素)的LB培養(yǎng)基中(25ml)，37℃，200rpm/min過夜培養(yǎng)，以1∶20比例接種到含上述雙抗500ml LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其濃度達(dá)到OD600＝0.7-0.9時，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)到終濃度1mM，于37℃，200rpm誘導(dǎo)表達(dá)5hr，收獲菌液，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，再按常規(guī)方法即可獲得TnGV病毒增效蛋白C末端截短蛋白。
利用攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的增效蛋白可作為有效成份提高病毒殺蟲劑，BT殺蟲劑，阿維菌素等生物殺蟲劑的殺蟲效果或單獨(dú)以乳劑方式用于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。
本發(fā)明提供了一種增效蛋白工程菌株Ecoll M15(pQE-TnGVNp85)，該菌株的用途和構(gòu)建方法，以及由此工程菌株生產(chǎn)粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白。該菌株含有TnGV增效蛋白全長基因，能在原核生物中復(fù)制，從而獲得增效蛋白，可作為有效成份提高病毒殺蟲劑，BT殺蟲劑，阿維菌素等生物殺蟲劑的殺蟲效果，可使害蟲死率明顯提高，半數(shù)致死時間也明顯減少。這種昆蟲病毒增效蛋白也可單獨(dú)以乳劑方式用于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。


圖1為構(gòu)建本發(fā)明的重組質(zhì)粒pQE-TnGVNp85示意圖。
以下結(jié)合附圖和具體的實(shí)施方案對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，這些實(shí)施方案無意于以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求所要求的范圍。(一)En-TnGV基因的PCR擴(kuò)增1.TnGV-DNA的提取取TnGV懸液100μL，加等體積0.04mol/L NaOH堿解液及終濃度為1％的SDS，56℃水浴處理10分鐘，待懸液半透明后，用堿性酚，酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1V∶V)混合液，氯仿∶異戊醇(24∶1V∶V)混合液抽提TnGV-DNA各一次，無水乙醇沉淀DNA，-20℃放置過夜，離心后用75％乙醇洗滌DNA沉淀，自然干燥，將DNA溶于TE(Tris·HCl 10mM，EDTA 1mM pH8.0)緩沖液，于4℃保存。
2.En-TnGV基因的PCR擴(kuò)增取TnGV-DNA 10uL，作10倍稀釋，取2μl，100℃煮6min立即冰浴，按B.M.公司Taq DNA Polymerase試劑(從棲熱水生菌YT-1中提純得到的耐熱的DNA多聚酶)操作手冊，并參見Sambrook等在“分子克隆”(實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港，1989)的方法，加入(1)10×PCR反應(yīng)緩沖液10μl，(2)兩引物各2μl，(3)10mmol/L dNTPs(脫氧核苷三磷酸)2μl，(4)Taq DNA polymerase(5U/μl)1μl，(5)補(bǔ)去離子水至100μl反應(yīng)體積，(6)加石蠟油覆蓋液面，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件93.5℃變性60s，50℃退火90s，72.5℃延伸180s，循環(huán)30次，最后一次循環(huán)在72.5℃延伸7min，經(jīng)電泳檢測，得到單一的長約2.9kb的En-TnGV基因全長DNA片段。
(二)En-TnGV基因PCR產(chǎn)物的回收低熔點(diǎn)瓊脂糖回收PCR擴(kuò)增的En-TnGV基因。用低熔點(diǎn)瓊脂糖制備0.7％的凝膠，將DNA樣品與加樣緩沖液(溴酚藍(lán)0.25％，蔗糖40％)混合，加入點(diǎn)樣孔，電泳結(jié)束后，在長波(256nm)紫外燈確定并切下2.1DNA帶，放入1.5ml離心管中，加入約5倍體積的20mmol/L Tris·Cl(三氨基甲的鹽酸鹽溶液)-1mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)(pH8.0)至瓊脂糖塊中，65℃溫育至凝膠塊熔化，加入等體積堿性酚，顛倒數(shù)次混勻后，8,000rpm離心10min，水相用酚∶氯仿∶異戊醇，氯仿∶異戊醇，氯仿∶異戊醇各抽提一次，再加入1/10體積3mol/L NaAc(pH5.2)及2倍體積無水乙醇，混勻后-20℃過夜，次日離心，棄上清，用75％乙醇洗滌DNA沉淀，室溫干燥后溶于適量TE緩沖液中，-20℃保存。
(三)Dot blot驗(yàn)證En-TnGV基因(1)En-TnGV基因探針的制備按DIG標(biāo)記及檢測試劑盒操作手冊，加1μgEn-TnGV基因PCR產(chǎn)物，補(bǔ)加滅菌雙蒸水至16μl，100℃煮沸10min，快速在冰NaCl冰浴，加4μl DIG-Hiigh Prime(地高辛標(biāo)記引物)，混勻，37℃放置1-20hr，最后65℃加熱10min終止反應(yīng)。
(2)去除未結(jié)合的DIG-dUTP(地高辛標(biāo)記的脫氧尿苷三磷酸)在上步處理樣品中，加無水冷乙醇(-20℃)80μl，混勻，-20℃放置2hr，12,000rpm離心15min，去上清，加50μl 75％乙醇洗沉淀，自然干燥，加50μl TE緩沖液溶解探針DNA。
(3)預(yù)雜交將TnGV-DNA基因組1μl，點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，室溫干燥后，在變性液(1.5mol/L NaCl-0.5mol/L NaOH)中處理5min，水中漂洗2min，復(fù)性液[1mol/L Tris·Cl(7.4)1.5mol/L NaCl]中處理5min，2×SSC液中漂洗2min，室溫晾干，80℃烘膜2hr備用，與探針DNA雜交。將干膜于5×SSC浸濕后，放到雜交袋中，按0.2ml/cm2的量加雜交液，封口并不留氣泡，68℃水浴2hr。
(4)DNA雜交將標(biāo)記好的探針DNA在沸水煮10min后，冰浴，加入雜交液(5×SSC1.5％Blocking reagent0.1％N-Laurol-sarco-sine0.02％SDS)中，混勻，剪開雜交袋，倒出雜交液，注入新的雜交液，重新封口并不留氣泡在袋內(nèi)，68℃保溫8-24hr。
(5)顯色從袋中取出膜，用洗滌液I(2×SSC 0.1％SDS)洗10min后，重復(fù)3次→再用洗滌液II(0.1×SSC 0.1％SDS)洗15min，重復(fù)2次→在bufl(0.1M馬來酸0.15MnaCl pH7.5)中洗5min→在buf2(含1.5％Blocking reagent的bufl)中輕搖30min→在buf2*，27℃，輕搖30min→用bufl洗15min，重復(fù)2次→在buf3中洗2min，放入20ml新配buf4，避光放置1-8hr，觀察結(jié)果，若出現(xiàn)合適的點(diǎn)就用TE緩沖液50ml沖洗5min。
(四)質(zhì)粒DNA的制備及DNA的限制性內(nèi)切酶消化使用常規(guī)技術(shù)(參見Sambrook等在“分子克隆”的方法，實(shí)驗(yàn)窒手冊，冷泉港，1989)培養(yǎng)細(xì)菌并分離質(zhì)粒DNA(1)細(xì)菌的生長和質(zhì)粒的擴(kuò)增從平板上挑取單菌落接種到含有氨共青霉素和卡那霉素抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)過夜，至培養(yǎng)物OD600達(dá)到0.6以上。
(2)快速提取質(zhì)粒DNA將培養(yǎng)物移至離心管中，8,000rpm離心5min棄上清，收集菌體，每5ml菌液的菌體加1ml STE(0.1MnaCl，10mM Tris·Cl pH8.0，1mMEDTA pH8.0)重懸，8,000rpm離心5min，棄上清，將沉淀重懸于200μl冷溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris·Cl pH8.0，10mMEDTA pH8.0)，加入400μl新鮮配制的溶液II
，緩慢顛倒數(shù)次置冰浴幾分鐘，另入300μl冷溶液III(5M醋酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml加蒸餾水至100ml)，倒置管溫和地振蕩10秒鐘混勻內(nèi)容物，置冰上5min，12,000rpm離心5min，吸取上清至另一干凈離心管，加等體積酚∶氯仿∶異戊醇充分混勻，12,000rpm離心2min，吸取水相至另一干凈離心管，加2倍體積的無水冷乙醇，混勻后室溫放置15min，12,000rpm離心10min，倒盡上清，用75％乙醇洗滌沉淀，12,000rpm離心5min后倒出乙醇，管倒置于紙巾上，使殘余乙醇揮發(fā)，加入50μl TE緩沖液溶解核酸沉淀。加入RNase A至終濃度20μg/ml，37℃放置1hr，以瓊脂糖凝膠電泳鑒定無RNA帶后加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇抽提，吸水相至另一干凈離心管，加入1/10體積3mol/L NaAc(pH5.2)，再加入2倍體積無水乙醇，混勻后置-20℃，1小時左右后，12,000rpm離心10min，核酸沉淀用75％乙醇洗滌，自然干燥后加TE緩沖液20uL，置-20℃保存。
(五)En-TnGV基因DNA片段的克隆1.En-TnGV基因PCR產(chǎn)物的磷酸化按Promega公司的T4噬菌體多核苷酸激酶操作手冊并參見Sambrook等在“分子克隆”，實(shí)驗(yàn)室手冊，(冷泉港，1989，)在滅菌的0.5ml離心管中(1)加入En-TnGV基因PCR產(chǎn)物1μg，(2)激酶10×緩沖液4μl，(3)0.1mM的ATP2μl(4)T4多核苷酸激酶10U，(5)補(bǔ)加去離子水至40μl，37℃水浴30min，加入2μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)。加40μl苯酚∶氯仿∶異戊醇振蕩1min，8,000rpm離心2min，再用氯仿∶異戊醇抽提1次，轉(zhuǎn)移上清水相至一干凈離心管，加入1/10體積3M乙酸鈉，2倍體積無水乙醇，混勻，置于-20℃過夜，12,000rpm離心20min，棄上清，自然干燥，重懸DNA于20uL TE緩沖液。
2.連接En-TnGV基因PCR產(chǎn)物到pQE質(zhì)粒按Promega公司的pGEM-T載體操作手冊并參見Sambrook等在“分子克隆”，實(shí)驗(yàn)窒手冊，(冷泉港，1989)，在已滅菌干凈的0.5ml離心管中，加入(1)10×T4 DNA連接酶緩沖液1μl，(2)50ng/μl的pQE載體，1μl，(3)約50ng的上述處理樣品DNA，(4)3 Weiss units/μl T4 DNA連接酶1μl，(5)補(bǔ)加去離子水至10μl，混勻后置4℃連接過夜。
3.大腸桿菌M15菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化從37℃培養(yǎng)16-20hr的新鮮LB平板中挑取E.coli M15單菌落，置3mlLB液體培養(yǎng)基試管中，37℃，200rpm培養(yǎng)過夜，再將菌液按1∶100比例接種于適量LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)約3hr(OD600＝0.3-0.4)，將菌液轉(zhuǎn)入1.5ml無菌離心管，置冰上10min，待培養(yǎng)物預(yù)冷至0℃時，4,000rpm離心10min，收集菌體，倒出培養(yǎng)液以0.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2重懸細(xì)胞，置冰上半小時后，4,000rpm離心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重懸細(xì)胞。所制成感受態(tài)細(xì)胞置4℃，并在12～24hr內(nèi)使用。
在100μl E.coli M15菌株感受態(tài)細(xì)胞中加入8uL待轉(zhuǎn)化的連接產(chǎn)物DNA(DNA≤50ng)，輕旋以混勻內(nèi)容物，置冰上30min，于42℃水浴中熱休克90s后，迅速移至冰浴中，待細(xì)胞冷卻1-2min后，每管加入900μl SOC培養(yǎng)液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，250mMKCl 10ml，5MnaOH調(diào)pH值至7.0，15磅20分鐘高壓滅菌。臨用前加入5ml已滅菌的2MMgCl2，20ml已滅菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm溫育45min，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布至含100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時后觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果。
(六)重組質(zhì)粒pQE-TnGVNp85的篩選(1)顯色平板在Amp+平板上涂布30μl X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-β-硫代半乳糖，X-gal20mg/ml溶于二甲基甲酰胺中)和10μl IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷100mg/ml)，待平板表面液體被完全吸收后，涂布轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌懸液，37℃放置約1hr，使平板吸收完菌液，再倒置培養(yǎng)12-16小時，白色菌落為陽性，藍(lán)色菌落為陰性。
(2)重組質(zhì)粒pQE-TnGVNp85的酶切鑒定將小量提取的重組質(zhì)粒pQE-TnGVNp85用限制性內(nèi)切酶EcoR I.HindIII和PstI和單酶切消化，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后觀察，通過與分子量比較DNA片段大小的方法進(jìn)一步鑒定。
(七)SDS-PAGE電泳分析表達(dá)質(zhì)粒中外源基因的表達(dá)1.凝膠的灌制參照參見Sambrook等在“分子克隆”(實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港，1989)的方法，配制8％的分離膠溶液15ml，依次混合各成分后加入催化劑TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混勻并灌膠，封一層0.1％SDS覆蓋液面，37℃下聚合30min。聚合完全后排凈凝膠上的液體，以同樣方法灌濃縮膠，插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡。
2.蛋白質(zhì)樣品的制備挑含待表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌M15[pREP4]單菌落在100μg/ml Amp，25μg/ml Kan的LB培養(yǎng)基中37℃過夜活化，然后以1∶20稀釋接種到含100μg/ml Amp，25μg/ml Kan的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其濃度達(dá)到OD600＝0.7～0.9時，取出未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌對照。加入IPTG至終濃度1mM，于42℃，200rpm培養(yǎng)30min后，降至37℃繼續(xù)搖床培養(yǎng)5hr后收獲細(xì)菌，4,000rpm離心10min，收集菌體沉淀，加入適量去離子水重懸菌體，置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.上樣及電泳在樣品中加等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，于100℃加熱3-5min變性，按順序加樣，最后在所有不用的加樣孔中加上等體積的加樣緩沖液，以100V電泳至溴酚蘭進(jìn)入分離膠，提高電壓至150V，當(dāng)溴酚蘭到達(dá)底部前約1cm處結(jié)束電泳(約需4hr)。
4.固定，染色和脫色剝膠后以5倍體積染液固定并染色過夜(至少4小時以上)，將凝膠浸泡于脫色液中平緩搖動4hr以上，其間更換脫色液3次，脫色完全后即可進(jìn)行觀察和照相。
(八)純化表達(dá)質(zhì)粒中目的基因表達(dá)產(chǎn)物1.目的基因的表達(dá)挑含待表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌M15[pREP4]單菌落在100μg/ml的Amp和25μg/mlKan的25ml LB培養(yǎng)基中37℃，200rpm過夜活化，然后以1∶20比例接種到含100μg/ml Amp和25μg/ml LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其濃度達(dá)到OD600＝0.7-0.9時，加入IPTG至終濃度1mM，于42℃，200rpm誘導(dǎo)表達(dá)30min后，降至37℃，繼續(xù)培養(yǎng)5hr，收獲菌液，4,000rpm離心10min，收集菌體沉淀，保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 2.確定目的基因表達(dá)產(chǎn)物的形式在細(xì)菌沉淀中加入2-5倍體積的聲波處理液，反復(fù)凍融3次，置于冰中用超聲波破碎細(xì)菌。置于光學(xué)顯微鏡高倍物鏡觀察，有大量晶體，然后置于電子顯微鏡下觀察，進(jìn)一步確定目的基因表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。
3.不溶性蛋白的變性純化把上述處理后的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)30％-60％蔗糖梯度離心，取出包涵體帶，洗糖三次，8,000rpm離心10min收集沉淀。每克沉淀重懸于5ml BufferB(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris·Cl，pH8.0)，在室溫中攪拌沉淀1hr，10,000rpm離心15min，收集上清，加入8ml 50％Ni-NTA樹脂(已在Buffer B中預(yù)平衡)，在室溫中攪45min，然后小心加到直徑為1.6柱中，用120ml Buffer B沖洗，至流液A280＜0.01，再用Buffer C(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris·Cl，pH6.3)沖洗至A280＜0.01，然后用10-20ml Buffer D(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris·Cl，pH5.9)洗脫重組蛋白質(zhì)，最后用10-20ml Buffer E(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris·Cl，pH4.5)洗脫，每3ml收集一管洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
(九)表達(dá)產(chǎn)物的生物活性測定1.TnGVNp85對HaNPV的增效活性HaNPV終濃度為1×104PIBs/ml(多角體)，pQE-TnGVNp85終濃度為1.6×106PIBs/ml(包涵體)，28℃下棉鈴蟲3齡幼蟲單頭飼于6孔Costar細(xì)胞培養(yǎng)器中每孔加適量人工飼料，并加25μl處理液于人工飼料表面，使之充分吸收，幼蟲取食48小時后補(bǔ)加足量新鮮人工飼料，記載死亡和存活蟲數(shù)。
2.pQE-TnGVNp85對Bt的增效活性Bt1∶200，取50μl初步純化的TnGVNp85包涵體，加150μl50mmol/LNa2CO3/HCl(pH9.5)，28℃堿解1小時；另取少量未堿解的TnGVNp85作平衡稀釋計(jì)數(shù)，使處理中TnGVNp85終濃度相當(dāng)于1.3×106Obs/ml；在Bt對照中補(bǔ)加等量的Na2CO3/HCl溶液，26℃下將棉鈴蟲2齡幼蟲單頭飼于24孔養(yǎng)蟲器中，每蟲加24μl處理液。72小時后統(tǒng)計(jì)死亡蟲數(shù)。
(十)增效蛋白與各種生物殺生劑混合使用的實(shí)施例1.對病毒增效實(shí)施例將蔗糖梯度離心純化的包涵體進(jìn)行稀釋[來源于E.coli M15(pQE-TnGVNp85)]，AcMNPV終濃度1×103PIBs/ml(多角體)，Np85終濃度1×104OBs/ml(包涵體)，28℃下將銀紋夜蛾3齡幼蟲單頭飼養(yǎng)于6孔Costar細(xì)胞培養(yǎng)皿中，皿孔加適量人工飼料，并加入25μl上述各種處理液于人工飼料表面，使其充分吸收，幼蟲食48小時后外加足量新鮮的人工飼料，統(tǒng)計(jì)死亡和存活蟲數(shù)(結(jié)果見表)。
表1 Np85對AcMNPV感染銀紋夜蛾3齡幼蟲的增效活性

結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組的LT50比對照組減少3天，較正死亡率提高39.6％2.對Bt增效實(shí)施例將Bt菌粉(16000IU/mg)作1∶1000，1∶2000，1∶4000倍比稀釋成三個不同濃度，人工飼料添食感染2齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，2個重復(fù)，同時設(shè)立正常對照。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，求得Bt對2齡棉鈴蟲幼蟲，致死中濃度為LC50為0.652g/L取致死中濃度Bt稀釋液與1×104OBs/ml Np85復(fù)配，人工飼料添食感染2齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，2個重復(fù)，同時設(shè)立單獨(dú)Bt對照，結(jié)果，試驗(yàn)組比對照組提高Bt對棉鈴蟲幼蟲死亡率為33.1％.
3.對阿維菌素實(shí)施例將阿維菌素(1.8％乳油)作1∶3000，1∶6000，1∶12000倍比稀釋成三個不同濃度，人工飼料添食喂養(yǎng)4齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，2個重復(fù)，同時設(shè)立正常對照，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，求得阿維菌素(1.8％乳油)對老齡棉鈴蟲幼蟲致死中濃度LD50為1∶5800，取致死中濃度阿維菌素稀釋液與1×104OBs/ml Np85復(fù)配，人工飼料添食喂養(yǎng)4齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，2個重復(fù)，同時設(shè)立單獨(dú)阿維菌素對照，結(jié)果，試驗(yàn)組比對照組提高阿維菌素對棉鈴蟲老齡幼蟲死亡率為27.2％。
權(quán)利要求
1.一種工程菌株E.ColiM15(pQE-TnGVNp85)，該工程菌株已提交到中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號為CCTCC M200010。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌株，其特征在于這種菌株含粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因，并能在原核生物細(xì)胞中復(fù)制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌株，其特征在于它所含的重組表達(dá)載體是由下列DNA元件構(gòu)成(1).粉紋夜蛾昆蟲病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因；(2).大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)；(3).氨芐青霉素抗性基因；(4)六個連續(xù)組氨酸編碼區(qū)。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3所述的工程菌株的方法，其特征在于以TnGV基因組DNA作模板，設(shè)計(jì)引物P15’GAC TCT GCA GTA CAA AGT GAT 3’P25’CGT GAA GCT TAA CTC GTT TTC 3’，用Pst I/HindIII雙酶切消化，得到截短的～2.1Kb片段，與pQE質(zhì)粒上用相同酶消化的切口連接，構(gòu)建pQE-TnGVNp85表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliM15菌株，經(jīng)篩選得到含粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的工程菌株。
5.一種用權(quán)利要求1-3所述的工程菌株生產(chǎn)粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白的方法，其特征在于將重組獲得的攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白的工程菌株CCTCC M200010單菌落挑到內(nèi)含100μg/ml的氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm/min過夜培養(yǎng)，以1∶20比例接種到含上述雙抗500mlLB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其濃度達(dá)到OD600＝0.7-0.9時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度1mM，于37℃，200rpm誘導(dǎo)表達(dá)5hr，收獲菌液，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，再按常規(guī)方法即可獲得昆蟲病毒增效蛋白質(zhì)C末端截短蛋白。
6.權(quán)利要求1-3所述的工程菌株與昆蟲病毒、蘇蕓金芽胞桿菌、阿維菌素或其它生物殺蟲劑制備成復(fù)合生物殺蟲劑在農(nóng)林業(yè)用于病蟲的生物防治，或單獨(dú)使用增效工程蛋白用于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉防治棉鈴蟲。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過基因工程手段構(gòu)建工程菌株:CTCC M200010 E.Coli M15 (pQE－TnGVNp85)、工程菌株的構(gòu)建方法和工程菌株的用途。該菌株是以粉紋夜蛾顆粒體病毒(TnGV)為模板,PCR法產(chǎn)生TnGV增效蛋白基因,并構(gòu)建含TnGV增效蛋白的C末端截短基因的表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化E.Coli M15菌株所得。它攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白全基因,并能夠在原核生物中表達(dá),從而獲得粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白。
文檔編號C12N15/70GK1331286SQ0011466
公開日2002年1月16日 申請日期2000年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月30日
發(fā)明者孟小林, 徐進(jìn)平 申請人:武漢大學(xué)