專利名稱：一種構建蘇云金芽胞桿菌殺蟲工程菌的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蘇云金芽胞桿菌殺蟲工程菌的構建方法領域，與微生物農藥基因工程方法有關。
蘇云金芽胞桿菌是目前世界上應用范圍最廣泛的微生物殺蟲劑。最初都是使用篩選的野生型菌株進行生產，隨著分子生物學的發(fā)展，人們逐漸利用基因工程的手段對野生型菌株進行改造，如Ecogen公司利用結合轉移的方法，將菌株EG2158中攜帶殺鞘翅目昆蟲毒素基因cry3A基因的88Mda質粒轉入HD-263-8，所得到的新菌株EG2421帶有含cry3A基因的88MDa質粒及本身帶有的60MDa質粒上存在的crylAc基因。90年代，隨著電脈沖技術的成熟，人們可以直接將含有目的基因的質粒直接轉入野生型菌株。1995年，Ecogen公司注冊了以工程菌EG7673為生產菌株的生物殺蟲劑RAVEN，它含多拷貝重組cry3Ba基因質粒，能夠產生異常高水平的Cry3殺蟲晶體蛋白。
目前，國內外大多利用通過增加某種殺蟲晶體蛋白基因的拷貝數(shù)來提高蛋白產量，但試驗表明，蘇云金芽胞桿菌細胞中殺蟲晶體蛋白基因的拷貝數(shù)有一最大閾值，超過此值，蛋白的合成不再增加，而且蘇云金桿菌的高毒力原于各種不同cry基因的協(xié)同作用，某種基因過量表達將抑制其它基因的正常表達。利用輔助蛋白的作用即可提高基因的表達，又不會在轉錄水平影響其它基因的表達。因此，現(xiàn)有的方法所構建的工程菌殺蟲效率和生產成本都有待進一步提高。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術之不足，利用幫助蛋白構建一種蘇云金芽胞殺蟲工程菌，以提高其殺蟲晶體蛋白的表達量，促進晶體形成，提高殺蟲效率，降低生產成本。
本發(fā)明通過以下技術方案實施一種蘇云金芽胞桿菌殺蟲工程菌的構建方法，其過程包括PCR，其步驟包括1)從蘇云金芽胞桿菌以色列亞種中克隆出p19、p20兩個與野生型菌株的基因型一的輔助蛋白基因；2)將輔助基因進行限制性內切酶酶切，并連接到如穿梭質粒或解離載體上，使輔助基因能夠在蘇云金芽胞桿菌中正常表達；3)將含p19、p20的穿梭質粒分別電轉化入野生型菌株；4)通過質粒圖譜、PCR、Southern雜交和聚丙烯酰氨凝膠電泳篩選、鑒定轉化子；5)通過搖瓶培養(yǎng)、生物測定篩選發(fā)酵性能優(yōu)良、毒力高的轉化子。所述的含p19、p20的穿梭質粒及p19、p20基因與cry基因的穿梭質粒分別電轉化入野生型菌株的方法包括以272mM蔗糖，15％甘油配制的溶液作為緩沖液，在0.4cm電脈沖杯中置50-80μl感受態(tài)細胞，加入質粒5μl(約1μl)。電脈沖采用25μF，200Ω，6.25-9KV/cm的條件電擊一次。
所述的通過質粒圖譜、PCR、Southern雜交(DNA-DNA雜交)及聚丙烯酰氮凝膠電泳進行轉化子的篩選與鑒定步驟包括以1％D蛋白棟，0.5％酵母粉，1％NaCl，pH7的培養(yǎng)液過夜培養(yǎng)活化菌種，再用活化菌液接種(1/100)LB培養(yǎng)液。待菌體生長至對數(shù)中期，收集菌體，TE(10mM Tris·Cl，1mMEDTA，pH8.0)洗菌一次。菌體懸于100μl溶液I(50mMGlucose，25mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA)，加入5-10μl溶菌酶(20mg/ml)，以后的操作按堿法質粒抽提進行。
所述的大腸桿菌的質粒抽提沿用常規(guī)的方法。
所述的PCR的條件是94℃1分鐘，49℃1分鐘，72℃1分鐘，25個循環(huán)。
所述的(DNA-DNA雜交方法包括質粒電泳采用0.55％瓊脂糖凝膠，雜交膜使用硝酸纖維素膜(Hybond)，具體轉膜步驟和雜交及顯色按常規(guī)方法。
所述的聚丙烯酰氨凝膠電泳方法包括L8培養(yǎng)基發(fā)酵液200μl離心，沉淀用1MNaCl和無菌水各洗兩次，沉淀物再懸于1ml無菌水中，取100μl與等量上樣緩沖(2×)混合，沸水中處理3分鐘，取10-20μ1點樣電泳，溶液配制及其它具體操作按常規(guī)方法。
所述的搖瓶培養(yǎng)、生物測定篩選發(fā)酵性能優(yōu)良、毒力高的轉化子的步驟包括生物測定的的培養(yǎng)基配方為黃豆餅粉4％，玉米淀粉2％，魚粉1％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.2％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O0.07％，CaCO30.2％，此為L8培養(yǎng)基。
小菜蛾和棉鈴蟲的生測方法按常規(guī)方法。甜菜夜蛾生測方法按常規(guī)方法。但在感染飼料配方上調整為，將防腐劑由尼泊金，甲醛等換成醋酸(終濃度0.005％)。觀察時間改為72小時。
所述的菌株發(fā)酵培養(yǎng)基配方為碳源5.0％、氮源A4.0％、氮源B2.0％、氮源C0.2％、生長因子0.1％、KH2PO40.2％、CaCO30.2％。將上述培養(yǎng)基裝量于20ml/500ml三角瓶，pH值7.0，接種量1％。
所述的培養(yǎng)條件為在30℃下培養(yǎng)按以上培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基在同一條件下比較，本發(fā)明的培養(yǎng)基發(fā)酵效價達4000IU/μl以上，比對照培養(yǎng)基提高了8.7％。
本發(fā)明具有以下積極的效果(1)由于輔助基因可以解決菌株的高表達問題，本發(fā)明利用輔助基因構建了一系列的蘇云金芽胞桿菌殺蟲工程菌，如BMB21882、BMB15358、BMB83383、YBT803-1-19，表明發(fā)明在構建工程菌的過程中切實可行，重復性好。經繼代培養(yǎng)，輔助基因能夠在工程菌中穩(wěn)定存在，表達正常，對受體菌的生長無重大影響。
(2)利用p20構建的防治棉花和蔬菜害蟲高效蘇云金芽胞桿菌工程菌WG-001，其田間防治小菜蛾效果比美國Abbott公司產品Dipel提高2.65倍，比化學農藥20％速滅殺丁EC提高3.1倍，防治效果達85％-90％。對棉鈴蟲的防治效果比Dipel提高20％，與40％的甲胺磷的800倍稀釋液的毒力相當，防效在80％-91％。
(3)上述幾個不同的工程菌的LC50值均有大幅度地提高。
以下結合圖表和實施例對本發(fā)明作進一步地說明本發(fā)明中p19幫助蛋白對野生菌株表達的影響表1 受體菌YBT803-1和轉化子YBT803-1-19對小菜蛾的毒力
本發(fā)明中p20幫助蛋白對野生型菌株的影響表2 天然菌株及其pBMB1808轉化子伴胞晶體的大小菌株/stainYBT1520BMB21882 YBT1535 BMB15358 YBT833 BMB83383長/Length 1.852.45 1.76 2.34 1.87 2.39寬/Width 0.8 1.06 0.75 1.12 0.80 0.95長/寬L/W 2.31∶1 2.31∶12.35∶1 2.01∶1 2.34∶1 2.51∶1體積/V 0.390.92 0.33 0.98 0.24 0.72*每種樣品隨機測量30個晶體；長度單位為μm，體積單位為μm3。*pBMB1808是含有p20基因的解離載體。*BMB21882、BMB15358、BMB83383分別是野生型菌株YBT1520、YBT1535、YBT833的含有pBMB1808的轉化子。
表3天然菌株及其pBMB1808轉化子對小菜蛾的毒力菌株/strain 回歸方程LC50RYBT1520y＝5.87＋1.43X 0.249 0.96BMB21882 y＝5.60＋0.84X 0.210 0.95YBT1535y＝6.14＋1.72X 0.214 0.97BMB15358 y＝5.84＋1.32X 0.229 0.99YBT833 y＝6.80＋2.50X 0.247 0.95BMB83383 y＝5.66＋1.45X 0.339 0.92*供試幼蟲為三齡小菜蛾，供試樣品為洗滌過的PM培養(yǎng)物的胞晶混合物。感染48h后統(tǒng)計死亡率。LC50單位為μl/ml，指每ml中所含發(fā)酵液的μl數(shù)。
表4 天然菌株及其pBMB1808轉化子對棉鈴蟲的毒力/strain 回歸方程 LC50RYBT1520y＝3.58＋1.14X 2.941 0.97BMB21882 y＝4.12＋0.56X 40.0000.94YBT1535y＝4.33＋1.71X 2.457 0.97BMB15358 y＝4.03＋0.57X 52.6310.97YBT833 y＝4.28＋1.44X 3.086 0.94BMB83383 y＝4.00＋0.89X 12.5000.91*供試幼蟲為初孵棉鈴蟲，供試樣品為洗滌過的PM培養(yǎng)物的胞晶混合物。感染72h后統(tǒng)計死亡率。三次重復；LC50單位為μl/ml，指每ml中所含發(fā)酵液的μl數(shù)。
權利要求
1.一種構建蘇云金芽胞桿菌殺蟲工程菌的方法，其過程包括PCR，其特征在于所述的步驟包括1)從蘇云金芽胞桿菌以色列亞種中克隆出p19、p20兩個與野生型菌株的基因型一致的輔助蛋白基因；2)將輔助基因進行限制性內切酶酶切，并連接到適當?shù)妮d體上，使輔助基因能夠在蘇云金芽胞桿菌中正常表達；3)將含p19、p20的穿梭質粒分別電轉化入野生型菌株；4)通過質粒圖譜、PCR、DNA-DNA雜交和聚丙烯酰氨凝膠電泳篩選、鑒定轉化子；5)通過搖瓶培養(yǎng)、生物測定篩選發(fā)酵性能優(yōu)良、毒力高的轉化子。
1.根據(jù)權利要求1所述的一種構建蘇云金芽胞桿菌殺蟲工程菌的方法，其特征在于步驟3)所述的方法包括以272mM蔗糖，15％甘油配制的溶液作為緩沖液，在0.4cm電脈沖杯中置50-80μl感受態(tài)細胞，加入質粒5μl，采在25μF，200Ω，6.25-9KV/cm的電脈沖條件下電擊一次。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種構建蘇云金芽胞桿菌殺蟲工程菌的方法，其特征在于步驟4)所述的方法包括以1％D蛋白棟，0.5％酵母粉，1％NaCl，pH7.的培養(yǎng)液過夜培養(yǎng)活化菌種，再用活化菌液接種(1/100)LB培養(yǎng)液。待菌體生長至對數(shù)中期，收集菌體，TE(10mM Tris·Cl，1mMEDTA，pH8.0)洗菌一次，菌體懸于100μl溶液I(50mMGlucose，25mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA)，加入5-10μl溶菌酶(20mg/ml)，以后的操作按堿法質粒抽提進行。
4.根據(jù)權利要求4所述的一種構建蘇云金芽胞桿菌殺蟲工程菌的方法，其特征在于該步驟中的PCR的條件是94℃1分鐘，49℃1分鐘，72℃1分鐘，25個循環(huán)。
6.根據(jù)權利要求1所述的種蘇云金芽胞桿菌殺蟲工程菌的構建方法，其特征在于所述步驟5)中的生物測定采用的培養(yǎng)基配方為黃豆餅粉4、玉米淀粉2％，魚粉1％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.2、KH2PO40.1、MgSO4·7H2O0.07％，CaCO30.2％。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種構建蘇云金芽胞桿菌殺蟲工程菌的方法，其特征在于所述的步驟5)中的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為碳源5.0％、氮源A4.0％、氮源B2.0％、氮源C0.2％、生長因子0.1％、KH2PO40.2％、CaCO30.2％。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物殺蟲農藥技術領域,具體涉及一種構建蘇云金芽胞桿菌殺蟲工程菌的方法,其特點是,利用PCR技術從蘇云金芽胞以色列亞種中克隆p19,p20兩個輔助蛋白基因,通過基因工程方法構建具有特異毒力的工程菌,與已有技術相比,本發(fā)明提高了蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白的表達量,促進了晶體的形成,提高了殺蟲效率,降低了生產成本。
文檔編號C12N15/75GK1337466SQ0011595
公開日2002年2月27日 申請日期2000年8月15日 優(yōu)先權日2000年8月15日
發(fā)明者喻子牛, 劉子鐸, 孫明, 邵宗澤, 徐世瑾, 江昊, 鄭嶸 申請人:華中農業(yè)大學