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      一種人核受體結(jié)合因子蛋白及其編碼序列的制作方法

      文檔序號(hào):560854閱讀:247來源:國(guó)知局

      專利名稱::一種人核受體結(jié)合因子蛋白及其編碼序列的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      :本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、酶學(xué)、生理學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域。具體地,本發(fā)明涉及一種在人類樹突狀細(xì)胞中表達(dá)的hNRBF2蛋白及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。核受體是在核內(nèi)的一些受體,通過與特定的激動(dòng)劑(配體)結(jié)合后觸發(fā)某些調(diào)控元件,調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄過程。在核受體與配體結(jié)合時(shí),有可能需要一些特殊蛋白的參與,即核受體結(jié)合因子蛋白(nuclearreceptorbindingfactor,NRBF)。目前人們已經(jīng)找到了兩個(gè)核受體結(jié)合因子蛋白,分別為NRBF1和NRBF2。(Gene1998Oct23;221(2)225-33),(BiochimBiophysActa2000Jan31;1490(1-2)189-97)。本發(fā)明中,我們?cè)谌祟悩渫粻罴?xì)胞中克隆到挪威鼠NRBF2基因的同源基因hNRBF2。在本發(fā)明被公布之前,尚未有任何公開或報(bào)道過本專利申請(qǐng)中提及的人類hNRBF2蛋白序列及其核酸序列。本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的人基因hNRBF2(GenbankAccessionNo.AF267866),該基因是一個(gè)人hNRBF2蛋白基因。本發(fā)明的第二目的是提供一種新的人蛋白hNRBF2。本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人hNRBF2蛋白和核酸序列的方法。本發(fā)明還提供了這種人hNRBF2蛋白多肽和編碼序列的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)方面,提供了一種分離出的DNA分子,該分子包括編碼具有人hNRBF2蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列,所述的核苷酸序列與SEQIDNO.6中從核苷酸第153-986位DNA分子的核苷酸序列有至少70%的同源性或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO.6中從核苷酸第153-986位的核苷酸序列雜交。較佳地,所述的序列編碼具有SEQIDNO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地,所述的序列具有SEQIDNO.6中從核苷酸第153-986位的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面,提供了一種分離出的人hNRBF2蛋白質(zhì)多肽,它包括具有SEQIDNO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段,或其活性衍生物。較佳地,該多肽是具有SEQIDNO.7序列的多肽。在本發(fā)明的另一方面,還提供了一種載體,它包含上述的DNA分子。在本發(fā)明的另一方面,還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中該宿主細(xì)胞是大腸桿菌;在另一實(shí)例中,該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面,還提供了一種產(chǎn)生具有人hNRBF2蛋白質(zhì)活性的多肽的方法,其步驟如下(1)將編碼具有人hNRBF2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列,形成人hNRBF2蛋白表達(dá)載體,所述的核苷酸序列與SEQIDNO.6中從核苷酸第153-986位的核苷酸序列有至少70%的同源性;(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞,形成人hNRBF2蛋白的重組細(xì)胞;(3)在適合表達(dá)人hNRBF2蛋白多肽的條件下,培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞;(4)分離出具有人hNRBF2蛋白活性的多肽。較佳地,在該方法中使用的核酸序列具有SEQIDNO.6中第153-986位的序列。本發(fā)明還提供了與hNRBF2蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。在本發(fā)明中,“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指,該DNA或片段己從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來,還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開,而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中,術(shù)語“人hNRBF2蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人hNRBF2蛋白活性的多肽的核苷酸序列,如SEQIDNO.6中第153-986位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指,位于SEQIDNO.6序列的編碼框第153-986位核苷酸中,有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性,所以與SEQIDNO.6中第153-986位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQIDNO.7所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下,更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO.6中從核苷酸第153-986位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQIDNO.6中從核苷酸第153-986位的核苷酸序列的同源性至少70%,較佳地至少80%,更佳地至少90%,最佳地至少95%的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的人hNRBF2相同功能的蛋白的、SEQIDNO.6中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè),較佳地1-60個(gè),更佳地1-20個(gè),最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代,以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi),較佳地為30個(gè)以內(nèi),更佳地為10個(gè)以內(nèi),最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中,“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20%,較佳地至少50%,更佳地至少80%,最佳地至少90%(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量,如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。在本發(fā)明中,術(shù)語“人hNRBF2蛋白或多肽”指具有人hNRBF2蛋白活性的SEQIDNO.7序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然人hNRBF2相同功能的、SEQIDNO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè),較佳地1-30個(gè),更佳地1-20個(gè),最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi),較佳地為10個(gè)以內(nèi),更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如,在本領(lǐng)域中,用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí),通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人hNRBF2蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的人hNRBF2多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人hNRBF2DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人hNRBF2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽,如包含人hNRBF2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外,本發(fā)明還包括人hNRBF2多肽的可溶性片段。通常,該片段具有人hNRBF2多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸,通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸,較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸,更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸,最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。在本發(fā)明中,“人hNRBF2保守性變異多肽”指與SEQIDNO.7的氨基酸序列相比,有至多10個(gè),較佳地至多8個(gè),更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表1<tablesid="table1"num="001"><table>最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val;Leu;IleValArg(R)Lys;Gln;AsnLysAsn(N)Gln;His;Lys;ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSer</table></tables>發(fā)明還包括人hNRBF2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人hNRBF2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異,也可以是不影響序列的修飾形式上的差異,或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到,如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變,還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解,本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?;螋然?。修飾還包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸,磷酸絲氨酸,磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中,可選用本領(lǐng)域已知的各種載體,如市售的載體,包括質(zhì)粒,粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的人hNRBF2多肽時(shí),可以將人hNRBF2編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列,從而形成人hNRBF2蛋白表達(dá)載體。如本文所用,“可操作地連于”指這樣一種狀況,即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如,如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌,那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄,那么它是可操作地連于編碼序列;如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí),那么它是可操作地連于編碼序列。一般,“可操作地連于”意味著相鄰,而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中,術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地,該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞,如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。本發(fā)明還提供了對(duì)人hNRBF2特異性結(jié)合的抗體,包括多克隆抗體和單克隆抗體。在本發(fā)明中,可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對(duì)人hNRBF2特異的抗體。例如,將提純的人hNRBF2基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣,表達(dá)人hNRBF2或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對(duì)動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體,這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)制備(例如,Kohleretal.,Nature256495,1975;Kohleretal.,Eur.J.Immunol.6∶511,1976;Kohleretal.,Eur.J.Immunol.6292,1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑人hNRBF2功能的抗體,也可以是不影響人hNRBF2功能的抗體。每一類抗體都可以通過對(duì)人hNRBF2基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生,而人hNRBF2基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的人hNRBF2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體,可以通過用在原核細(xì)胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結(jié)合的抗體,可以通過用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的來免疫動(dòng)物而得到。本發(fā)明的人hNRBF2抗體可以用來鑒定表達(dá)人hNRBF2蛋白或多肽的細(xì)胞,如JurkatT細(xì)胞。例如,可以用一種可檢測(cè)的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來標(biāo)記人hNRBF2特異抗體,然后讓人hNRBF2特異抗體與細(xì)胞樣品接觸,再用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)出與人hNRBF2特異抗體結(jié)合的細(xì)胞。除了在細(xì)胞表面檢測(cè)人hNRBF2外,還可以用Western印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解液可以從培養(yǎng)細(xì)胞或取自病人的組織標(biāo)本如樹突狀細(xì)胞中提取,并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞提取物(同時(shí)將提純的人hNRBF2多肽作為陽(yáng)性對(duì)照),接著通過電泳雜交將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測(cè)人hNRBF2多肽,可以使用典型的抗體結(jié)合檢測(cè)方法,例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測(cè)方法。并可使用免疫接種血清或不相關(guān)的單克隆抗體作為非特異反應(yīng)的對(duì)照。還可用Nothern印跡法技術(shù)分析人hNRBF2基因產(chǎn)物的表達(dá),即分析人hNRBF2的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。人hNRBF2DNA的Nothern印跡分析和人hNRBF2特異抗體的Western印跡分析可以聯(lián)合使用,以證實(shí)人hNRBF2在生物樣本中的表達(dá)。人hNRBF2DNA還可以用于Southern印跡分析或原位雜交分析,以將該基因定位于染色體上,并可進(jìn)行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關(guān)基因。此外,本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子,該分子通常具有人hNRBF2核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸,較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼人hNRBF2的核酸分子。本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中是否存在人hNRBF2核苷酸序列的方法,它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交,然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地,該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物,其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于人hNRBF2核苷酸編碼序列,并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。此外,根據(jù)本發(fā)明的人hNRBF2核苷酸序列和氨基酸序列,可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上,篩選人hNRBF2同源基因或同源蛋白。為了得到與人hNRBF2基因相關(guān)的人cDNAs或基因組DNAs的點(diǎn)陣,可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫(kù),這些探針是在低嚴(yán)緊條件下,用32P對(duì)人hNRBF2的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來自人樹突狀細(xì)胞的文庫(kù)。來自參與內(nèi)分泌的其它人體組織或特定人體細(xì)胞株的cDNA文庫(kù)也可用于篩選目的。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外,許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買到,例如購(gòu)自Clontech,PaloAlto,Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與人hNRBF2相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。根據(jù)核苷酸相似性篩選人hNRBF2同源物可以按如下方法完成。人體樹突狀細(xì)胞cDNA文庫(kù),例如ClontechCat.#74XX(Clontech,PaloAlto,Cal.)可以使用一段包含人hNRBF2基因序列的全部或部分的隨機(jī)引物化DNA探針篩選。要完成對(duì)與人hNRBF2序列至少有70%同源性的DNA插入序列的克隆的鑒定,可以使用雜交溫度為55℃的雜交液,然后用0.5×SSC和O.1%SDS清洗。用這種方法識(shí)別的克隆的DNA插入序列可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序來評(píng)價(jià)它與人hNRBF2基因的相似性。組織表達(dá)的分布可以用上述的Northern印跡法技術(shù)分析。人hNRBF2同源物也可以用針對(duì)人hNRBF2蛋白或多肽的抗體來識(shí)別。例如,可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)商品化的或者用已知方法構(gòu)建的,來自細(xì)胞或者組織例如樹突狀細(xì)胞的表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選。將文庫(kù)倒入平皿,菌落轉(zhuǎn)移到一張硝化纖維素膜上,使表達(dá)的重組蛋白結(jié)合到膜上。然后就可以用特異性的人hNRBF2抗體進(jìn)行典型的抗體結(jié)合和檢測(cè)。用這種方法所識(shí)別出克隆中的DNA插入序列,可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序進(jìn)行分析以評(píng)價(jià)它與人hNRBF2基因的相似性。新識(shí)別的基因的組織表達(dá)分布可以同樣地按上述方法進(jìn)行分析。本發(fā)明的人hNRBF2核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通??梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法,可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列,尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物,并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板,擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí),常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增,然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列,就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體,再轉(zhuǎn)入細(xì)胞,然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外,還可用人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請(qǐng)之前,現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過先合成多個(gè)多核苷酸小片段,然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明人hNRBF2蛋白的核酸序列。然后,可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外,還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外,本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù),通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人,(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如,可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity,CA)來自動(dòng)合成肽??梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段,然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。本發(fā)明蛋白的編碼序列可用于基因定位。例如,通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH),將cDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交,可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA;也可以使用長(zhǎng)至約2000bp或者更長(zhǎng)的cDNA。對(duì)于該技術(shù),可參見Verma等人,HumanChromosomesAManualofBasicTechniques,PergamonPress,NewYork(1988)。一旦序列被定位于染色體上的某個(gè)精確位置,將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的,例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(可通過JohnsHopkinsUniversityWelchMedicalLibrary在網(wǎng)上獲得)。然后,通過連鎖分析來鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。接著,有必要確定患病個(gè)體和健康個(gè)體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個(gè)體但不存在于正常個(gè)體,那么該突變可能就是該疾病的致病因素。利用本發(fā)明的人hNRBF2蛋白,通過各種常規(guī)篩選方法,可篩選出與人hNRBF2發(fā)生相互作用的物質(zhì),或者受體、抑制劑或拮抗劑等。本發(fā)明人hNRBF2蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等,當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí),可提供不同的效果。通常,可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中,其中pH通常為約5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥,其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。以本發(fā)明的人hNRBF2蛋白為例,可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人hNRBF2蛋白可以被制成針劑形式,例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物,可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?;钚猿煞值慕o藥量是治療有效量,例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外,本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。當(dāng)本發(fā)明的人hNRBF2蛋白多肽被用作藥物時(shí),可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動(dòng)物,其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重,而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重,較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然,具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素,這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。表2為本發(fā)明的人hNRBF2蛋白與挪威鼠NRBF2蛋白的核苷酸序列(GenBankAccessionNo.AB024930)的同源比較(FASTA)表。表3為本發(fā)明的人hNRBF2蛋白與挪威鼠NRBF2蛋白的氨基酸序列(GenPeptAccessionNo.BAA88955)的同源比較(FASTA)表。其中,相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出,相似的氨基酸用“+”標(biāo)出。下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1人hNRBF2基因的克隆1.組織分離(樹突狀細(xì)胞isolation)樹突狀細(xì)胞來源于5個(gè)正常成年男性供體,在死后四小時(shí)內(nèi)取出樹突狀細(xì)胞,立即置于液氮中冷凍保存。2.mRNA的分離(mRNAisolation)取出組織,用研缽研碎,加入盛有裂解液的50ml管,充分振蕩后,再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管,抽提總RNA(TRIzolReagents,Gibco,NY,USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligod(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA,定量。3.cDNA文庫(kù)的構(gòu)建(ConstructionofcDNAlibrary)以mRNA為模板,合成雙鏈cDNA,反轉(zhuǎn)錄引物見SEQIDNO.1。補(bǔ)平末端后,加含EcoRⅠ切點(diǎn)的接頭,接頭序列分別見SEQIDNO.2和3。磷酸化EcoRⅠ末端后,用XhoⅠ限制性內(nèi)切酶消化1.5小時(shí),再進(jìn)行片段分離。過柱篩選長(zhǎng)度>500bp的片段,用酚-氯仿抽提,乙醇沉淀,無菌水溶解,連接至Uni-ZAPXR載體(Stratagene,CA9203,USA),以Zap-cDNAGigapackⅢGoldCloningKit(Stratagene,CA9203,USA)進(jìn)行包裝,宿主菌使用XL1-BlueMRF(Stratagene,CA9203,USA)細(xì)菌。涂板并測(cè)定滴度。4.測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)建立(SeqencingandDatabaseConstructing)挑選文庫(kù)中有外源片段插入的克隆,擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(Qiagen,Germany),用T3和T7作為3’端和5’端的通用引物,采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye,Perkin-Elmer.USA)的方法,在ABI377測(cè)序儀(Perkin-Elmer,USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列,傳輸?shù)絊UNUltra450Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL),將無同源性或同源性低于95%的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫(kù)。5.基因的全長(zhǎng)克隆(CloningofFull-lengthcDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上,進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆,分兩階段進(jìn)行(1)“電子克隆”(ElectronicCloning)以新基因片段序列作為探針?biāo)褜bEST數(shù)據(jù)庫(kù),將重疊序列>50bp,同源性在98%以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(ExpressedSequenceTag,簡(jiǎn)稱“EST”)序列認(rèn)為同一序列(consensussequence),取出并用AUTOASSEMBLER軟件進(jìn)行拼接,部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(OpenReadingFrame,ORF),用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性,以幫助判別所得到的基因全長(zhǎng)完整性如何。通過電子克隆的方法,通??色@取人hNRBF2基因的全長(zhǎng)序列。(2)cDNA末端快速擴(kuò)增(RapidAmplificationofcDNAEnds,RACE)如果通過“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長(zhǎng),則在已有序列的5’或3’端設(shè)計(jì)引物,在人類樹突狀細(xì)胞Marathon-ReadycDNA文庫(kù)(ClontechLab,Inc,USA)中進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR反應(yīng)。然后對(duì)PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長(zhǎng)的序列有無完整的ORF,如無,重復(fù)上述過程直至獲得全長(zhǎng)。(3)RT-PCR對(duì)于5’和3’端己知的序列,如果中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)或自身數(shù)據(jù)庫(kù)獲得,可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5’端設(shè)計(jì)引物,3’端引物采用Oligo-dT,在樹突狀細(xì)胞總RNA庫(kù)中進(jìn)行擴(kuò)增。然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序。最后拼接并獲得全長(zhǎng)。通過組合使用上述3種方法,獲得了候選的人hNRBF2蛋白的全長(zhǎng)編碼序列。在拼接得到全長(zhǎng)(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物R15’-GAGGTTGTTGCTCCTTCAGC-3’(SEQIDNO.4)為正向引物,寡核苷酸R25’-CATTTCCGGGATTACCCTTC-3’(SEQIDNO.5)為反向引物,以樹突狀細(xì)胞的總RNA為模板,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘,隨之以94℃30秒、60℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1120bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序,獲得SEQIDNO.6所示的序列。實(shí)施例2人hNRBF2基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的人hNRBF2全長(zhǎng)cDNA(GenBankAccessionNo.AF267866。在本申請(qǐng)之前未公開過)的長(zhǎng)度為1120bp,詳細(xì)序列見SEQIDNO.6,其中開放讀框位于153-986位核苷酸。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出人hNRBF2的氨基酸序列,共277個(gè)氨基酸殘基,分子量31807.26,pI為6.77。詳細(xì)序列見SEQIDNO.7。將hNRBF2的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與挪威鼠的NRBF2基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上,它與挪威鼠NRBF2基因的mRNA全編碼序列(GenBankAccessionNo.AB024930)有81.0%的相同性(附表2),在氨基酸水平上,它與挪威鼠NRBF2蛋白(GenPeptAccessionNo.BAA88955)的第1-234位氨基酸殘基有89.7%的相同性和95.7%的相似性(附表3)。由上可見,hNRBF2基因與挪威鼠NRBF2基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性,可以認(rèn)為兩者在功能上也有很高相似性。本發(fā)明的人hNRBF2除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究,還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白,比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外,本發(fā)明的人hNRBF2還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段,以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明的人hNRBF2蛋白的N端與挪威鼠NRBF2蛋白的N端進(jìn)行交換,以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。針對(duì)本發(fā)明人hNRBF2的抗體,用于篩選該家族的其他成員,或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。此外,本發(fā)明人hNRBF2核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞,以提高人hNRBF2的表達(dá)水平或者抑制人hNRBF2的過度表達(dá)。本發(fā)明的人hNRBF2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人,以治療或減輕因人hNRBF2缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外,還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。由于本發(fā)明的人hNRBF2蛋白具有源自人的天然氨基酸序列,因此,與來源于其他物種(如挪威鼠)的同族蛋白相比,預(yù)計(jì)在施用于人時(shí)將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒有)。實(shí)施例3人hNRBF2基因的組織表達(dá)譜電子Northern表達(dá)譜。按TonC.等人的方法(TonCetal.,BiochemBiophysResCommun1997Dec18;241(2)589-594;HwangDM,etal.,Circulation1997Dec16;96(12)4146-4203),將人hNRBF2cDNA序列在GCG軟件包中的humanEST數(shù)據(jù)庫(kù)中做BLAST檢索,在得到的人類EST中,概率值<10e-10、相同性>95%的EST有數(shù)十個(gè),可視為該基因在組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)本,由此得出表達(dá)該基因的組織譜,發(fā)現(xiàn)其在胰島、松果體腺、膀胱、胎盤、嬰兒心臟、胎兒肝臟、睪丸、胎腦等等組織中有表達(dá),表明它在人體這些組織器官中發(fā)揮著重要作用。實(shí)施例4人hNRBF2多肽的制備和提純?cè)谠搶?shí)施例中,將全長(zhǎng)的人hNRBF2編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中,以表達(dá)和提純重組蛋白。將人hNRBF2多肽以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。原核表達(dá)載體的構(gòu)建,以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)人hNRBF2的全長(zhǎng)編碼序列(SEQIDNO.6),設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(分別對(duì)應(yīng)于編碼序列5’和3’端的約20個(gè)以上核苷酸),并在正反引物上分另引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的pGEX-2T載體而定),以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增后,將人hNRBF2基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia,Piscataway,NJ)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,篩選鑒定得到含有pGEX-2T-hNRBF2表達(dá)載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-hNRBF2。表達(dá)GST-hNRBF2重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-hNRBF2工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜,按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時(shí),至OD600達(dá)O.5后,加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)O,1,2,3小時(shí)。取培養(yǎng)時(shí)間不同的1ml菌液離心,在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μ1,蒸餾水45μl,二巰基乙醇5μl),混懸細(xì)菌沉淀,沸水浴中煮5分鐘,10000rpm離心1分鐘,上清加入12%SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加的菌株即為表達(dá)GST-hNRBF2融合蛋白的工程菌。GST-hNRBF2融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GST-hNRBF2融合表達(dá)蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hNRBF2。誘導(dǎo)后的細(xì)菌離心沉淀,按每400ml菌加入20mlPBS重懸細(xì)菌,超聲破碎細(xì)菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50%谷胱苷肽Sepharose4B,37℃振搖結(jié)合30分鐘,10000rpm離心1O分鐘沉淀結(jié)合了GST-hNRBF2的谷胱苷肽Sepharose4B,棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μlPBS的量清洗兩次,而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液,室溫置10分鐘,10000rpm離心10分鐘,上清即為洗脫的融合蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃,并進(jìn)行SDS-PAGE電泳,檢測(cè)純化效果。在32kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為人hNRBF2蛋白。實(shí)施例5人hNRBF2蛋白或多肽在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)1.人hNRBF2桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞株根據(jù)人hNRBF2的全長(zhǎng)編碼序列(SEQIDNO.6),設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物,并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定),以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增后,將人hNRBF2eDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)。鑒定好的表達(dá)載體3μg,野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPVDNA,Pharmingen,SanDiego,CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL,NY)25μl,加入1ml無血清的昆蟲培養(yǎng)基中,振蕩15秒混勻,室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲細(xì)胞懸液于60mm組織培養(yǎng)板中,貼壁1小時(shí)后換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,室溫孵育15分鐘后棄培養(yǎng)基,加入前面制備好的DNA載體轉(zhuǎn)染混合物,Parafilm密封培養(yǎng)板,于室溫27℃振搖培養(yǎng)4小時(shí),而后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天,收集上清備用。2.轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的昆蟲細(xì)胞株的篩選鑒定轉(zhuǎn)染3天后的昆蟲細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(2×106/1ml),取1ml細(xì)胞懸液置于60mm組織培養(yǎng)皿中,加入3ml培養(yǎng)基,100μl收集的培養(yǎng)上清,貼壁1小時(shí),棄2ml培養(yǎng)基,繼續(xù)室溫培養(yǎng)1小時(shí),棄去所有的培養(yǎng)基,加入預(yù)熱的含20μl4%X-gal的3ml半固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)5-7天后挑取白色細(xì)胞克隆于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3-5天,而后吸取上清感染Sf9昆蟲細(xì)胞。收集感染的細(xì)胞進(jìn)行Western鑒定。將細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳后的膠于Pharmacia的MultiphorⅡ半干電轉(zhuǎn)移儀中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上,將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時(shí),而后于抗人hNRBF2的抗體溶液中封閉1小時(shí),TBS液振搖清洗5分鐘共2次,而后將膜置于生物素標(biāo)記的抗人hNRBF2一抗的第二抗體溶液中振搖1小時(shí),TBS清洗,加入親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物反應(yīng)30分鐘,TBS清洗2次,加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。挑取高表達(dá)人hNRBF2的Sf9細(xì)胞克隆。3.人hNRBF2蛋白的提取純化用高表達(dá)人hNRBF2的Sf9細(xì)胞克隆的上清大量感染Sf9細(xì)胞,感染48小時(shí)后收集細(xì)胞,PBS洗滌。每2×108細(xì)胞加入20ml細(xì)胞裂解液(0.5%TritonX-100,20mMNa3PO4(磷酸鈉,pH7.8),500mMNaCl,1mMNa3VO4(釩酸鈉),1mMPefabloc,1μg/ml胃蛋白酶抑制劑,亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細(xì)胞,12000×g離心20min去除細(xì)胞碎片,上清按每2×108的細(xì)胞加入2mlNTA-瓊脂糖(Qiagen,Germany),4℃吸附1小時(shí)。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次,用含20mMN,N’-二哌嗪,500mMNaCl,300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃,并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)提取的人hNRBF2蛋白的純度。在32kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為人hNRBF2蛋白。實(shí)施例6抗人hNRBF2抗體的制備1.免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備將實(shí)施例5和實(shí)施例6中獲得的人hNRBF2蛋白用層析法進(jìn)行分離后備用,也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離,將電泳條帶從凝膠中割下,并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠,用50-100μg/O.2ml乳化過的蛋白,對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后,用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強(qiáng)免疫一次,3-5天后用于融合。其中,脾細(xì)胞制備見鄂征主編,《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》,北京出版社,第210頁(yè)。2.按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上),第371頁(yè)中的方法,制備飼養(yǎng)細(xì)胞。3.按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上),第213頁(yè)中的方法,進(jìn)行細(xì)胞融合。4.抗體的檢測(cè)在細(xì)胞融合10-15天后,需逐孔進(jìn)行檢查,一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細(xì)胞集落生長(zhǎng),就應(yīng)用人hNRBF2蛋白做抗體活性的初步篩選,常用的方法有免疫熒光試驗(yàn)、發(fā)射免疫試驗(yàn)(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后,立刻進(jìn)行克隆培養(yǎng),并分離出抗體。本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下(1)SEQIDNO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度50bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQIDNO.1GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT50(2)SEQIDNO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度13bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQIDNO.2AATTCGGCACGAG13(3)SEQIDNO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQIDNO.3GCCGTGCTC9(4)SEQIDNO.4的信息(ⅰ).序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ).分子類型寡核苷酸(ⅲ).序列描述SEQIDNO.4GAGGTTGTTGCTCCTTCAGC20(5)SEQIDNO.5的信息(ⅰ).序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ).分子類型寡核苷酸(ⅲ).序列描述SEQIDNO.5CATTTCCGGGATTACCCTTC20(6)SEQIDNO.6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1120bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核苷酸(ⅲ)序列描述SEQIDNO.61GAGGTTGTTGCTCCTTCAGCGCCTATCGCTGGATCTTGGGGCGCAGAGAG51GGGCCGCAGTCTCCGCGGCTGCGTCGAGCTCCCTTGCAGTCCCCTCCATG101TTCCCCGGCGCCACTACTCCCCTTCCTAAGGCCGCCGCTTACCCCGGGGT151CTATGGAAGTAATGGAAGGACCCCTCAACCTGGCTCATCAACAGAGCAGA201CGAGCAGACCGTTTATTAGCTGCAGGCAAATACGAAGAGGCTATTTCTTG251TCACAAAAAGGCTGCAGCATATCTTTCTGAAGCCATGAAGCTGACACAGT301CAGAGCAGGCTCATCTTTCACTGGAATTGCAAAGGGATAGCCATATGAAA351CAGCTCCTCCTCATCCAAGAGAGATGGAAAAGGGCCCAGCGTGAAGAAAG401ATTGAAAGCCCAGCAGAACACAGACAAGGATGCAGCTGCCCATCTTCAGA451CATCTCACAAACCCTCTGCAGAGGATGCAGAGGGCCAGAGTCCCCTTTCT501CAGAAGTACAGCCCTTCCACAGAGAAATGCCTGCCTGAGATTCAGGGGAT551CTTTGACAGGGATCCAGACACACTACTTTATTTACTTCAGCAAAAGAGTG601AGCCAGCAGAGCCATGTATTGGAAGCAAAGCCCCAAAAGATGATAAAACA651ATTATAGAGGAGCAGGCAACCAAAATTGCAGATTTGAAGAGGCATGTGGA701ATTCCTTGTGGCTGAGAATGAAAGATTAAGGAAAGAAAATAAACAACTAA751AGGCTGAAAAGGCCAGACTTCTAAAAGGTCCAATAGAAAAGGAGCTGGAT801GTAGATGCTGATTTTGTAGAAACGTCAGAGTTATGGAGCTTGCCACCACA851TTGCAGAAACTGCTACAGGCTCCTCAACCTGGCAGAAGTTCGCAGCAAAT901ACCTGGGAAAGCCAAGGACATTCCAATCCCCAATCTTCCTCCCTTGGATT951TTCCATCTCCAGAACTTCCTCTTATGGAGCTCCTGAGAATATTCTGAAAG1001GATTTATGAATAATTAAAATGGAAGGCCACAGAAAGGGGAAAGAGGAAAT1051AATACAGTAATGTTAATCCAGCAAAAAAAATGAAAAGGGAAAACCACATA1101GAAGGGTAATCCCGGAAATG(7)SEQIDNO.7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度277氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅲ)序列描述SEQIDNO.71MEVMEGPLNLAHQQSRRADRLLAAGKYEEAISCHKKAAAYLSEAMKLTQS51EQAHLSLELQRDSHMKQLLLIQERWKRAQREERLKAQQNTDKDAAAHLQT101SHKPSAEDAEGQSPLSQKYSPSTEKCLPEIQGIFDRDPDTLLYLLQQKSE151PAEPCIGSKAPKDDKTIIEEQATKIADLKRHVEFLVAENERLRKENKQLK201AEKARLLKGPIEKELDVDADFVETSELWSLPPHCRNCYSLLNLAEVRSKY251LGKPRTFQSPIFLPWIFHLQNFLLWSS表281.0%identityin1044ntoverlaph.seq人hNRBF2蛋白的核酸序列(GenBankAccessionNo.AF267866)r.seq挪威鼠NRBF2蛋白的核酸序列(GenBankAccessionNo.AB024930)表389.7%identityin234aaoverlap,95.7%similarityin234aaoverlaph.pep人hNRBF2蛋白氨基酸序列r.pep挪威鼠NRBF2蛋白氨基酸序列(GenBankAccessionNo.BAA88955)權(quán)利要求1.一種分離出的DNA分子,其特征在于,它包括編碼具有人hNRBF2蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列,而且所述的核苷酸序列與SEQIDNO.6中從核苷酸第153-986位的核苷酸序列有至少70%的同源性;或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO.6中從核苷酸第153-986位的核苷酸序列雜交。2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子,其特征在于,所述的序列編碼具有SEQIDNO.7所示的氨基酸序列的多肽。3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子,其特征在于,該序列具有SEQIDNO.6中從核苷酸第153-986位的核苷酸序列。4.一種分離出的人hNRBF2蛋白多肽,其特征在于,它包括具有SEQIDNO.7-氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段,或其活性衍生物。5.如權(quán)利要求4所述的多肽,其特征在于,該多肽是具有SEQIDNO.7序列的多肽。6.一種載體,其特征在于,它包含權(quán)利要求1所述的DNA。7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,其特征在于它包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。8.一種產(chǎn)生具有人hNRBF2蛋白質(zhì)活性的多肽的方法,特征在于其步驟如下(1)將編碼具有人hNRBF2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列,形成人hNRBF2蛋白表達(dá)載體,所述的核苷酸序列與SEQIDNO.6中從核苷酸第153-986位的核苷酸序列有至少70%的同源性;(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞,形成人hNRBF2蛋白的重組細(xì)胞;(3)在適合表達(dá)人hNRBF2蛋白多肽的條件下,培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞;(4)分離出具有人hNRBF2蛋白活性的多肽。9.一種能與權(quán)利要求7所述的人hNRBF2蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體,其特征在于它包括多克隆抗體和單克隆抗體。10.一種核酸分子,其特征在于,它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-l00個(gè)連續(xù)核苷酸。11.一種用于檢測(cè)樣品中是否存在人hNRBF2核苷酸序列的方法,其特征在于它包括用權(quán)利要求10所述探針與樣品進(jìn)行雜交,然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合,該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物,其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于人hNRBF2核苷酸編碼序列,并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間,引物長(zhǎng)度為15~50個(gè)核苷酸。全文摘要本發(fā)明提供了一種在人體樹突狀細(xì)胞中表達(dá)的新的人hNRBF2蛋白及其編碼序列,本發(fā)明還提供了該蛋白和核酸序列的制備方法,以及在樣品中檢測(cè)人hNRBF2核酸序列和多肽的方法。文檔編號(hào)C12N15/10GK1281896SQ0011679公開日2001年1月31日申請(qǐng)日期2000年6月27日優(yōu)先權(quán)日2000年6月27日發(fā)明者李能干,許相儒,肖華勝,楊義生,陳竺,韓澤廣申請(qǐng)人:國(guó)家人類基因組南方研究中心
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