專利名稱：一種天花粉蛋白突變體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程，具體涉及一種天花粉蛋白突變體(Mutantof Trichosanthin，MTCS)及制備方法。
天花粉是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的中藥，來源于葫蘆科植物栝樓(Trichosanthes Kirilowii M.)的根，有二千余年醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用歷史。從中分離純化的一種分子量為27KD的蛋白質(zhì)稱為天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)，它的化學(xué)本質(zhì)為一種單鏈的核糖體失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein，RIP)，能特異切除真核細(xì)胞28SrRNA上第4324位腺嘌呤，從而阻斷蛋白質(zhì)的合成。具有“清熱解毒”作用。六十年代人們進(jìn)一步研究發(fā)掘了它的“終止妊娠”的能力。60年代后期中國臨床上已用于懷孕婦女的中期引產(chǎn)和治療葡萄胎。1989年美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了它能抑制人免疫缺陷病毒(HIV)在急性感染的T淋巴細(xì)胞和慢性感染的巨噬細(xì)胞中復(fù)制(見文獻(xiàn)報道，Mcgrath MS，Hwang KM.，Caldwell SE，et al。GLQ223An inhibitor of human immunodefienfiency virusreplication in acutely and chronically infected cells of lymphocyteand mononuclear phygocyte lineage。Proc Natl Acad SciUSA，1989，862844～2848)，并在臨床上試用于艾滋病人的治療。我們和其他學(xué)者還發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白還具有一定程度抗許多其它病毒、抗白血病和抗其它腫瘤的能力(見文獻(xiàn)報道，孔梅，柯一保，周美云等。天花粉蛋白誘發(fā)白血病細(xì)胞K562凋亡的研究。實驗生物學(xué)報，1998，31(3)233～243.Zheng YT，Zhang KL，Ben KL，et al。In vitro immunotoxicity and cytotoxicityof trichosanthin against human nomal immunocytes andleukemia-lymphoma cells。Immunopharmacology andImmunotoxicology，1995，17(1)69～79。吳裕新，項丹妮，章水平等。天花粉蛋白對胃結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用及其機(jī)制的研究。中華消化雜志。1993。13(3)263-266。)。但是，在天花粉蛋白作為引產(chǎn)藥物應(yīng)用時，中國科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)了它偶爾會引起通過IgE介導(dǎo)的速發(fā)性過敏反應(yīng)，因而每個引產(chǎn)婦女一生中只能注射一次，極大地限制了它的應(yīng)用范圍。
本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，研制一種過敏原性低、能反復(fù)使用的新的天花粉蛋白產(chǎn)品。
本發(fā)明提供了一種天花粉蛋白突變體產(chǎn)品(MTCS)，它是從天然天花粉蛋白的基因人工突變改造后，利用合適的表達(dá)系統(tǒng)得到的。
天然天花粉蛋白(TCS)是由247個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)如下式表示
ATG ATC AGAMet Ile ArgTTC TTA GTC CTC TCT TTG CTA ATT CTC ACC CTC TTC CTA ACA ACT CCT GCT GTG GAG GGC↓Phe Leu Val Leu Ser Leu Leu Ile Leu Thr Leu Phe Leu Thr Thr Pro Ala Val Glu Gly1GAT GTT AGC TTC CGT TTA TCA GGT GCA ACA AGC AGT TCC TAT GGA GTT TTC ATT TCA AATAsp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Val Phe Ile Ser Asn10 20CTG AGA AAA GCT CTT CCA AAT GAA AGG AAA CTG TAC GAT ATC CCT CTG TTA CGT TCC AGTLeu Arg Lys Ala Leu Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser30 40CTT CCA GGT TCT CAA CGC TAC GCA TTG ATC CAT CTC ACA AAT TAC GCC GAT GAA ACC ATTLeu Pro Gly Ser Gln Arg Tyr Ala Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp Glu Thr Ile50 60TCA GTG GCC ATA GAC GTA ACG AAC GTC TAT ATT ATG GGA TAT CGC GCT GGC GAT ACA TCCSer Val Ala Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser70 80TAT TTT TTC AAC GAG GCT TCT GCA ACA GAA GCT GCA AAA TAT GTA TTC AAA GAC GCT ATGTyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ala Lys Tyr Val Phe Lys Asp Ala Met90 100CGA AAA GTT ACG CTT CCA TAT TCT GGC AAT TAC GAA AGG CTT CAA ACT GCT GCA GGC AAAArg Lys Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys110 120ATA AGG GAA AAT ATT CCG CTT GGA CTC CCT GCT TTG GAC AGT GCC ATT ACC ACT TTG TTTIle Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe130 140TAC TAC AAC GCC AAT TCT GCT GCG TCG GCA CTT ATG GTA CTC ATT CAG TCG ACG TCT GAGTyr Tyr Asn Ala Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val Leu Ile Gln Ser Thr Ser Glu150 160GCT GCG AGG TAT AAA TTT ATT GAG CAA CAA ATT GGG AAG CGT GTT GAC AAA ACC TTC CTAAla Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln Gln Ile Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu170 180CCA AGT TTA GCA ATT ATA AGT TTG GAA AAT AGT TGG TCT GCT CTC TCC AAG CAA ATT CAGPro Ser Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln190 200ATA GCG AGT ACT AAT AAT GCA CAG TTT GAA AGT CCT GTT GTG CTT ATA AAT GCT CAA AACIle Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn Ala Gln Asn210 220CAA CGA GTC ACG ATA ACC AAT GTT GAT GCT GGA GTT GTA ACC TCC AAC ATC GCG TTG CTGGln Arg Val Thr Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu230 240CTG AAT AGA AAC AAT ATG GCA↓GCC ATG GAT GAC GAT GTT CCT ATG ACA CAG AGC TTTLeu Asn Arg Asn Asn Met Ala Ala Met Asp Asp Asp Val Pro Met Thr Gln Ser Phe247GGA TGT GGA AGT TAT GCT ATT TAGGly Cys Gly Ser Tyr Ala Ile End上式中的數(shù)字表示氨基酸序號MTCS的一級結(jié)構(gòu)組成保留了天然TCS結(jié)構(gòu)的絕大多數(shù)氨基酸序列。其特征之一在于該蛋白質(zhì)的第174位到180位7個氨基酸殘基的改變，改變之一為其中4個極性氨基酸殘基中的任意1個或1個以上的極性氨基酸殘基被缺失或者被改造成非極性氨基酸殘基，以及酸性與堿性氨基酸殘基的互變；改變之二為這7個氨基酸殘基中的3個非極性氨基酸殘基被任意缺失；結(jié)構(gòu)特征之二在于TCS的羧基端按次作了22-45(即序號為226-203)個氨基酸殘基中的14個極性氨基酸殘基中的任意兩個或兩個以上極性氨基酸殘基的缺失或改造，包括酸性、堿性氨基酸殘基的互變，和極性到非極性的改造。成為與天然TCS結(jié)構(gòu)有差異的、具有優(yōu)秀性能的新的天花粉蛋白突變體，它極大地降低了天花粉蛋白的過敏原性，但保留了TCS的一切生物學(xué)活性。
該產(chǎn)品一級結(jié)構(gòu)的改變，涉及的極性氨基酸的概念是指絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天門冬氨酸(Asp)、天門冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)等十一種氨基酸。其中，Asp、Asn、Glu、Gln為酸性氨基酸，Lys、Arg、His為堿性氨基酸；非極性氨基酸的概念是指甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)、甲硫氨酸(Met)等九種氨基酸。
本發(fā)明的天花粉蛋白突變體產(chǎn)品(MTCS)的免疫學(xué)活性及藥效測試結(jié)果如下一、TCS部分缺失蛋白和突變蛋白的性質(zhì)為了探索一級結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性與免疫學(xué)活性的關(guān)系，從基因水平將TCS進(jìn)行改造，獲得了多個氨基酸殘基被改造和C末端缺失的基因，經(jīng)大腸桿菌表達(dá)、純化后分別獲得了相應(yīng)的多個氨基酸殘基被改造和C末端缺失的蛋白質(zhì)。由于TCS及其突變體是一種RNAN-醣苷酶，可使核糖體失活，從而阻斷蛋白質(zhì)的合成，因而經(jīng)檢測這些突變體和C末端有明確缺失部位的突變體的系列蛋白的生物學(xué)與免疫學(xué)活性后，結(jié)合TCS的空間結(jié)構(gòu)分析，作活性區(qū)域的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)判斷資料。RIP活性依Pelhem & Jackson的方法進(jìn)行；抗生育活性按我們實驗室的常規(guī)方法進(jìn)行，體外免疫反應(yīng)用Elisa方法檢測。
實驗結(jié)果可列表如下所示
注NTCS為天然TCS；LTCS為缺失體TCS；MTCS為突變體TCS。*RIP活性IC50(ng/ml)≤50++，＜50→≥500+，＜500→≥5000±，＞5001-；**抗生育活性％≥80++，＜80→≥30+，＜30→≥5±，＜5-；***體外免疫反應(yīng)能力％≥80++，＜80→≥30+，＜30→≥10±，＜10-。
在M31TCS(M226-203，180-174)這個突變體中，有二個突變區(qū)域，序列174-180和序列203-226，其中可被突變或缺失的極性氨基酸殘基共18個，非極性氨基酸殘基共3個。這二個區(qū)域分別可有一個或一個以上(174-180)或二個或二個以上(203-226)的極性氨基酸殘基被突變改造或缺失，在174-180區(qū)域還可有3個非極性氨基酸殘基被缺失。
174-180區(qū)域可被突變的氨基酸的序列分布列表為
203-226區(qū)域可被突變的氨基酸的序列分布列表為
2.MTCS對不同細(xì)胞的殺滅情況總結(jié)于下表
*為人正常外周血淋巴細(xì)胞，從臨床采集。
從上表中可見，MTCS對K562、HL60、MLT、U937等白血病細(xì)胞和Jar人絨癌細(xì)胞的半殺滅劑量LC50＜30ug/ml，我們稱LC50≤30ug/ml的細(xì)胞為最敏感的細(xì)胞群；MTCS對B16、A431、B7-325、SPCA1、7404等癌細(xì)胞的LC50＞30ug/ml以上，稱它們?yōu)橐话忝舾行图?xì)胞群；MTCS對人外周血淋巴細(xì)胞和人羊膜細(xì)胞等正常體細(xì)胞的LC50＞1000ug/ml以上，稱為非敏感型細(xì)胞群。這就清楚地明確在一定的劑量條件下，MTCS對白血病等癌細(xì)胞有強(qiáng)烈的殺滅作用；而對正常體細(xì)胞不敏感。這與以往對TCS的研究相一致。
3、抗人體癌癥動物模型的性質(zhì)。
a)。藥效學(xué)研究。
將人白血病紅白細(xì)胞癌的K562細(xì)胞接種至八周令裸小鼠(nodemice)皮下，接種細(xì)胞數(shù)量為1×107數(shù)量級。接種10天后，可見腫瘤在接種部位生成，接種成功率為50％。選擇腫瘤生成鼠隨機(jī)分為四組，給予不同劑量的MTCS注射治療。并以生理鹽水注射鼠作為對照。在每鼠治療劑量≤引產(chǎn)劑量(15nm/Kg、45nm/Kg、75nm/Kg)條件下，每四天注射一次，以四次治療為限，均可見不同程度的抑瘤效應(yīng)。各治療組的抑瘤率分別為(40±3)％、(71±2)％和(92±4)％。選用另一種免疫雙缺陷動物Scid小鼠人體動物模型，繼續(xù)研究MTCS的對紅白細(xì)胞癌(K562)的殺滅效應(yīng)。選用九周令Scid小鼠給予K562細(xì)胞接種，接種細(xì)胞數(shù)量同裸小鼠，接種成功率為100％。在接種后第五天，隨機(jī)將小鼠分為四組，其中三組為MTCS治療組，另一組為生理鹽水對照組。治療組按高、中、低不同劑量進(jìn)行注射治療。分為150nm/kg一次注射組、75nm/kg二次治療注射組(每周注射一次)和37nm/kg注射組(每四天注射一次)，總劑量均為150nm/kg。高、中、低三組抑瘤率分別為(43±6)％、(64±8)％、和(94±3)％、二種人體動物模型的實驗結(jié)論是在引產(chǎn)劑量條件下，便可見明顯的抑瘤效應(yīng)；一半引產(chǎn)劑量四次注射便可見90％以上的抑瘤效果，即小劑量多次注射效果尤佳。
上述為人紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞癌的癌細(xì)胞接種至兩種動物機(jī)體形成實體瘤后，MTCS的治療效果均佳。在此兩種動物模型的基礎(chǔ)上，繼續(xù)用Scid小鼠建立了一種與臨床表現(xiàn)更為接近的人白血病的動物模型，即一種能從小白鼠血液生化指標(biāo)、白血球數(shù)量的變化反映人源白血病的小鼠。實驗從小鼠尾靜脈注射3.75nm/kg、7.5nm/kg、和15nm/kg劑量的MTCS，用以治療患人紅白細(xì)胞癌的小鼠，經(jīng)三次注射后，上述三組白血球總數(shù)恢復(fù)至正常值的小鼠分別為(25±6)％、(75±8)％和(94±3)％。即MTCS治療液體瘤的劑量可小于實體瘤，而治療液體瘤的效果卻優(yōu)于實體瘤。
b)。小白鼠急性毒性的研究。
選用八周齡ICR/JCL-F1小鼠按常規(guī)急性毒性研究法，一次注射MTCS和NTCS，比較MTCS和NTCS的LD50，結(jié)果表明在同一劑量條件下，動物死亡率天然組大于突變體組，且動物死亡時間天然組早于突變體組。以七天為觀察時間，它們的半致死劑量分別為LD50(NTCS)＝18.4mg/kg和LD50(MTCS)＝27.5mg/kg，因而MTCS的急性毒性明顯低于NTCS，約下降了50％。
c)。豚鼠體內(nèi)急性過敏毒性試驗。
將NTCS和MTCS分別作豚鼠體內(nèi)急性過敏毒性試驗。致敏用量為一次皮內(nèi)注射致孕婦臨床劑量的4.5倍劑量，14天后進(jìn)行攻擊，攻擊劑量為一次耳靜脈注射致孕婦流產(chǎn)劑量的10倍。觀查動物在30分鐘內(nèi)的反應(yīng)和死亡情況。結(jié)果NTCS組死亡動物數(shù)與試驗動物總數(shù)之比為12/14；占86％，MTCS組為3/15，占20％，兩者相較差異顯著。即MTCS引起的豚鼠體內(nèi)急性過敏程度比NTCS顯著降低。
d)。大鼠被動皮膚過敏試驗。
按Ovary，Z.S.的方法，作大鼠被動皮膚過敏(Passive Cutaneousanaphylaxis，PCA)試驗。將N-TCS和M-TCS分別致敏小白鼠，14天后，分別得NTCS和MTCS的抗血清。再將兩種抗血清分別注入麻醉了的大白鼠剃去毛的背部皮內(nèi)，并分別用含NTCS和MTCS的伊文思藍(lán)注射入大白鼠的尾靜脈進(jìn)行攻擊，半小時后，拉尾致死，觀查大白鼠背部皮膚藍(lán)斑形成情況，以藍(lán)斑直徑大于0.5cm者為陽性。結(jié)果顯示經(jīng)N-TCS抗血清注射的大鼠背部斑塊均顯陽性(+)，而M-TCS抗血清注射的大鼠背部斑塊均顯陰性(-)。表明MTCS誘發(fā)大白鼠體內(nèi)IgE應(yīng)答銳減，原NTCS的陽性反應(yīng)已全部消失。三、MTCS抗腫瘤機(jī)理的研究1.MTCS誘導(dǎo)了敏感的腫瘤細(xì)胞的凋亡。
如上面第二條第1和第2點所述，MTCS對體外培養(yǎng)中的白血病細(xì)胞有極強(qiáng)的殺滅作用，而對正常細(xì)胞影響極微。我們以MTCS對K562細(xì)胞的殺滅作用為例，經(jīng)多種研究手段通過電子顯微鏡觀察可見加藥后K562細(xì)胞發(fā)生了典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞變小，胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核仁消失，染色質(zhì)凝聚濃縮為一個或數(shù)個團(tuán)塊，有時可形成新月狀，許多細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，最后形成有外膜包繞典型的凋亡小體。生化上抽提加藥組細(xì)胞DNA，用瓊脂醣凝膠電泳觀察到“階梯狀”條帶的出現(xiàn)，這是凋亡的生化指標(biāo)。以及利用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測到的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)的二倍體峰(即凋亡峰)，所有結(jié)果均表明TCS誘導(dǎo)了K562細(xì)胞的凋亡。
2.敏感細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在著能與MTCS專一結(jié)合的蛋白組分。
用生物分子相互作用分析系統(tǒng)(Biomolecular InteractionAnalysis，BIA)研究，當(dāng)敏感細(xì)胞的細(xì)胞膜抽提液流經(jīng)生物傳感片，能與固相化的MTCS結(jié)合，導(dǎo)致感應(yīng)片上的共振變化。該變化轉(zhuǎn)換為SPR信號并以RU(Resonance unite)來衡量。敏感細(xì)胞均有100至300不等的RU變化，表明MTCS與膜蛋白的大分子結(jié)合甚強(qiáng)。而同樣處理正常細(xì)胞如人子宮羊膜細(xì)胞，則無此變化。
3.通過激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)研究，觀察到MTCS可以通過受體介導(dǎo)形式被內(nèi)吞到K562細(xì)胞胞漿內(nèi)；4.通過[35S]GTPγTCS結(jié)合實驗，說明MTCS能激活敏感細(xì)胞膜上的G蛋白，而不敏感細(xì)胞則無此激活現(xiàn)象。表明在敏感細(xì)胞中引起了信號的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)導(dǎo)；5.通過激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)研究，進(jìn)一步觀察到外源MTCS刺激敏感細(xì)胞后，能引起細(xì)胞內(nèi)鈣庫中游離鈣離子的釋放和濃度變化。
根據(jù)以上研究得出的結(jié)論為敏感細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在著MTCS的受體，能介導(dǎo)MTCS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮致核糖體失活(RIP)作用；同時，MTCS還干擾了細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。上述雙重作用導(dǎo)致了細(xì)胞的凋亡。這些敏感細(xì)胞極大多數(shù)是腫瘤細(xì)胞，因而MTCS治療癌癥與通?？鼓[瘤藥物對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞兩敗俱傷的殺傷機(jī)理完全不同。為MTCS作為新要代抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用提供了堅實的理論基礎(chǔ)。
本發(fā)明的另一目的是提供了上述天花粉蛋白突變體產(chǎn)品的制備方法，該方法包括下列步驟(1)對原TCS基因的改造天然天花粉蛋白的基因是從ATG(起始密碼子)到TAG(中止密碼子)共計870bp(堿基對)，可從基因庫或cDNA庫篩取，或利用PCR方法吊取，也可以利用化學(xué)方法人工全合成，該基因編碼了一個由289個氨基酸殘基組成的前體蛋白，即它除了編碼成熟的TCS(247氨基酸殘基)外，在其5’端前還編碼了一個由23肽組成的前導(dǎo)肽或信號肽、和在其3’端后還編碼了一個延伸肽或尾肽(19肽)；利用分子生物學(xué)領(lǐng)域工作者均已知的DNA的定點突變方法，包括單鏈模板法和雙鏈模板法(即PCR法)對原始的天然TCS基因進(jìn)行突變改造a.在編碼成熟TCS的DNA序列的5’端前引進(jìn)限制性內(nèi)切酶Nco I位點(CCATGG)，也便引進(jìn)了起始密碼子ATG，由此同時將編碼的原成熟TCS的N端前加了一個甲硫氨酸；或引進(jìn)限制性內(nèi)切酶NdeI位點(CATATG)，由此同時使編碼的原成熟TCS的第一個氨基酸殘基從天門冬氨酸改為甲硫氨酸；在編碼成熟TCS的DNA序列的3’端后引進(jìn)限制性內(nèi)切酶BamHI位點(GGATCC)，由此同時引進(jìn)了終止密碼子；b.對恰當(dāng)部位(174-180，203-226)氨基酸殘基進(jìn)行改造，以獲得本發(fā)明的天花粉蛋白突變體的基因；(3)MTCS的表達(dá)將具有優(yōu)秀性能的天花粉蛋白突變體的基因用Nco I(或Nde I)和Bam HI雙酶切后克隆進(jìn)質(zhì)粒載體pET-2d(或pET-3a)，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化受體菌大腸桿菌Bl 21(DE3，plysS)。轉(zhuǎn)化子在37℃用LB培養(yǎng)液(含Ap，Chl)中培養(yǎng)過夜后，用M9ZB培養(yǎng)液(含Ap，Chl)在同樣溫度放大發(fā)酵培養(yǎng)至570mu的光吸收為0.8左右，加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時后離心收集菌體。菌體經(jīng)超聲破碎后，離心取上清液上CM-Sephadex或CM-Sephorose柱層析分離純化，其主峰即為MTCS產(chǎn)品。
本發(fā)明的產(chǎn)品能用于醫(yī)學(xué)臨床。
除包括了原天然天花粉蛋白的一切適應(yīng)癥外，還擴(kuò)大至抗腫瘤領(lǐng)域，即可應(yīng)用于1)抗白血病和廣譜性的抗其它實體腫瘤。它的優(yōu)點是能選擇性地進(jìn)入靶細(xì)胞，因而用量微，使用次數(shù)少。在一定的劑量范圍內(nèi)，對腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈殺傷作用，而幾乎不損傷正常細(xì)胞，故不良反應(yīng)極微。
2)抗病毒、抗HIV，可用于艾滋病人的治療，較天然TCS副反應(yīng)少，病人可多次使用。
3)妊娠婦女的中期引產(chǎn)、宮外孕，可多次使用。
實施例1TCS基因的定點突變和克隆。
為方便基因操作，設(shè)計的引物有1.5’GTGCAGGCC ATG GAT GTTAGG 3’2.5’AAC AAT ATG GCA TAG GAT CCC ATG GAT GAC 3’引物1的特點是含Nco I位點(CCATGG)，同時引進(jìn)起始密碼子(ATG)。結(jié)果在編碼原成熟TCS的N端前加了一個Met；引物2的特點是含BamH I位點(GGATCC)，結(jié)果在編碼成熟的TCS后引進(jìn)終止密碼子(TAG)。
選用Bio-Rad公司提供的Muta-Gene Phagemid in vitromutagenesis藥盒，按藥盒中所附的詳細(xì)說明和步驟進(jìn)行突變操作，最后通過DNA序列分析驗證所獲基因符合試驗設(shè)計。該方法要求先將待突變的原始基因前體克隆進(jìn)phagemid(噬菌粒)系列。我們挑選了pTZ-19U。
將上述用引物1突變好的pTZ-19U-TCS經(jīng)Nco I和Bam HI在37℃水解2小時，通過低熔點瓊脂醣凝膠在TAE緩沖液中電泳分離和回收長度約750bp的TCS基因片段，利用T4DNA連接酶在4℃與事先同樣經(jīng)Nco I和BamH I雙酶解的表達(dá)型質(zhì)粒pET-2d連接過夜，得到pET-2d-TCS。
實施例2pET-2d-TCS轉(zhuǎn)化受體菌及其表達(dá)pET-2d-TCS用常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。轉(zhuǎn)化子在37℃用LB培養(yǎng)液(含Ap，Chl)中培養(yǎng)過夜后，再用M9ZB培養(yǎng)液(含Ap，Chl)在同樣溫度放大發(fā)酵培養(yǎng)至600mu的光吸收為0.8左右，加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時后離心收集菌體。菌體經(jīng)超聲破碎后，離心取上清液上CM-Sephadex或CM-Sephorose柱層析。利用含50mM Tris-Hcl緩沖液的(0.1-0.4)M濃度梯度的Nacl分離純化，其主峰即為表達(dá)的產(chǎn)品。
實施例3MTCS的基因克隆。
除根據(jù)需要，設(shè)計的引物不同外，其余操作均與上面實施例1相同。最后得到含MTCS基因的質(zhì)粒pET2d-MTCS。
以MTCS(M177、203、204)為例，設(shè)計的突變引物為3. 5’AAG CGT GTT GACGAAACC TTC CTA CCA 3’4. 5’ATT CAG ATA GCGGGA GGTAAT AAT GGA CAG 3’引物3的特點是將原177位的Lys的密碼子改變成Glu的密碼子。由于密碼子的兼并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Glu的堿基GAG替代。
引物4的特點是將原203和204位的Ser和Thr的密碼子改變成Gly和Gly的密碼子。由于密碼子的兼并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Gly的堿基如GGG GGG、GGA GGA、GGC GGC、GGT GGT等共有16種替代方式。
實施例4MTCS基因的轉(zhuǎn)化和表達(dá)。
含MTCS基因的質(zhì)粒pET2d-MTCS用常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。MTCS基因的轉(zhuǎn)化、表達(dá)和純化所用的方法與上述實施例2相同。最后得到所需的突變體TCS，在本例的情況下，為MTCS(M177、203、204).
實施例5MTCS(M177、203、204)生物學(xué)活性和免疫活性的檢測。
RIP活性按文獻(xiàn)[8]報道方法進(jìn)行，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液為Promega產(chǎn)品，[3H]亮氨酸為New England Nuclear產(chǎn)品?？股钚杂梦覀儗嶒炇页Ｒ?guī)方法進(jìn)行[9]，以中期懷孕11天的ICR小鼠為模型，背部注射MTCS(M177、203、204)75nM/kg藥物劑量，48小時后斷頸處死小鼠。解剖記錄總胎鼠數(shù)及死亡胎鼠數(shù)(包括胎兒吸收點)，計算肽鼠死亡率。體外免疫活性用Elisa方法檢測，IgG抗體和單克隆抗體IgE為我們實驗室自行制備和純化[10]。純化方法用親和層析柱，其中TCS-Sepharose 4B按溴化氰活化方法制備。SDS-聚丙烯胺凝膠電泳按Laemmli方法進(jìn)行，電泳后用0.25％考馬氏亮蘭R250染色。以上各項實驗結(jié)果除陰性對照外，均用NTCS為陽性對照。實驗結(jié)果小結(jié)為
實施例6MTCS(M177、203、204)對K562細(xì)胞的殺滅效應(yīng)用實驗室常規(guī)的MTT方法測定MTCS(M177、203、204)對K562細(xì)胞的殺滅效應(yīng)。人紅白細(xì)胞型白血病K562與采自臨床分離的正常人淋巴細(xì)胞，分別在含有10％滅活小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)、于37℃、5％CO2條件下，以2×105/ml接種細(xì)胞，并分別加入1、5、10、20、50、100ug/ml的MTCS。培養(yǎng)48小時后每孔加入25ulMTT(購自Sigma)(5mg/ml)，2小時后每孔加入Lysing Buffer終止反應(yīng)，370℃放置過夜，用酶標(biāo)儀測定各孔A570值。最后結(jié)果顯示MTCS對K562的LC50為11.0ug/ml，而對正常人外周血淋巴細(xì)胞不敏感，在上述實驗劑量MTCS的濃度高達(dá)100ug/ml條件下，測不出LC50值。
權(quán)利要求
1.一種天花粉蛋白突變體產(chǎn)品，其特征在于該產(chǎn)品改變了天花粉蛋白質(zhì)的第174位到180位7個氨基酸殘基，并且其中4個極性氨基酸殘基中的任意一個或一個以上的極性氨基酸殘基被缺失或者被改造成非極性氨基酸殘基，以及酸性與堿性氨基酸殘基的互變；改變之二為這7個氨基酸殘基中的3個非極性氨基酸殘基被任意缺失；并在TCS的羧基端按次作了22-45(即序號為226-203)個氨基酸殘基中的14個極性氨基酸殘基中的任意兩個或兩個以上極性氨基酸殘基的缺失或改造，包括酸性、堿性氨基酸殘基的互變，和極性到非極性的改造，成為與天然TCS結(jié)構(gòu)有差異的、具有優(yōu)秀性能的新的天花粉蛋白突變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種天花粉蛋白突變體，其特征在于其中所述的一級結(jié)構(gòu)的改變，涉及的極性氨基酸是指絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天門冬氨酸(Asp)、天門冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)或組氨酸(His)。其中，Asp、Asn、Glu、Gln為酸性氨基酸，Lys、Arg、His為堿性氨基酸；非極性氨基酸是指甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)或甲硫氨酸(Met)。
3.一種如權(quán)利要求1所述的天花粉蛋白突變體產(chǎn)品的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)對原TCS基因的改造利用分子生物學(xué)領(lǐng)域工作者均已知的DNA的定點突變方法，包括單鏈模板法和雙鏈模板法(即PCR法)對原始的天然TCS基因進(jìn)行突變改造a.在編碼成熟TCS的DNA序列的5’端前引進(jìn)限制性內(nèi)切酶Nco I位點(CCATGG)，由此引進(jìn)起始密碼子，同時將編碼的原成熟TCS的N端前加了一個甲硫氨酸；或引進(jìn)限制性內(nèi)切酶Nde I位點(CATATG)，由此同時使編碼的原成熟TCS的第一個氨基酸殘基從天門冬氨酸改為甲硫氨酸；在編碼成熟TCS的DNA序列的3’端后引進(jìn)限制性內(nèi)切酶BamHI位點(GGATCC)，由此同時引進(jìn)了終止密碼子；b.對恰當(dāng)部位(174-180，203-226)氨基酸殘基進(jìn)行改造，以獲得本發(fā)明的天花粉蛋白突變體的基因；(2)MTCS的表達(dá)將具有優(yōu)秀性能的天花粉蛋白突變體的基因用Nco I(或Nde I)和Bam HI雙酶切后克隆進(jìn)質(zhì)粒載體pET-2d(或pET-3a)，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化受體菌大腸桿菌Bl 21(DE3，plysS)，轉(zhuǎn)化子在37℃用LB培養(yǎng)液(含Ap，Chl)中培養(yǎng)過夜后，用M9ZB培養(yǎng)液(含Ap，Chl)在同樣溫度放大發(fā)酵培養(yǎng)至570mu的光吸收為0.8左右，加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時后離心收集菌體，菌體經(jīng)超聲破碎后，離心取上清液上CM-Sephadex或CM-Sephorose柱層析分離純化，其主峰即為MTCS產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程,具體涉及一種天花粉蛋白突變體產(chǎn)品及制備方法。本發(fā)明的產(chǎn)品是從天然天花粉蛋白基因經(jīng)突變改造后,通過合適的表達(dá)系統(tǒng)制備得到的。本發(fā)明產(chǎn)品極大降低了天花粉蛋白的過敏原性,生物活性好,能選擇性進(jìn)入靶細(xì)胞,對腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈殺傷作用,并能抗病毒、抗HIV,也可用于妊娠婦女中期引產(chǎn)、宮外孕,能多次使用。
文檔編號C12N15/10GK1283630SQ0011955
公開日2001年2月14日 申請日期2000年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月2日
發(fā)明者柯一保, 聶慧玲 申請人:中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所