專利名稱：野山參與栽培參非細胞dna克隆鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的鑒定方法，具體涉及野山參與栽培參的鑒定方法。
野山參是一種名貴的滋補品，隨著近年來野山參資源的日益減少，其價格也不斷上漲，致使許多不法之徒用移山參、栽培參等冒充野山參以謀取暴利，造成了市場混亂，損害了消費者的利益。
野山參與栽培參的鑒定，從目前國內(nèi)外的研究情況看，主要采用外部觀察法及顯微鑒定法。其主要依據(jù)的是野山參與栽培參的外部形態(tài)特征即所謂的性狀特征、氣味及內(nèi)部細胞組織結(jié)構(gòu)特征。這些方法在以往的野山參與栽培參的鑒定過程中，也起到過很大的作用。不過，這些方法有賴于人們對野山參與栽培參長期鑒定的經(jīng)驗結(jié)果，具有較多的主觀性。尤其是當人參碾成粉末后，其外部特征和性狀特征均已消失，很難區(qū)分哪個是野山參，哪個是栽培參。
本發(fā)明的目的是要依據(jù)野山參與栽培參的DNA特征，采用隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)方法，提供一種準確、靈敏、方便的鑒定方法。
本發(fā)明公開的非細胞DNA克隆鑒定野山參與栽培參的方法是由下列步驟實現(xiàn)的1、DNA的提取分別取已知的野山參根、栽培參根和待測樣品參根0.1～0.5g，研磨成細粉，移入離心管，加入CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)抽提緩沖液，及等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，離心；將上清液吸入離心管，加入異丙醇混勻后放入-20℃冰箱保存，再次離心；去上清液，沉淀加入TE緩沖液(1mmol/L Tris，0.1mmol/LEDTA，pH8.0)溶解，加1～2倍體積的無水乙醇混勻，冰箱放置；取出后，離心，去上清液，沉淀用乙醇洗滌，自然陰干；加無菌水溶解，吸取部分DNA溶液稀釋備用。
2、DNA提取液的純化分別將已知野山參、栽培參和待測樣品的DNA提取液離心，沉淀溶解于TE緩沖液中，加入2/3體積的乙醇再沉淀、離心，取沉淀物備用。
3、DNA的擴增分別取上述純化后的野山參、栽培參及樣品的DNA提取物進行DNA擴增(1)反應(yīng)的總體積為25μl。各反應(yīng)成分的濃度分別為Mg2+濃度1.0～4.0mM、dNTP濃度0.1～0.4μM，引物濃度0.4～3.2μM，純化后的DNA提取物濃度為稀釋10～20倍，Taq酶濃度0.5～2.0unit。
(2)用全自動PCR(多聚酶鏈式反應(yīng))儀進行DNA擴增，反應(yīng)程序為①92～94℃變性3～5分鐘35～37℃復(fù)性1～2分鐘70～74℃延伸2～3分鐘，1個循環(huán)②92～94℃變性1～2分鐘35～37℃復(fù)性1～2分鐘70～74℃延伸2～3分鐘，40個循環(huán)③72℃延伸10分鐘，1個循環(huán)4、電泳測定將上述經(jīng)PCR擴增得到的野山參、栽培參和樣品的DNA擴增產(chǎn)物進行電泳測定，電泳的材料為含0.05％EB(溴化乙錠)的1.5％～2％瓊脂糖凝膠，電泳的緩沖液為1×TAE，電泳時的電壓為100伏，電泳的時間為45分鐘左右。在電泳時加λDNA/EcoRI+HindIIImarker做為分子量標記。
5、結(jié)果分析電泳后，在紫外燈下觀察拍照，將樣品的電泳圖與野山參、栽培參電泳圖對照，進行判別，如樣品具有野山參相應(yīng)條帶則樣品為野山參，如無野山參相應(yīng)條帶，與栽培參條帶相似則為栽培參。
本發(fā)明野山參與栽培參的鑒定方法主要是利用了野山參與栽培參的遺傳物質(zhì)DNA的差異性來實現(xiàn)的。RAPD擴增技術(shù)已廣泛用于生物的遺傳育種、微生物、昆蟲、蛇類等的鑒別，但至今未見應(yīng)用于野山參與栽培參的鑒定，因為對不同的生物物種，其鑒別的各種技術(shù)條件相差很大。本發(fā)明野山參與栽培參非細胞DNA克隆鑒定方法，關(guān)鍵的第一步是提取獲得較純的DNA模板，模板DNA的好壞將直接影響最后的鑒定結(jié)果。本發(fā)明的DNA提取與純化方法經(jīng)反復(fù)篩選，能保證較高的DNA模板純度，使測定結(jié)果清晰、穩(wěn)定。
干燥的野山參與栽培參易被空氣氧化產(chǎn)生褐變，從而影響DNA的提取，為防止這一現(xiàn)象可在干燥野山參與栽培參的DNA抽提緩沖液中加入巰基乙醇等還原劑；另外在抽提液中還可加入十二烷基吡咯烷酮，以保護DNA不受破壞。
本發(fā)明野山參與栽培參另一關(guān)鍵技術(shù)是DNA擴增引物的篩選，中藥材基因組DNA由于采收、加工方式和貯存時間等不同，其降解程度差別較大，本發(fā)明方法采用合適的引物，使模板DNA在小分子片段有優(yōu)勢地擴增，擴增出200～1500bp條帶的引物，分別得到基本一致的DNA指紋圖譜，使野山參與栽培參擴增出具有各自特征的條帶，從而達到區(qū)分和鑒定的目的。
本發(fā)明采用的DNA擴增引物可以是S3CATCCCCCTGS4GGACTGGAGTS5TGCGCCCTTCS6TGCTCTGCCCS9TGGGGGACTCS10CTGCTGGGACS18CCACAGCAGTS20GGACCCTTACS22TGCCGAGCTGS45TGAGCGGACAOPH3AGACGTCCACOPH4GGAAGTCGCCOPH5AGTCGTCCCCOPH10CCTACGTCAGOPH11CTTCCGCAGTOPH12ACGCGCATGTOPH15AATGGCGCAGOPH16TCTCAGATGGOPH17CACTCTCCTCOPH20GGGAGACATC本發(fā)明利用人參中相對穩(wěn)定的DNA，采用分子生物學(xué)RAPD擴增技術(shù)，建立了一種科學(xué)、靈敏、簡捷、重現(xiàn)性好的野山參與栽培參鑒定方法，對規(guī)范人參市場，維護消費者的合法利益具有重大的社會效益和經(jīng)濟效益。
實施例1、1、實驗材料a.野山參由上海市藥材有限公司神象參茸分公司提供，產(chǎn)地為吉林長白山；b.栽培參由上海市藥材有限公司神象參茸分公司提供，產(chǎn)地為吉林不同區(qū)域；c.待測樣品2、實驗試劑和藥品a.所有化學(xué)試劑均為分析純，包括36％HCL Trisβ-巰基乙醇 氯仿異戊醇EDTA無水乙醇b.雙蒸無菌水c.瓊脂糖、λDNA/EcoRI+Hind III marker、MgCl2d.Taq酶、dNTP、引物S6購自Sangon公司3、實驗儀器
PCR儀比利時Equibio公司生產(chǎn)，Thermojet型電泳儀北京六一儀器廠生產(chǎn)DYY-III4離心機上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)TGL-16C紫外燈上海顧村電光儀器廠生產(chǎn)三用紫外線分析儀4、實驗步驟分別取野山參、栽培參與待測樣品按下列步驟操作(1)DNA抽提a.取干燥參根研磨成細粉。
b.稱取0.1克至干凈滅菌后的1.5ml離心泵，加入600μl左右預(yù)熱到60℃的1×CTAB抽提緩沖液，搖勻，放入60℃水浴中溫浴1小時，搖晃。
c.取出后冷卻到室溫，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提蛋白，搖勻后至離心機中離心，離心速度為8000轉(zhuǎn)/分，離心約10分鐘。
d.吸取上清液至另一干凈、無菌后的1.5ml離心管，加入2/3體積的異丙醇(-20℃預(yù)冷)，搖勻后放入-20℃冰箱保存20分鐘，離心(9000轉(zhuǎn)/分)約10分鐘。
e.吸去上清液，加400μl左右的TE緩沖液溶解，再加入2倍體積的無水乙醇，搖勻。放入-20℃冰箱約2小時，取出后離心(10000轉(zhuǎn)/分)約10分鐘，去上清液，再用75％乙醇洗滌兩次，自然陰干，加100μl無菌水溶解。
f.吸取部分DNA溶液，稀釋10倍，其余放入-20℃冰箱長期保存。
(2)DNA提取液純化將上述DNA溶液離心后，沉淀溶于TE緩沖液溶解后加入2/3體積乙醇再沉淀，離心，沉淀物備用。
(3)DNA擴增a.反應(yīng)總體積為2.5μlb.各成分用量如下3μl mM MgCl21μl0.2mM dNTP0.5μl0.4uM引物S62μl純化的DNA提取物0.1μl的0.5unit的Taq酶2.5μl的10x buffer15.9μl的雙蒸無菌水c.擴增前再加25μl的石蠟油封頂d.擴增反應(yīng)程序
①94℃變性3分鐘36℃復(fù)性1分鐘72℃延伸2分鐘，1個循環(huán)②94℃變性1分鐘36℃復(fù)性1分鐘72℃延伸2分鐘，40個循環(huán)③72℃延伸10分鐘，1個循環(huán)(4)瓊脂糖電泳電泳的材料為含0.05％EB(溴化乙錠)的1.5％～2％瓊脂糖凝膠，電泳的緩沖液為1×TAE，電泳時的電壓為100伏，電泳的時間為45分鐘。在電泳時加λDNA/EcoRI+HindIII marker做為分子量標記。
(5)觀察和拍照電泳后，在紫外燈下進行觀察，選擇條帶清晰且具鑒定依據(jù)的進行拍照，作為鑒定結(jié)果。
(6)實驗結(jié)果見


圖1，其中1、2、4為吉林產(chǎn)栽培參，5為野山參，3為待測樣品。從圖中可得出5為野山參。
實施例2實驗方法同實施例1，其中引物為OPH5，結(jié)果見圖2，其中1為marker，2、3、4、5為吉林產(chǎn)栽培參，6為吉林產(chǎn)野山參。
實施例3實驗方法同實施例1，其中引物為OPH3，結(jié)果見圖3，其中1為marker，2、4、5為吉林產(chǎn)栽培參，3為待測樣品，6為吉林產(chǎn)野山參。從圖中可得出3為野山參。
實施例4實驗方法同實施例1，其中引物為S18，結(jié)果見圖4，其中1為marker，2、3、4、6為吉林產(chǎn)栽培參，5為吉林產(chǎn)野山參。
實施例5實驗方法同實施例1，其中引物為S45，結(jié)果見圖5，其中1為marker，2、3、5、6為吉林產(chǎn)栽培參，4為吉林產(chǎn)野山參。
權(quán)利要求
1.一種野山參與栽培參非細胞DNA克隆鑒定方法，其特征在于該鑒定方法包括下列步驟(1)DNA的提取分別取已知的野山參根、栽培參根和待測樣品參根0.1～0.5g，研磨成細粉，移入離心管，加入CTAB抽提緩沖液，及等體積的氯仿∶異戊醇＝24∶1抽提，離心；將上清液吸入離心管，加入異丙醇混勻后放入-20℃冰箱保存，再次離心；去上清液，沉淀加入TE緩沖液溶解，加1～2倍體積的無水乙醇混勻，冰箱放置；取出后，離心，去上清液，沉淀用乙醇洗滌，自然陰干；加無菌水溶解，吸取部分DNA溶液稀釋備用；(2)DNA提取液的純化分別將已知野山參、栽培參和待測樣品的DNA提取液離心，沉淀溶解于TE緩沖液中，加入2/3體積的乙醇再沉淀、離心，取沉淀物備用；(3)DNA的擴增分別取上述純化后的野山參、栽培參及樣品的DNA提取物進行DNA擴增a.反應(yīng)的總體積為25μl。各反應(yīng)成分的濃度分別為Mg2+濃度1.0～4.0mM、dNTP濃度0.1～0.4μM，引物濃度0.4～3.2μM，純化后的DNA提取物濃度為稀釋10～20倍，Taq酶濃度0.5～2.0unit；b.用全自動PCR儀進行DNA擴增，反應(yīng)程序為①92～94℃變性3～5分鐘35～37℃復(fù)性1～2分鐘70～74℃延伸2～3分鐘，1個循環(huán)②92～94℃變性1～2分鐘35～37℃復(fù)性1～2分鐘70～74℃延伸2～3分鐘，40個循環(huán)③72℃延伸10分鐘，1個循環(huán)(4)電泳測定將上述經(jīng)PCR擴增得到的野山參、栽培參和樣品的DNA擴增產(chǎn)物進行電泳測定，電泳的材料為含0.05％EB的1.5％～2％瓊脂糖凝膠，電泳的緩沖液為1×TAE，電泳時的電壓為100伏，電泳的時間為45分鐘左右。在電泳時加λDNA/EcoRI+HindIII marker做為分子量標記；(5)結(jié)果分析電泳后，在紫外燈下觀察拍照，將樣品的電泳圖與野山參、栽培參電泳圖對照，進行判別，如樣品具有野山參相應(yīng)條帶則樣品為野山參，如無野山參相應(yīng)條帶，與栽培參條帶相似則為栽培參。
全文摘要
本發(fā)明涉及野山參與栽培參的鑒定方法。本發(fā)明依據(jù)野山參與栽培參的DNA特征,采用隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)方法,提供了一種準確、靈敏、方便的野山參與栽培參鑒定方法。本發(fā)明的非細胞DNA克隆鑒定方法包括DNA提取、DNA純化、DNA擴增、電泳分析和結(jié)果判斷等步驟。本發(fā)明的鑒定方法對人參的鑒別具有很大的社會和經(jīng)濟價值。
文檔編號C12Q1/68GK1337470SQ00119569
公開日2002年2月27日 申請日期2000年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月4日
發(fā)明者萬樹文, 丁建彌, 梅其春 申請人:上海市藥材有限公司神象參茸分公司