專利名稱：使用棒狀細(xì)菌發(fā)酵制備d－泛酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用至少擴(kuò)增了pyc基因的棒狀細(xì)菌發(fā)酵制備D-泛酸的方法。
泛酸是用于化妝品，藥品，人類營養(yǎng)和動物營養(yǎng)的商業(yè)上重要的維生素。
泛酸可經(jīng)過化學(xué)合成，或經(jīng)過在合適的營養(yǎng)溶液中發(fā)酵合適的微生物經(jīng)過生物技術(shù)來制備。在化學(xué)合成中，DL-泛內(nèi)酯是重要的中間階段。它在多步過程中從甲醛，異丁醛和氰化物制備。在另外加工步驟中，分離外消旋混合物，將D-泛內(nèi)酯與β-丙氨酸進(jìn)行縮合反應(yīng)，以這種方式獲得所需的D-泛酸。
以微生物進(jìn)行發(fā)酵制備的優(yōu)勢在于直接形成所需的立體異構(gòu)D-型，它游離于L-泛酸。
許多類型的細(xì)菌，例如，大腸桿菌，產(chǎn)脲節(jié)桿菌，產(chǎn)紅棒桿菌，產(chǎn)氨短桿菌，還有酵母，如Debaromyces castellii可在含有葡萄糖，DL-泛解酸和β-丙氨酸的營養(yǎng)溶液中產(chǎn)生D-泛酸，如在EP-A0493060中所示。EP-A0493060還表明對于大腸桿菌，經(jīng)過擴(kuò)增包含在質(zhì)粒pFV3和pFV5中的大腸桿菌泛酸生物合成基因可在含有葡萄糖，DL-泛解酸和β-丙氨酸的營養(yǎng)溶液中促進(jìn)D-泛酸的形成。
EP-A0590857和美國專利5518906描述了來自大腸桿菌菌株IFO3547的突變體，例如，F(xiàn)V5714，F(xiàn)V525，F(xiàn)V814，F(xiàn)V521，F(xiàn)V221，F(xiàn)V6051和FV5069，它們攜帶對各種抗代謝物，例如，水楊酸，α-丁酮酸，β-羥基天冬氨酸，O-甲基蘇氨酸和α-酮異戊酸的抗性。它們在含有葡萄糖，和D-泛酸的營養(yǎng)溶液中和在含有葡萄糖和β-丙氨酸的營養(yǎng)溶液中產(chǎn)生泛解酸。在EP-A0590857和美國專利5518906中還表明擴(kuò)增包含在質(zhì)粒pFV31中的泛酸生物合成基因后促進(jìn)上述菌株在含有葡萄糖的營養(yǎng)溶液中產(chǎn)生D-泛解酸和在含有葡萄糖和β-丙氨酸的營養(yǎng)溶液中生產(chǎn)D-泛酸。
本發(fā)明人的目的是為用棒狀細(xì)菌發(fā)酵制備泛酸的改進(jìn)方法提供新的措施。
維生素泛酸是用于化妝品，藥品，人類營養(yǎng)和動物營養(yǎng)的商業(yè)上重要的產(chǎn)品。對于提供制備泛酸的改進(jìn)方法普遍感興趣。
在下文中提到D-泛酸或泛酸或泛酸鹽時，不僅指D-泛酸的游離酸，還指其鹽，例如，鈣，鈉，銨或鉀鹽。
本發(fā)明提供了使用棒狀細(xì)菌發(fā)酵制備D-泛酸的方法，其中編碼丙酮酸羧化酶(EC號6.4.1.1.)的核苷酸序列(pyc基因)被擴(kuò)增，特別是過量表達(dá)。
采用的菌株任選在擴(kuò)增pyc基因前已能產(chǎn)生D-泛酸。
優(yōu)選的實施方案參見權(quán)利要求書。
本文中術(shù)語“擴(kuò)增”描述了微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一種或多種酶的細(xì)胞內(nèi)活性增加，例如，經(jīng)過增加一個或多個基因的拷貝數(shù)，使用有效啟動子或使用編碼具有高活性的相應(yīng)酶的基因，和任選組合這些方法。
本發(fā)明提供的微生物可從葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖漿，淀粉，纖維素或從甘油和乙醇產(chǎn)生D-泛酸。它們是棒狀細(xì)菌的代表，特別是棒桿菌屬。在棒桿菌屬中，特別提及的是谷氨酸棒桿菌種，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其產(chǎn)生L-氨基酸的能力。
棒桿菌屬特別是谷氨酸棒桿菌種中合適的菌株是，例如，已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒狀細(xì)菌ATCC15806嗜乙酰乙酸棒狀細(xì)菌ATCC13870
嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERMBP-1539黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC14020和從它們制備的產(chǎn)D-泛酸的突變體。
已發(fā)現(xiàn)棒狀細(xì)菌在過量表達(dá)編碼丙酮酸羧化酶(EC號6.4.1.1.)的pyc基因后以增加的方式產(chǎn)生泛酸。
pyc基因編碼催化丙酮酸羧化成草酰乙酸的丙酮酸羧化酶(EC號6.4.1.1.)。pyc基因的核苷酸序列在DE-A-19831609中公開并且也被Koffas等(應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)50,346-352(1998))和Peters-Wendisch等(微生物學(xué)144,915-927(1998))描述。它一般可從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI,Bethesda,MD,USA)核酸序列數(shù)據(jù)庫中以登記號Y09548獲得。根據(jù)本發(fā)明可使用所述參考文獻(xiàn)描述的pyc基因。還可使用由于遺傳密碼的簡并性或由于中性功能的有意義突變產(chǎn)生的pye基因的等位基因。
為了實現(xiàn)擴(kuò)增(例如，過量表達(dá))，例如，可增加相應(yīng)基因的拷貝數(shù)或突變結(jié)構(gòu)基因的啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點上游。以這種方式作用插入了結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒。通過可誘導(dǎo)的啟動子，還可增加發(fā)酵泛酸形成過程中的表達(dá)。通過延長m-RNA壽命的方法同樣可提高表達(dá)。另外，還可通過防止酶蛋白降解增加酶活性。基因或基因構(gòu)建體或者以不同的拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或者在染色體中整合并擴(kuò)增。另外，所述基因的過量表達(dá)還可通過改變培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)方法來實現(xiàn)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可在下列文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)對本文的說明，特別是在Martin等(生物/技術(shù)5,137-146(1987))，Guerrero等(基因138,35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術(shù)6,428-430(1988))，Eikmanns等(基因102,93-98(1991))，歐洲專利說明書EPS0472869，美國專利4601893，Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9,84-87(1991))，Reinscheid等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60,126-132(1994))，LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175,1001-1007(1993))，專利申請WO96/15246，Malumbres等(基因134,15-24(1993))，日本公開說明書JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術(shù)和生物工程58,191-195(1998))和在已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書中。
幫助丙酮酸羧化酶過量表達(dá)的質(zhì)粒的一個例子是質(zhì)粒pVWExlpyc，它在DE-A-19831609中公開且以起始載體pVWExl為基礎(chǔ)。質(zhì)粒pVWExl含有特別是作為組成成分的質(zhì)粒pBLl的序列，tac啟動子和lacIq等位基因?？梢韵嗤姆绞绞褂媚茉诠劝彼岚魲U菌中復(fù)制的其它質(zhì)粒載體，例如，pEKExl(Eikmanns等，基因10293-98(1991))或pZ8-1(歐洲專利說明書0375889)。
為了生產(chǎn)泛酸，除了編碼丙酮酸羧化酶的基因外，擴(kuò)增，特別是過量表達(dá)編碼泛酸生物合成途徑或酮異戊酸生物合成途徑的酶的一個或多個其它基因也具有優(yōu)勢，例如，下列基因·編碼天冬氨酸脫羧酶的panD基因(Dusch等，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)65,1530-1539(1999))或·編碼酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的panB基因(Sahm等，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)，65,1973-1979(1999))或·編碼泛酸合成酶的panC基因(Sabm等，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)，65,1973-1979(1999))或·編碼二羥酸脫水酶的ilvD基因。
除了過量表達(dá)丙酮酸脫羧酶外，消除不需要的副反應(yīng)對于產(chǎn)生泛酸也具有優(yōu)勢(Nakayama“繁殖產(chǎn)生氨基酸的微生物”，在微生物產(chǎn)物的過度生產(chǎn)，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編)，英國倫敦學(xué)院出版，1982)。
根據(jù)本發(fā)明制備的微生物可在分批方法(分批培養(yǎng))或在補(bǔ)料分批(補(bǔ)料方法)或重復(fù)補(bǔ)料分批方法(重復(fù)補(bǔ)料方法)中連續(xù)或不連續(xù)培養(yǎng)以生產(chǎn)泛酸。已知培養(yǎng)方法的綜述在Chmiel的教科書(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik[生物學(xué)方法技術(shù)1，生物學(xué)方法技術(shù)的引言](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或在Storhas的教科書(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen[生物反應(yīng)器和外周設(shè)備](Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中描述。
所用的培養(yǎng)基必須以合適的方式滿足特定微生物的需要。對于各種微生物的培養(yǎng)基的描述參見美國細(xì)菌學(xué)協(xié)會的手冊“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊”(美國華盛頓區(qū)，1981)。可使用諸如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖漿，淀粉和纖維素的糖類和碳水化合物，諸如大豆油，葵花籽油，落花生油和椰子油的油和脂肪，諸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸的脂肪酸，諸如甘油和乙醇的醇類和諸如乙酸的有機(jī)酸作為碳源。這些物質(zhì)可單獨或作為混合物使用?？墒褂弥T如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米漿，大豆粉和尿素的含有機(jī)氮的化合物，或諸如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨的無機(jī)化合物作為氮源。氮源可單獨或作為混合物使用?？墒褂昧姿岫溻浕蛄姿釟涠浕蛳鄳?yīng)的含鈉鹽作為磷源。培養(yǎng)基必須還含有為生長所必需的金屬鹽，例如，硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)外，可采用諸如氨基酸和維生素的必需生長物質(zhì)。而且可向培養(yǎng)基中添加泛酸的前體，如天冬氨酸，β-丙氨酸，酮異戊酸，酮泛解酸或泛解酸及其任選的鹽以進(jìn)一步增加泛酸產(chǎn)量。上述起始物質(zhì)可以單批的形式加入培養(yǎng)基中，或可在培養(yǎng)期間以合適的方式添加。
可采用諸如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氨的堿性化合物，或諸如磷酸，硫酸的酸性化合物以合適的方式控制pH值?？刹捎弥T如脂肪酸聚乙二醇酯的抗泡劑來控制泡沫形成?？上蚺囵B(yǎng)基中加入諸如抗生素的具有選擇性作用的合適物質(zhì)以維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。為了維持需氧條件，可向培養(yǎng)基中導(dǎo)入氧氣或含氧氣體混合物，例如，空氣。培養(yǎng)溫度通常是20℃至45℃，優(yōu)選25℃至40℃。培養(yǎng)持續(xù)到形成最大量的泛酸。通常在10小時至160小時達(dá)到該目標(biāo)。
可用已知的方法測定所形成的泛酸的濃度(Velisek；色譜科學(xué)60,515-560(1992))。
下面的微生物根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1999年7月1日保藏在Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen(DSMZ=德意志微生物保藏中心，不倫瑞克，德國)。
谷氨酸棒桿菌DG52-5/pVWExlpyc，保藏號為DSM12893。
實施例下面借助于實施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。
為達(dá)到目的，用異亮氨酸需求型菌株ATCC13032△ilvA進(jìn)行實驗，該菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號DSM12455保藏在DeutscheSammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen(DSMZ=德意志微生物保藏中心，不倫瑞克，德國)。
實施例1菌株ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc的制備將質(zhì)粒pVWExlpyc(DE-A-19831609)電穿孔(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊，123343-347)進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032△ilvA并隨后在LB-瓊脂(Lennox，1955，病毒學(xué)，1190-206)+25μg/ml卡那霉素上選擇，獲得菌株ATCCl3032△ilvA/pVWExlpyc。
實施例2泛酸的制備在補(bǔ)充了25μg/ml卡那霉素和25μg/ml異亮氨酸的培養(yǎng)基CGXII(Keilhauer等，1993，細(xì)菌學(xué)雜志，1755595-5603；表4)中檢測谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032△ilvA和ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc形成的泛酸。該培養(yǎng)基下文稱為谷氨酸棒桿菌檢測培養(yǎng)基。在各例中，用相同培養(yǎng)基的16小時預(yù)培養(yǎng)物接種50ml新鮮制備的谷氨酸棒桿菌檢測培養(yǎng)基使培養(yǎng)開始時培養(yǎng)物懸液的光密度(OD580)為0.1。30℃和175rpm下培養(yǎng)24小時后，測定培養(yǎng)物的光密度(OD580)，然后經(jīng)過以5000g離心10分鐘去掉細(xì)胞并對上清液進(jìn)行無菌過濾。
在580nm的測量波長下測定光密度時采用來自Pharmacia(Freiburg，德國)的NovaspecⅡ光度計。
根據(jù)DIFCO手冊(DIFCO手冊，第10版，第1100-1102頁；Michigan，USA)的說明借助于植物乳芽孢桿菌ATCC8014定量培養(yǎng)物上清中的D-泛酸鹽。使用Sigma(Deisenhofen，德國)的泛酸全鈣鹽用于校準(zhǔn)。
菌株ATCC13032△ilvA和ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc的泛酸生產(chǎn)結(jié)果在表1中概括表1
實施例3質(zhì)粒pXT-panD的制備3．1大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-XT99A的制備大腸桿菌表達(dá)載體pTRC99A(Amann等，1988，基因69301-315)用作起始載體用于構(gòu)建大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)載體pEC-XT99A。BspHⅠ-限制性裂解(Roche Diagnostics GmbH，Mammheim，德國，產(chǎn)品描述BspHI，產(chǎn)品號1467123)和隨后的Klenow(Amersham Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，產(chǎn)品號27-0928-01；Sambrook等的方法，1989，分子克隆實驗室手冊，冷泉港)處理后用谷氨酸棒桿菌質(zhì)粒pAGl(GenBank保藏號AF121000)的四環(huán)素抗性基因取代氨芐青霉素抗性基因(bla)。為此，將攜帶抗性基因的區(qū)域以AluⅠ片段(AmershamPharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述AluⅠ，產(chǎn)品號27-0884-01)克隆進(jìn)線型化的大腸桿菌表達(dá)載體pTRC99A中。按Sambrook等(1989，分子克隆實驗室手冊，冷泉港)所述進(jìn)行連接，DNA混合物與T4連接酶(Amersham Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，產(chǎn)品號27-0870-04)培養(yǎng)過夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊，123343-7)進(jìn)大腸桿菌菌株DH5αmcr(Grant，1990，美國科學(xué)院學(xué)報，874645-4649)。構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)載體稱為pXT99A。
質(zhì)粒pGAl(Sonnen等，1991，基因，10769-74)用作從谷氨酸棒桿菌克隆最小復(fù)制子的基礎(chǔ)。經(jīng)過以BalⅠ/PstⅠ限制性裂解(Promega GmbH，Mannheim，德國，產(chǎn)品描述BalⅠ，產(chǎn)品號R6691；Amersham Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述PstⅠ，產(chǎn)品號27-0976-01)載體pGAl，可在用SmaⅠ和PstⅠ(Amersham PharmaciaBiotech，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述SmaⅠ，產(chǎn)品號27-0942-02，產(chǎn)品描述PstⅠ，產(chǎn)品號27-0976-01)片段化的載體pK18mob2(Tauch等，1998，微生物學(xué)學(xué)報169303-312)中克隆3484bp大小的片段。借助于BamHⅠ/XhoⅠ限制性裂解(Amersham PharmaciaBiotech，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHⅠ，產(chǎn)品號27-086803，產(chǎn)品描述XhoⅠ，產(chǎn)品號27-0950-01)和隨后的Klenow(Amersham PharmaciaBiotech，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，產(chǎn)品號27-0928-01；Sambrook等的方法，1989，分子克隆實驗室手冊，冷泉港)處理，刪除839bp大小的片段。經(jīng)過用T4連接酶(Amersham Pharmacia Biotech,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，產(chǎn)品號27-0870-04)再連接的構(gòu)建，可在大腸桿菌表達(dá)載體pXT99A中以2645bp大小的片段克隆谷氨酸棒桿菌最小復(fù)制子。為此，攜帶最小復(fù)制子的DNA構(gòu)建體用限制性酶KpnⅠ(AmershamPharmacia Biotech,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述KpnⅠ，產(chǎn)品號27-0908-01)和PstI(Amersham Pharmacia Biotech,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述PstⅠ，產(chǎn)品號27-0886-03)裂解，然后，借助于Klenow聚合酶(Amersham Pharmacia Biotech,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，產(chǎn)品號27-0928-01)，進(jìn)行3’-5’核酸外切酶處理(Sambrook等的方法，1989，分子克隆實驗室手冊，冷泉港)。
在平行的批次中，用限制性酶RsrⅡ(Roche Diagnostics,Mannheim，德國，產(chǎn)品描述RsrⅡ，產(chǎn)品號1292587)裂解大腸桿菌的表達(dá)載體pXT99A并用Klenow聚合酶(Amersham PharmaciaBiotech,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，產(chǎn)品號27-0928-01)進(jìn)行連接。最小復(fù)制子與載體構(gòu)建體pXT99A的連接按Sambrook等(1989，分子克隆實驗室手冊，冷泉港)所述進(jìn)行，DNA混合物與T4連接酶(Amersham Pharmacia Biotech,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，產(chǎn)品號27-0870-04)培養(yǎng)過夜。
以這種方式構(gòu)建的大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)載體pEC-XT99A借助于電穿孔(Liebl等，1989，F(xiàn)EMS微生物通訊，53299-303)轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌DSM5715。在添加了5mg/l四環(huán)素且含有18.5g/l腦心浸液培養(yǎng)基，0.5M山梨糖醇，5g/l細(xì)菌用胰蛋白胨，2.5g/l細(xì)菌用酵母提取物，5g/l NaCl和18g/l細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂的LBHIS瓊脂上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的選擇。在33℃下培養(yǎng)2天。
用常規(guī)方法(Peter-Wendisch等，1998，微生物學(xué)，144,915-927)從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA并用限制性內(nèi)切酶HindⅢ裂解，隨后用瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒。
由此獲得的質(zhì)粒構(gòu)建體稱為pEC-XT99A且在


圖1中顯示。由質(zhì)粒pEC-XT99A電穿孔進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715獲得的菌株稱為DSM5715/pEC-XT99A且根據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號DSM12967保藏在Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen undZellkulturen(DSMZ=德意志微生物保藏中心，不倫瑞克，德國)。
3．2質(zhì)粒pXT-panD的制備從谷氨酸棒桿菌ATCC13032的泛酸生物合成基因panD的核苷酸序列開始(Dusch等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)65(4)，1530-1539(1999))和DE19855313.7)，選擇PCR引物使擴(kuò)增片段含有攜帶其天然核糖體結(jié)合位點的基因。按照廠家說明書將用PCR引物panD-Cg1(5’-CATCTCACGCTATGAATTCT-3’)和panD-Cg2(5’-ACGAGGCCTGCAGCAATA-3’)擴(kuò)增的405bp大小的片段連接進(jìn)載體pCR_2.1(起始TA克隆試劑盒，Invitrogene(Leek,TheNetherlands)，產(chǎn)品描述起始TA克隆_試劑盒，目錄號KNM2030-01)，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10F(Invitrogen,Groningen,TheNetherlands的目錄“Invitrogen 2000”)。經(jīng)過在含100μg/ml氨芐青霉素和40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的LB-瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24小時進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的選擇。
用常規(guī)方法從轉(zhuǎn)化子中分離以這種方式構(gòu)建的質(zhì)粒pCR-D2的DNA并用限制性核酸內(nèi)切酶SacⅠ和XbaⅠ消化，連接進(jìn)也被裂解過的載體pEC-XT99A中。由于位于panD編碼區(qū)的第二個XbaⅠ裂解位點在大腸桿菌宿主Top10F中以甲基化形式存在，該裂解位點不被裂解，因此該基因在SacⅠ和XbaⅠ裂解位點的側(cè)翼完整地從質(zhì)粒pCR-D2中被裂解出來。連接后，混合物電穿孔進(jìn)大腸桿菌菌株DH5αmcr中。在含有50μg/ml卡那霉素的LB-瓊脂平板上進(jìn)行選擇。分離以這種方式獲得的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA并用限制性核酸內(nèi)切酶SacⅠ和XbaⅠ裂解，然后以瓊脂糖凝膠電泳檢查該片段。以這種方式構(gòu)建的質(zhì)粒稱為pXT-panD并在圖2中表示。
實施例4泛酸生產(chǎn)菌株ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc,pXT-panD的制備將實施例3中所述的質(zhì)粒pXT-panD電穿孔進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc中。在補(bǔ)充了10μg/ml四環(huán)素和25μg/ml卡那霉素的LB-瓊脂中30℃選擇2天后，獲得菌株ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc,pXT-panD。
實施例5泛酸的制備谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc,pXT-panD和ATCC13032△ilvA/pXT-panD形成的泛酸在補(bǔ)充了10μg/ml四環(huán)素，2mM異亮氨酸且對于菌株ATCC13032△ilvA/pVWExlpyc,pXT-panD還添加25μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基CGXII(Keilhauer等，1993，細(xì)菌學(xué)雜志，1755595-5603；表2)中檢測。
該培養(yǎng)基在下文稱為谷氨酸棒桿菌檢測培養(yǎng)基。用相同培養(yǎng)基的16小時預(yù)培養(yǎng)物接種各50ml新鮮制備的谷氨酸棒桿菌檢測培養(yǎng)基使培養(yǎng)開始時培養(yǎng)物懸液的光密度(OD580)為0.1。培養(yǎng)物在30℃和130rpm下培養(yǎng)。培養(yǎng)5小時后，以1mM的終濃度加入IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖苷)。培養(yǎng)48小時后，測定培養(yǎng)物的光密度(OD580)，然后經(jīng)過以5000g離心10分鐘去掉細(xì)胞并對上清液進(jìn)行無菌過濾。
在580nm的測量波長下測定光密度時采用來自Pharmacia(Freiburg，德國)的NovaspecⅡ光度計。
根據(jù)DIFCO手冊(DIFCO手冊，第10版，第1100-1102頁；Michigan,USA)的說明借助于植物乳芽孢桿菌ATCC8014定量培養(yǎng)物上清中的D-泛酸鹽。使用Sigma(Deisenhofen，德國)的泛酸偏鈣鹽用于校準(zhǔn)。
結(jié)果在表3中顯示。
表2
表3
附上如下附圖
圖1質(zhì)粒pEC-XT99A的限制性圖譜圖2質(zhì)粒pXT-panD的限制性圖譜所示的堿基對數(shù)字為可重復(fù)獲得的大約值。
所用的縮寫和命名具有如下含義
′lacZlacZα基因片段3’端lacIqlac阻遏蛋白基因的lacIq等位基因lacZ’lacZα基因片段5’端oriV復(fù)制原點VpanD天冬氨酸脫羧酶基因per控制拷貝數(shù)的基因ptrctrc啟動子rep谷氨酸棒桿菌的復(fù)制區(qū)T1轉(zhuǎn)錄終止子T1T2轉(zhuǎn)錄終止子T2Tet四環(huán)素抗性基因BamHⅠ限制性酶BamHⅠ的裂解位點DraⅠ限制性酶DraⅠ的裂解位點EcoRⅠ限制性酶EcoRⅠ的裂解位點EcoRⅤ限制性酶EcoRⅤ的裂解位點HindⅢ限制性酶HindⅢ的裂解位點KpnⅠ限制性酶KpnI的Ⅰ裂解位點NdeⅠ限制性酶NdeⅠ的裂解位點NotⅠ限制性酶NotⅠ的裂解位點NruⅠ限制性酶NruⅠ的裂解位點PstⅠ限制性酶PstⅠ的裂解位點SacI限制性酶SacI的裂解位點SalⅠ限制性酶SalⅠ的裂解位點SmaⅠ限制性酶SmaⅠ的裂解位點XbaⅠ**甲基化的XbaⅠ的裂解位點XbaⅠ限制性酶XbaⅠ的裂解位點
權(quán)利要求
1.經(jīng)發(fā)酵棒狀細(xì)菌制備D-泛酸的方法，其特征在于采用編碼丙酮酸羧化酶(EC號6.4.1.1.)的核苷酸序列(pyc基因)被擴(kuò)增，特別是過量表達(dá)的細(xì)菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于采用還擴(kuò)增了D-泛酸生物合成途徑的其它基因的細(xì)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于采用至少部分消除了減少D-泛酸形成的代謝途徑的細(xì)菌。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項或多項的方法，其特征在于采用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，且該質(zhì)粒載體攜帶編碼丙酮酸羧化酶的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于采用被質(zhì)粒pVWExlpyc轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于同時擴(kuò)增編碼天冬氨酸脫羧酶的panD基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于同時擴(kuò)增編碼酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的panB基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于同時擴(kuò)增編碼泛酸合成酶的panC基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于同時擴(kuò)增編碼二羥酸脫水酶的ilvD基因。
10.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項或多項的方法，其特征在于在已經(jīng)產(chǎn)生D-泛酸的棒狀細(xì)菌中擴(kuò)增所述的基因。
11.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項或多項的發(fā)酵制備D-泛酸的方法，其特征在于進(jìn)行如下步驟a)發(fā)酵至少擴(kuò)增了編碼丙酮酸羧化酶的基因的生產(chǎn)D-泛酸的細(xì)菌，b)在培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中濃縮D-泛酸，和c)分離所產(chǎn)生的D-泛酸。
12.編碼丙酮酸羧化酶(EC號6.4.1.1.)的核苷酸序列(pyc基因)被擴(kuò)增，特別是過量表達(dá)的棒狀細(xì)菌。
13.以保藏號DSMl2893保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，德國不倫瑞克)的谷氨酸棒桿菌DG52-5/pVWExlpyc。
全文摘要
本發(fā)明涉及過發(fā)酵棒狀細(xì)菌制備D－泛酸的方法,其中采用編碼丙酮酸羧化酶(EC號6.4.1.1.)的核苷酸序列(pyc基因)被擴(kuò)增,特別是過量表達(dá)的細(xì)菌。所述方法包括如下步驟:a)發(fā)酵至少擴(kuò)增了編碼丙酮酸羧化酶的基因的生產(chǎn)D－泛酸的細(xì)菌,b)在培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中濃縮D－泛酸,和c)分離所產(chǎn)生的D－泛酸。
文檔編號C12R1/15GK1288061SQ0012448
公開日2001年3月21日 申請日期2000年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月9日
發(fā)明者妮科爾·杜施, 格奧爾格·蒂爾巴赫 申請人:德古薩－于爾斯股份公司, 比勒費爾德大學(xué)發(fā)明轉(zhuǎn)讓研究所有限公司