專利名稱：一種新的平頦海蛇磷脂酶a的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種平頦海蛇磷脂酶A2以及編碼它的基因。
磷脂酶是指能水解磷酸甘油酯的酶。自然界中有5種磷脂酶，即磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D。蛇毒中主要含磷脂酶A2(phospholipase A2，EC3.1.1.4簡稱PLA2)，有極少數(shù)蛇毒含磷脂酶B，其它幾種磷脂酶主要在動物組織和細(xì)菌中。PLA2是蛇毒中研究得最多的一種酶，它的底物為Sn-3-磷酸甘油酯第2位上的酯鍵。這種酶廣泛存在于蛇毒、蜂毒、蝎毒和動物組織中，四科蛇毒中均含有豐富的PLA2。目前已發(fā)現(xiàn)的蛇毒PLA2都是胞外分泌型的水溶性蛋白，結(jié)構(gòu)相似(如分子內(nèi)都含有7對二硫鍵)，分子量一般在14kD左右。蛇毒PLA2除了酶活性外，還具有多種生理活性，例如神經(jīng)毒、心臟毒、肌肉毒、細(xì)胞毒、溶血作用、出血作用、水腫作用、促凝或抗凝作用等。不同來源的蛇毒PLA2所具上述生理作用各不相同，每種PLA2通常只有一種或少數(shù)幾種生理作用。例如β-Bungarotoxin只有突觸前神經(jīng)毒性，但沒有肌溶和抗凝活性；來自印度NAJA NAJA NAJA的NN-XIII-PLA2則具有水腫和肌毒作用而無溶血作用。(Vishwanath et al.，Toxicon，1987，25501-515；Ogawa et al.，J.Mol.Evol.1995，41867-877；Rosenberg，1990，Phospholipases.InHandbook ofToxinology，pp67-277；覃公平主編，中國毒蛇學(xué)，第2版，1998，廣西，廣西科學(xué)技術(shù)出版社，pp603)在一種蛇毒中往往含有PLA2的多種同功酶，如酸性、中性或堿性的PLA2。PLA2的這種多樣性可能在捕食時通過PLA2相互作用或與其它蛇毒蛋白質(zhì)一起起到補體或者協(xié)同的作用。
鑒于蛇毒PLA2的結(jié)構(gòu)多樣性和功能復(fù)雜性，人們一直對為什么相似的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生如此不同的生理作用感到迷惑，也提出了不少模型來解釋PLA2為什么會表現(xiàn)眾多的生理作用。在經(jīng)過多年研究之后，Kini等(Kini etal.，Toxicon，1989，27613-635)提出了一種模型，很好地解釋了這類問題。Kini等認(rèn)為動物體內(nèi)存在著各種能與PLA2特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，每種蛋白不是均勻地分布在動物體各組織中，而是重點分布在一個或幾個組織器官中，有這些蛋白的組織或細(xì)胞稱為靶組織或靶細(xì)胞，每種有特異作用的PLA2都有自己的靶組織或靶位點；PLA2的催化活性中心與起生理作用的活性中心是分開的或有部分重疊，起生理作用的活性中心能夠與靶位點結(jié)合，是決定特異結(jié)合的部位；注射PLA2，盡管經(jīng)過許多組織，但由于靶組織的親和力大，所以它們只與這種組織結(jié)合，與其它組織結(jié)合甚少；結(jié)合后的PLA2通過結(jié)合作用本身或水解結(jié)合位點附近的關(guān)鍵磷脂而起作用。該模型認(rèn)為，具有相同生理作用的PLA2有相似的生理作用活性位點，例如具有突觸前神經(jīng)毒素的PLA2，它們的分子中都有一個相似的疏水區(qū)。但它們的結(jié)合位點不一定就是一種。這說明了為什么具有相同生理作用的PLA2沒有競爭結(jié)合作用。這種模型的最大特點是蛋白質(zhì)是PLA2結(jié)合的位點。
為了更好地弄清PLA2結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，人們對各種不同來源的蛇毒PLA2進(jìn)行了大量的研究，其中，主要通過生化提取的方法對蛇毒進(jìn)行分離純化，然后對所得PLA2進(jìn)行氨基酸測序，并通過進(jìn)一步的功能研究來探索不同結(jié)構(gòu)的PLA2與其功能的關(guān)系的規(guī)律。如Menez等(Menez et al。1991，United Stateds Patent，5045462，pp4)根據(jù)PLA2的酸堿性和致死毒性的不同，將其劃分為3類第一類為酸性或中性的PLA2，其毒性較低，僅有對磷脂組織的降解作用；第二類為毒性極大的PLA2，這類蛋白多為單一的堿性分子或分子內(nèi)含有堿性亞基，存在于多數(shù)蛇毒中，能引起捕獵物的迅速麻痹，其特點是通過在突觸前神經(jīng)末梢阻斷乙酰膽堿的釋放或肌毒作用來引起致死毒性；第3類為一些強堿的毒性PLA2，在許多蛇毒中都含有這類PLA2，但其作用機理目前還不清楚。從80年代初至今，國內(nèi)外對陸地蛇毒PLA2的研究已相當(dāng)深入，如已成功地對30多種PLA2及與其有同源關(guān)系的蛋白或亞基的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測定，還對幾種PLA2晶體進(jìn)行了X-射線衍射研究，確定了與酶活性中心相關(guān)的氨基酸殘基(Verheii，H.M.et al.，Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.，1981，91，91；Keith，C.et al.，J.Biol.Chem.，1981，256，8602)；M.K.BHAT等(M.K.BHAT et al。Toxicon，1989，27(8)pp861-873)研究了來自NAJA NAJA NAJA的蛇毒PLA2的肌毒性，其半數(shù)致死量為2.8mg/kg；Femando Chaves等(1998，Toxicon)研究了Asp-49和Lys-49的兩類肌毒PLA2的毒性與酶活性的關(guān)系，指出兩類PLA2雖然都有強的肌毒性，但前者具有較強的酶活性而后者則不具有酶活性，由此，他們得出酶活性的有無對肌毒效應(yīng)并非起到關(guān)鍵作用的結(jié)論；L.M.S.Rudrammaji等(L.M.S.Rudrammaji et al.，Toxicon，1998，36(12)1861-1869)又從NAJA NAJA NAJA的蛇毒中提純了三中酸性PLA2，研究發(fā)現(xiàn)，它們雖不具有對小鼠的致死作用，但卻能引起小鼠足底的水腫，同時具有對艾式腹水癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性；Menez等(Menez et al.1992，US Patent，5130130，pp1-14)則從Naja nigricollis中分離純化出對MCF7，SK-N-SH，C13T等腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性的堿性PLA2，在經(jīng)過PLA2的化學(xué)修飾研究后發(fā)現(xiàn)，與天然PLA2不同，改造過的PLA2具有對腫瘤細(xì)胞作用的選擇性，而對正常細(xì)胞的作用卻很小。蛇毒PLA2在功能上的復(fù)雜多樣性，使其不僅成為生物化學(xué)家研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的極好工具，也為人們進(jìn)行癌癥、心血管等疾病的臨床治療研究提供了又一新的方向。
事實上，國外(Monaeesser和Tagnet，1953)早在1953年就首先把蛇毒用于癌癥的治療。他們用眼鏡蛇毒治療癌癥，有明顯的止痛作用，有些病例腫瘤明顯變慢，有些縮小甚至完全斑痕化；1967年Brangance從印度產(chǎn)眼睛蛇毒中分離出細(xì)胞毒素P6，該細(xì)胞毒素對實驗性腫瘤細(xì)胞如大白鼠腹水肝癌細(xì)胞、Hela細(xì)胞和KB細(xì)胞等有良好的抑制作用，后來證明P6是幾種細(xì)胞毒素的混合物，并非單一成分。Louis J.DeTolla等(LouisJ.DeTolla et al.，Toxicology，1995，9931-46)報道了來自Crotalus durissusterrificus的響尾蛇毒蛋白(簡稱CT，實際上是一種具有細(xì)胞毒性PLA2)和來自Naja naja atra的心臟毒素(CD)組成的混合物，在體內(nèi)和體外均具有明顯的抗腫瘤活性，其中，在體內(nèi)對實驗動物的抑瘤率可達(dá)到83％。我國對蛇毒抑癌的研究起步較晚，但十分活躍，中科院昆明動物研究所的研究人員將眼鏡蛇科的蛇毒對腹水癌細(xì)胞進(jìn)行作用，經(jīng)過體內(nèi)體體外實驗和幾種率試驗觀察發(fā)現(xiàn)眼鏡王蛇毒、眼鏡蛇毒、和金環(huán)蛇毒均有抗癌作用，對此有學(xué)者認(rèn)為，蛇毒的膜活性多肽對細(xì)胞膜有特殊作用，這種特殊作用使抗癌藥物易透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而增加抗癌藥物的療效，他們還發(fā)現(xiàn)，蛇毒細(xì)胞毒素對癌細(xì)胞的殺滅作用通常與膜破裂、細(xì)胞漿外滲和細(xì)胞壞死有關(guān)(覃公平主編，中國毒蛇學(xué)，第2版，1998，廣西，廣西科學(xué)技術(shù)出版社，pp538-540)。
蛇毒PLA2在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用及其作用機理的復(fù)雜性，促使人們不斷地發(fā)現(xiàn)新的更多PLA2結(jié)構(gòu)，一方面為進(jìn)一步弄清PLA2的功能提供依據(jù)，另一方面便于人們更好地利用PLA2為人類疾病的治療服務(wù)。然而，由于目前蛇毒活性多肽主要采取生化提取方法從蛇毒中獲得，成本高、純度低、難以弄清其確切成分，加上全球生態(tài)環(huán)境日益惡化帶來的資源短缺，在一定程度上制約了蛇毒PLA2的研究，所以，利用基因工程方法生產(chǎn)蛇毒PLA2具有明顯的發(fā)展優(yōu)勢。從1992年眼鏡蛇(Naja najanaja)PLA2基因被人工全合成，并在大腸桿菌中克隆與表達(dá)開始(Michaelet al.，BBA，1992，1118107-115)，有關(guān)用生物工程方法生產(chǎn)蛇毒PLA2和其它毒素多肽的報道不斷出現(xiàn)(Fu-Ming Pan et al.，Biochemical andbiophysical research communications，1998，250154-160；Long-Sen Chang etal.，Biochemical and biophysical research communications，1996，221，328-332；Long-Sen Chang et al.，Biochemical and biophysical researchcommunications，1996，225990-996；Hua Pan et al.，Toxicon，1998，36(8)1155-1163)。
海蛇廣泛地分布于印度洋和太平洋的較溫暖流域，其中大部分生存在南亞及東印度洋海岸。它們可通過平的、槳狀的尾部得以辨認(rèn)。海蛇中除了Emydocephalus annulatus外，均有很高的毒性，且比陸地蛇毒性高得多。但在毒素組成上，海蛇又比陸地蛇簡單很多。PLA2是海蛇毒液中的主要成分之一，其含量僅次于蛇神經(jīng)毒素。和陸地蛇一樣，海蛇PLA2因來源不同，在神經(jīng)毒、肌毒、細(xì)胞毒以及酶活性上，均表現(xiàn)出較大差異(Chikahisa Takasaki，1998，The Toxinology of Sea Snake Venoms，J.Toxicol.-Toxin Reviews，17(3)，361-372)。目前，國內(nèi)外對海蛇毒素的研究報道遠(yuǎn)比陸地蛇少，而且大多只停留在蛋白質(zhì)水平，從事海蛇毒素基因研究的報道更是微乎其微。至今為止，Genbank中發(fā)表的海蛇毒素氨基酸序列約有100余種，而海蛇毒素編碼基因序列發(fā)表還不到50個，其中PLA2基因只有2個。
由于海蛇毒的毒性強烈，排毒量甚微，難以采集到足夠的毒液量，因此，給分離提純海蛇毒的組分、研究毒素和酶分子的特性和結(jié)構(gòu)、以及在科學(xué)研究和實際應(yīng)用等各方面帶來一定的困難。蛇毒被譽為自然界中最集中的酶源之一，其中含有豐富的酶、毒性蛋白和活性多肽。PLA2作為蛇毒的主要成分之一，在理論研究及實際應(yīng)用中均具有重要的價值。由于PLA2具有結(jié)構(gòu)多樣性和，功能復(fù)雜性，因而弄清不同來源的PLA2的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的意義。傳統(tǒng)的研究方法多采用生化提取、分離純化以從天然蛇毒中得到PLA2組分。但由于同一種蛇毒中往往含有多種PLA2異構(gòu)體或同功酶，且它們的性質(zhì)相似，因而分離PLA2的單體較困難，而本專利用基因工程的方法，從PLA2的基因出發(fā)，通過表達(dá)、純化獲得純度較高的PLA2，并對其生物活性進(jìn)行研究，可直接將PLA2的分子結(jié)構(gòu)與其功能對應(yīng)起來。
由于PLA2能水解磷酸甘油酯，同時其生理作用是通過與特異的受體結(jié)合來完成。因而，本專利的獲得的重組PLA2可作為研究膜脂結(jié)構(gòu)和功能的工具酶。重組PLA2在臨床上具有成為抗腫瘤準(zhǔn)藥物的應(yīng)用前景。國外早已報道(見專利正文)某些蛇毒PLA2具有對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，而本專利已在實驗室證明了此點。同時在動物的抑制率實驗中，Louis J.Detolla(文獻(xiàn)見正文第三頁)證明了含有PLA2的細(xì)胞毒素混合物能起到很強的抑瘤作用，以1.8mg/kg的注射劑量開始，20天后達(dá)到6.3mg/kg的劑量，此時，含有PLA2的混合物對移植瘤小鼠的抑制率可達(dá)83％，本專利在動物體內(nèi)的進(jìn)一步抑瘤實驗將，為今后的藥物開發(fā)提供良好的基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的就是通過構(gòu)建平頦海蛇毒素cDNA文庫，從中篩選得到編碼海蛇PLA2的新基因；并利用基因工程的方法，在高效大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化出具有生物活性的重組海蛇PLA2蛋白。
本發(fā)明所選擇的海蛇是屬于海蛇科平頦海蛇屬的平頦海蛇(Hydrophiinae，Lapemis hardwickii Gray)，采自廣西省北海市。平頦海蛇毒素cDNA文庫的構(gòu)建首先解剖得到海蛇的毒囊組織，提取總RNA，然后分離出mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，最后將cDNA連接到質(zhì)粒載體pcDNA3.0上并轉(zhuǎn)化E.coli.從而構(gòu)建成平頦海蛇毒素cDNA文庫。
本發(fā)明通過對平頦海蛇毒素cDNA文庫克隆的大規(guī)模序列測定，從中得到了一個編碼平頦海蛇PLA2的cDNA克隆，命名為PLA2-9。此cDNA編碼146個氨基酸，等電點約為8.5，分子量約為14,280道爾頓，包括27個氨基酸的信號肽和119個氨基酸的成熟肽，具有典型的蛇毒PLA2的一級結(jié)構(gòu)的特征，分子內(nèi)含有14個半胱氨酸，形成7對二硫鍵。PLA2-9的核苷酸及氨基酸序列如圖4所示。
本發(fā)明通過設(shè)計了一對引物，將編碼平頦海蛇PLA2-9成熟肽的基因用PCR方法從pcDNA3.0上擴增出來，克隆到原核融合表達(dá)載體pETTRX上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pETTRX PLA2-9并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。此表達(dá)載體(pETTRX)以T7為啟動子，采用分子伴侶TRX為融合伴體，幫助重組蛋白正確折疊，以可溶的形式表達(dá)，TRX的C端有柔鏈區(qū)和6×HIS結(jié)構(gòu)，便于利用固定化金屬配體親和層析進(jìn)行純化。所設(shè)計的上游引物含有腸激酶位點，以便外源蛋白單體的獲得，且保證切割后的成熟蛋白的氨基酸數(shù)目與通過基因推算的完全一致。通過對培養(yǎng)時間，誘導(dǎo)時間，溫度等條件的摸索和優(yōu)化，PLA2-9融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的20％以上，并且基本上處于可溶狀態(tài)。
本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了PLA2-9融合蛋白的純化條件，采用超聲裂解液經(jīng)Ni2+ Chelating Sepharose親和色譜層析和Sephacryl S-100HR凝膠色譜層析兩步純化，重組PLA2-9融合蛋白純度可高達(dá)95％。經(jīng)腸激酶切割和進(jìn)一步柱層析，可得到純度在95％以上的成熟重組PLA2-9。
本發(fā)明獲得的重組平頦海蛇PLA2-9是有生物活性的。參照Magee等(Magee W.L.et al.，Biochem.J.，1960，77，pp526)報道的方法，即體外檢測酶水解卵黃卵磷脂釋放游離脂肪酸的活力，對重組PLA2-9的酶活性進(jìn)行測定，其酶活力可達(dá)到2.7×10-3mmolL-1min-1mg-1。
本發(fā)明獲得的重組平頦海蛇PLA2-9具有對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。對重組PLA2-9進(jìn)行體外抗腫瘤的活性實驗，通過MTT等方法檢測PLA2-9對HL60，SK-N-SH，MGC等腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)作用后的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞漿外滲和細(xì)胞壞死等明顯征兆，計算其對幾種細(xì)胞的IC50，大約在0.045-0.069mg/ml的范圍。有關(guān)重組蛇毒PLA2具有對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，目前國內(nèi)外還未見報道，本發(fā)明首次利用基因工程的方法，并采用融合表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)出具有抗腫瘤活性的重組海蛇PLA2，具有極高的應(yīng)用前景及產(chǎn)業(yè)開發(fā)價值。
由該表達(dá)質(zhì)粒載體經(jīng)酶切，可得到430bp的片段，即為平頦海蛇短鏈神經(jīng)毒素成熟肽編碼序列(其中包含腸激酶識別位點)；另外，表達(dá)質(zhì)粒及PLA2-9序列中均含有一Pst I酶切位點，故用Pst I酶切可得到約1.5kb的片段。(酶切結(jié)果見圖8)本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒載體的復(fù)制方法參照Sambrook(Sambrook，etal.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，用含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化細(xì)菌，減法提取質(zhì)粒。
圖8pETTrx-PLA2-9重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳分析。A)泳道1100bp標(biāo)準(zhǔn)，泳道2pETTrx-PLA2-9KpnI/NotI雙酶切，泳道3pETTrx KpnI/NotI雙酶切，泳道41Kb標(biāo)準(zhǔn)；B)泳道1100bp標(biāo)準(zhǔn)，泳道2pETTrx-PLA2-9PstI單酶切，泳道3pETTrx-PLA2-9KpnI/NotI雙酶切，泳道41kb標(biāo)準(zhǔn)。
圖9平頦海蛇重組PLA2-9在不同誘導(dǎo)時間里的表達(dá)量。1，marker；2，對照；3，在2小時時pETTrx的表達(dá)；4-7，在1小時，1.5小時，2小時，2.5小時時pETTrx PLA2-9的表達(dá)。


圖10平頦海蛇重組PLA2-9的SDS-PAGE分析。1，Marker，2，對照，3，總細(xì)菌蛋白；4，總可溶性細(xì)菌蛋白；5，部分純化的融合PLA2-9；6，純化的融合PLA2-9；7，在用Enterokinase切割融合的PLA2-9后純化的PLA2-9。
圖11重組PLA2-9的Ni2+ Chelating Sepharose親和色譜層析圖譜。A，用50mM PBS，500mM NaCl(pH7.8)洗脫；B，用50mM PBS，500mMNaCl(pH6.0)洗脫；C，用150mM咪唑，50mM PBS，500mM NaCl，(pH6.0)洗脫；D，重組PLA2-9，用500mM咪唑，50mM PBS，500mM NaCl，(pH6.0)洗脫。
圖12重組PLA2-9的Sephacryl S-100HR凝膠過濾層析圖譜。洗脫液20mM PBS，0.1M NaCl，pH7.5；流速0.4ml/min；B充足PLA2-9。
圖13重組PLA2-9對HL60細(xì)胞的細(xì)胞毒作用圖。A40小時后沒有PLA2-9的HL60細(xì)胞對照；B40小時后PLA2-9(1.1ug/孔)PLA2-9的效果；C40小時后PLA2-9(2.2ug/孔)PLA2-9的效果。
圖14重組PLA2-9對SK-N-SH細(xì)胞的細(xì)胞毒作用圖。16小時后沒有PLA2-9的SK-N-SH細(xì)胞對照；B16小時后PLA2-9(2.8ug/孔)PLA2-9的效果；C40小時后沒有PLA2-9的SK-N-SH細(xì)胞對照；D40小時后PLA2-9(2.8ug/孔)PLA2-9的效果；
圖15重組PLA2-9對MGC細(xì)胞的細(xì)胞毒作用圖。A40小時后沒有PLA2-9的MGC細(xì)胞對照；B40小時后PLA2-9(1.7ug/孔)PLA2-9的效果；D40小時后PLA2-9(3.4ug/孔)PLA2-9的效果。
實施例一 平頦海蛇毒素cDNA文庫的構(gòu)建平頦海蛇毒囊總RNA的提取參考《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)》的一步快速熱酚抽提法進(jìn)行；mRNA的提取按Amersham Pharmacia公司的mRNA Purification Kit說明書操作；cDNA的合成按Amersham Pharmacia公司的TimeSaverTM cDNA Synthesis Kit說明書操作。
采用異硫氰酸胍一步法提取的毒腺總RNA經(jīng)1％甲醛變性膠電泳檢測可見清晰的28S、18S和5.8S三條rRNA條帶，和數(shù)條特異RNA條帶(見
圖1)，表明總RNA完整性良好，而且表現(xiàn)出平頦海蛇毒腺的高分化特點。采用mRNA Purification Kit提取mRNA，電泳結(jié)果呈現(xiàn)均勻的smear(見
圖1)，表明mRNA的完整性良好。取約5μgmRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成雙鏈cDNA，電泳結(jié)果顯示cDNA呈現(xiàn)smear狀，大小在200bp到8kb的范圍內(nèi)，主要是在2kb以下的區(qū)域，在500bp附近更為集中(見圖2)，表明所合成的cDNA編碼的蛋白分子量大部分較小，這與海蛇蛇毒中富含小分子多肽的事實相吻合。將cDNA插入質(zhì)粒載體pcDNA3上構(gòu)建成cDNA表達(dá)文庫，文庫克隆數(shù)為9.96x105。提取總文庫質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR分析，結(jié)果表明cDNA插入片段大小落在500bp-8k的范圍內(nèi)，而在在500bp和1kb處出現(xiàn)較亮的泳帶(見圖3)，在其它區(qū)域還存在數(shù)條弱帶，挑取172個克隆提取質(zhì)粒，酶切鑒定表明超過95％的克隆為重組子，表明該cDNA表達(dá)文庫具有較好的質(zhì)量。
實施例二平頦海蛇磷脂酶A2基因(PLA2-9)的序列的測定和分析隨機挑選500個cDNA克隆PEG純化法(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)提取質(zhì)粒DNA。以T7和SP6為測序引物，采用ABI377 DNA Sequencer DNA自動序列儀(由大連寶生物工程有限公司提供)，正反向進(jìn)行序列測定。結(jié)果表明平頦海蛇毒腺cDNA表達(dá)文庫中毒素基因的豐度很高。其中，有三個編碼磷脂酶A2基因，分別命名為PLA2-8，PLA2-9，PLA2-73，其中PLA2-9編碼146個氨基酸的蛋白，信號肽有27個氨基酸殘基，成熟肽有119個氨基酸殘基，具有典型的蛇毒磷脂酶A2的一級結(jié)構(gòu)特征，蛋白中含有14個半胱氨酸，形成7對二硫鍵，等電點為8.5。
將PLA2-9核苷酸序列和推測的氨基酸序列通過因特網(wǎng)進(jìn)行BLAST序列相似性查詢，程序分別為BLASTN、BLASTP，結(jié)果表明PLA2-9為一全新的基因，由其推算出的編碼PLA2的成熟肽氨基酸序列在GENEBANK中找不到相同的序列，為一嶄新的氨基酸序列。
PLA2-9的核苷酸序列及由核苷酸序列推測的氨基酸序列見圖-4，該基因的序列分別由三個以上不同的cDNA克隆通過序列測定而得出，排除了可能由cDNA合成和序列測定帶來的誤差。
實施例三重組平頦海蛇磷脂酶A2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)基因PLA2-9編碼的成熟肽兩端序列，合成一對引物，序列如下上游引物，5’CGG GGT ACC GAT GAC GAT GAC AAG AAC CTC GTA CAA TTC AGC TA 3’KpnI 腸激酶位點下游引物，5’TTG CGG CCG CGG AAT TCT ATC ATT TGC AAC GTT TGT TGG 3’NotIPCR擴增、基因克隆皆按常規(guī)方法進(jìn)行。
克隆到本實驗室構(gòu)建的原核融合表達(dá)載體pETTRX上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pETTrx PLA2-9(見圖5、6)。PCR產(chǎn)物約510bp，編碼119個氨基酸殘基，外加酶切位點、腸激酶位點等(電泳結(jié)果見圖7)?？寺『蟮哪康幕蚪?jīng)酶切、測序鑒定正確(酶切結(jié)果見圖8)。
實施例四 重組平頦海蛇磷脂酶A2融合蛋白的表達(dá)將pETTRX PLA2-9轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)?；蚬こ叹暳呀馍锨逡航?jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，菌體經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物帶，分子量與用軟件PROTEIN ANALYSIS預(yù)測的理論值31kD相符。
經(jīng)過對培養(yǎng)時間，誘導(dǎo)濃度，溫度等條件的摸索(見圖9菌體擴大培養(yǎng)不同時間后誘導(dǎo)表達(dá)比較)，基因工程菌的培養(yǎng)條件為接單菌落于50ml氨卞抗性LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)物20ml接種于2L的氨卞抗性LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)至OD600＝0.6(擴大培養(yǎng)約2h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至終濃度分別為1mM和0.2％，26℃，250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)10h后離心收獲菌體。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析分析表明，在此條件下PLA2-9融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的20％以上，基本上處于可溶狀態(tài)(見10)。
實施例五 重組平頦海蛇磷脂酶A2融合蛋白的純化及成熟PLA2的獲得將收獲的總菌體用TE(pH8.0)洗滌，再用PBS(pH7.8)懸浮，超聲處理后，裂解上清也經(jīng)Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析和Sephacryl S-100HR凝膠色譜層析兩步純化，經(jīng)SDS-PAGE分析和薄層掃描分析表明重組PLA2純度分別達(dá)到85％和95％(Fig.9，10)。以2L基因工程菌培養(yǎng)物為材料，最終獲得約80mg純化的融合蛋白。
為了提高重組蛋白的得率和濃度，簡化實驗步驟，縮短對重組蛋白的處理時間，在用Ni2+親和色譜層析純化重組蛋白時，我們采用兩步法進(jìn)行純化。根據(jù)載體質(zhì)粒pETTRX所表達(dá)的外源蛋白與Ni2+親和柱的結(jié)合能力較強的特點，我們選用了較簡化的洗脫條件50mMPBS，500mMNaCl，pH7.8(A液)；50mMPBS，500mMNaCl，pH6.0(B液)；150mM咪唑，50mMPBS，500mMNaCl，pH6.0(C液)；500mM咪唑，50mMPBS，500mMNaCl，pH6.0(D液)。重組PLA2-9蛋白在D液被洗脫下來(Fig.11)。將經(jīng)Ni2+親和柱初步純化的重組蛋白直接上樣SephacrylS-100HR凝膠色譜層析，用20mMPBS，0.1MNaCl，pH7.5洗脫，根據(jù)洗脫峰(Fig.12)分段收集洗脫液，從SDS-PAGE結(jié)果來判斷分離效果最好的部分。
利用Folin-酚法測定重組PLA2的蛋白濃度，收獲濃度在0.7mg/ml以上的洗脫液，用20mMPBS，0.1MNaCl，pH7.5將蛋白濃度調(diào)至約0.7mg/ml，并加入腸激酶(Invitrogen公司產(chǎn)品)及酶切Buffer進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)體積參見Invitrogen公司EK產(chǎn)品說明書，反應(yīng)條件為25-30℃，20小時。反應(yīng)完畢后，用SDS-PAGE檢測酶切結(jié)果，可明顯看到14kD附近代表成熟PLA2的譜帶(見Fig8)。將反應(yīng)液用Ni2+ Chelating Sepharose親和色譜層析柱純化(條件同前)，收獲含成熟PLA2的穿流液，并用Sephadex G-50進(jìn)一步純化(洗脫液為PBS)，便得純度在95％以上的成熟重組海蛇PLA2-9(見Fig.10)。
實施例六 重組平頦海蛇磷脂酶A2的酶活性測定采用測定卵黃懸液渾濁度下降的方法來確定PLA2的酶活性。先將PLA2溶液對0.15mol/LNaCl透析(4℃)過夜，得PLA2-9的NaCl溶液。用0.15mol/LNaCl配制0.5-0.8ml的卵黃懸液，用巴比妥鈉調(diào)pH至6.8，加0.15mol/LNaCl使體積為2.8ml。在30℃下平衡，加0.2ml酶液，對照組加0.2ml的生理鹽水代替酶液。在925nm處測定因酶處理樣品吸收值的減少。對照樣品的吸收值定在A925nm＝0.600，每分鐘吸收值降低1mU的酶活力定為1個酶活單位。由此測得PLA2-9的酶活力為2.7×10-3mmolL-1min-1mg-1。
實施例七 重組平頦海蛇磷脂酶A2對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性鑒定參照鄂征(鄂征等，組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，1995年，北京出版社)的方法培養(yǎng)HL60，SK-N-SH和MGC三種哺乳動物腫瘤細(xì)胞(培養(yǎng)基為RPMI1640，37℃，5％CO2，飽和濕度)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，1000r/min離心5-6min(貼壁細(xì)胞先用0.125％胰酶，0.01％EDTA消化)，沉降細(xì)胞用PBS洗1次，再懸于RPMI1640培養(yǎng)基中，計數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度為105個/ml，以每孔100ul的量加入96孔板，待其培養(yǎng)至對數(shù)生長期加入PLA2-9樣(樣品溶于PBS緩沖液中)，以PBS作空白對照。48小時內(nèi)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，48小時后做MTT反應(yīng)(程寶鸞等，動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，2000，華南理工大學(xué)出版社，p131)，并用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在570nm下的光吸收值，計算每種細(xì)胞的IC50。實驗觀察表明，加樣后7、10、12小時，HL60，SK-N-SH和MGC分別開始出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞皺縮變型，細(xì)胞質(zhì)凝集等癥狀，且隨培養(yǎng)時間延長癥狀愈加明顯。進(jìn)一步觀察表明，作用后的腫瘤表現(xiàn)出細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞漿外滲和細(xì)胞壞死等癥狀(見
圖13-15)。HL60，SK-N-SH和MGC三種細(xì)胞的IC50分別為0.045mg/ml，0.057mg/ml，0.069mg/ml(見表1)。
國外曾有過報道，來自Naja nigricollis的PLA2具有對MCF-7和HL60等腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性(Menez et al.1992，US Patent，5130130，pp1-14)，但都是陸地蛇，而PLA2樣品也是通過分離純化得到。本發(fā)明首次通過基因工程的方法生產(chǎn)出具有對腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒性的重組平頦海蛇PLA2-9，不僅消除了大量采集帶來的資源浪費，而且更具有技術(shù)上的先進(jìn)性。與生化提取的陸地蛇PLA2相比，PLA2-9具有作用明顯，緩釋性強的特點。本發(fā)明不僅為海蛇新基因的功能研究提供了一套可借鑒的技術(shù)方法，而且為進(jìn)一步開發(fā)新型重組海蛇磷脂酶A2抗腫瘤藥物奠定了良好的基礎(chǔ)。
表1.不同濃度的PLA2-9作用HL60，SK-N-SH和MGC細(xì)胞48小時后MTT反應(yīng)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種分離的磷脂酶A2，它具有以下的氨基酸序列S I P P L P L N L V Q F S Y V I T C A NH G R R S S L D Y A D Y G C Y C G A G GS G T P V D E L D R C C Q I H D D C Y GE A E K Q G C Y P K M L I Y D Y Y C G SD G P Y C R N V K K K C N R M V C D C DV A A A K C F A R N A Y N N A N Y N I DT N K R C K
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的磷脂酶A2的基因。
3.按照權(quán)利要求2所述的基因，它具有如下的核苷酸序列AACCTCGTACAATTCAGCTACGTGATTACATGTGCCAACCATGGCCGTCGAAGTTCACTTGATTATGCGGACTACGGTTGCTACTGCGGCGCAGGAGGTAGCGGGACACCGGTAGATGAGTTGGATAGGTGCTGCCAAATACATGACGACTGCTATGGTGAAGCCGAAAAACAAGGATGCTACCCCAAGATGTTGATATATGATTACTACTGTGGCAGCGATGGACCCTACTGCAGAAATGTCAAAAAGAAGTGTAATCGTATGGTGTGTGATTGTGATGTCGCAGCAGCCAAGTGCTTTGCCAGAAATGCTTACAACAACGCGAACTACAATATCGACACCAACAAACGTTGCAAATGA
4.權(quán)利要求1所述的磷脂酶A2在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明通過構(gòu)建平頦海蛇(Lapemis hardwicki)毒腺cDNA文庫和DNA測序,分離出一個新的磷脂酶A
文檔編號C12N9/18GK1343772SQ00124830
公開日2002年4月10日 申請日期2000年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月18日
發(fā)明者徐安龍, 楊文利, 衛(wèi)劍文, 吳文言, 彭立勝, 鐘肖芬 申請人:中山大學(xué)