專利名稱：珍稀藥用絲狀真菌姬松茸Agaricus blazei液體培養(yǎng)的制作方法
藥用大型絲狀真菌Agaricus blazei姬松茸產(chǎn)于巴西東南部圣保羅的皮埃達(dá)山地，當(dāng)?shù)鼐用褡怨庞糜趶?qiáng)身抗病。1967年由Dr.Heireman命名。近年藥理及臨床研究結(jié)果表明A.blazei子實(shí)體所含活性多糖類(lèi)、活性核酸、植物凝集素、甾體化合物及脂類(lèi)有明顯的抗腫瘤作用。并報(bào)道姬松茸的提取液可以降低血糖和血壓、減輕特異反應(yīng)、對(duì)肝類(lèi)和愛(ài)滋病有改善效果。通過(guò)簡(jiǎn)單搖瓶發(fā)酵獲得的菌絲體、發(fā)酵液的提取物有相同活性(T.mizuno,1995)。美國(guó)Health+plus’s and Vesta’s公司已生產(chǎn)用子實(shí)體提取物做成的膠囊，用于治療AIDS病。并報(bào)道在美國(guó)和墨西哥醫(yī)院用于治療癌癥病人，包括Ⅳ期病人。
姬松茸(A.blazei)采用人工栽培較難，而且子實(shí)體培養(yǎng)場(chǎng)所占地面積大，所以人們?cè)噲D采用液體發(fā)酵培養(yǎng)的方法。據(jù)文獻(xiàn)介紹A.blazei的液體培養(yǎng)也很困難。所以，解決有工業(yè)化生產(chǎn)前途的液體培養(yǎng)工藝至今國(guó)內(nèi)外未有報(bào)道。本發(fā)明以工業(yè)化生產(chǎn)為目標(biāo)。首創(chuàng)性地發(fā)明了廉價(jià)、高度的種液菌絲培養(yǎng)基配方與液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方，以及種液菌絲培養(yǎng)工藝與液體發(fā)酵工藝。本技術(shù)的發(fā)酵工藝可在專門(mén)設(shè)計(jì)用于該菌培養(yǎng)的生物反應(yīng)器(專利申請(qǐng)?zhí)?9121894.9)中進(jìn)行。利用本發(fā)明技術(shù)可獲得高濃度的姬松茸細(xì)胞產(chǎn)物。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體步驟如下①種液菌絲培養(yǎng)基為了刺激姬松茸菌(A.blazei)細(xì)胞能以固體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下“轉(zhuǎn)移”到液體條件下生長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果表明必需加入兩種促進(jìn)細(xì)胞分化和生長(zhǎng)的因子(分別簡(jiǎn)稱為“促進(jìn)因子”1#、“促進(jìn)因子”2#)一種是柳樹(shù)枝去皮后的熱水提取液(濃度為20％)以及玉米的提取物(浸泡法濃度30％)。培養(yǎng)基中必需添加前者8.0-10.0％(V/V)，添加后者1.0-3.0％(V/V)。除此以外，為了保證細(xì)胞生長(zhǎng)的正常營(yíng)養(yǎng)需要，還應(yīng)加入1.0-2.0％的葡萄糖(或蔗糖)，(NH4)2SO40.2-0.5％,KH2PO40.05-0.15％,MgSO4.7H2O 0.04-0.08％，以及B類(lèi)維生素0.0005％。培養(yǎng)基PH值調(diào)為6.0-6.5。②液體發(fā)酵培養(yǎng)基為了保證姬松茸菌種液菌絲體在液體發(fā)酵條件下能繼續(xù)正常生長(zhǎng)而獲得較高濃度菌絲量的發(fā)酵液，必需加入一種姬松茸固體栽培條件的“類(lèi)似因子”物質(zhì)，可由米糠、麩皮、棉籽殼中選取一種或兩種廉價(jià)成份，制成30％(W/V)濃度熱水提取物，培養(yǎng)基中添加量一般為5.0-10.0％即可。其他營(yíng)養(yǎng)組成有葡萄糖(或蔗糖)2.0-5.0％,(NH4)2SO40.3-0.4％,KH2PO40.1-0.2％,MgSO4·7H2O 0.1％,B類(lèi)維生素0.0015％。培養(yǎng)基PH值調(diào)為6.0-6.5。③一種液菌絲培養(yǎng)工藝一級(jí)搖瓶種液培養(yǎng)時(shí)用特殊型搖瓶(長(zhǎng)頸球形搖瓶)代替常用的錐形瓶，有利于菌絲在液體培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)，裝液量為25％。為了同樣目的，必需使用往復(fù)式搖床代替常用的旋轉(zhuǎn)式搖床，頻率為90-120次/分。培養(yǎng)溫度25-30℃，培養(yǎng)周期2-3天為宜。二級(jí)種液菌絲培養(yǎng)反應(yīng)器裝液比為60％。通風(fēng)比控制在1∶0.5-1.0vvm，PH控制在5.0-6.0。培養(yǎng)溫度25-28C。周期1-2天為宜。④液體發(fā)酵培養(yǎng)工藝姬松茸液體培養(yǎng)采用氣升環(huán)流反應(yīng)器，最好在具有低回流區(qū)的氣升式發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行(專利申請(qǐng)?zhí)?9121894.9)，控制參數(shù)裝液量70％，可用較低的接種量8％，在低回流導(dǎo)流筒結(jié)構(gòu)由通風(fēng)比值，培養(yǎng)的前、中期為1∶1.0vvm，后期為1∶1.5vvm。嚴(yán)格控制培養(yǎng)PH值6.0-5.5。培養(yǎng)溫度26-28℃。培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生泡沫過(guò)劇，可用適量的二級(jí)豆油進(jìn)行消沫處理。⑤為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明姬松茸菌A.blazei液體培養(yǎng)，所采用的發(fā)酵反應(yīng)器為氣升環(huán)流反應(yīng)器，最好采用低回流氣升式反應(yīng)器ALR/ff(詳見(jiàn)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?9121894.9)。大型絲狀真菌的液體培養(yǎng)，由于菌絲體易破損及菌團(tuán)結(jié)壁而不應(yīng)沿用傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌罐。而普通的空氣鼓泡反應(yīng)器又效率很低。通過(guò)試驗(yàn)研究，針對(duì)該菌的菌絲形態(tài)及生理特征，為A.blazei設(shè)計(jì)了內(nèi)導(dǎo)流筒低回流區(qū)空氣提升式生物反應(yīng)器。其主要設(shè)計(jì)參數(shù)為，Ad/Ar(下降區(qū)截面積與上升區(qū)截面積之比)1.1-1.5(對(duì)于種液菌絲培養(yǎng)反應(yīng)器可取較高值)；h/H(導(dǎo)流筒高度與反應(yīng)器高度之比)≤0.45(對(duì)于種液菌絲培養(yǎng)反應(yīng)器可取較低值)。該型生物反應(yīng)器的獨(dú)特設(shè)計(jì)保證了姬松茸菌A.blazei液體培養(yǎng)條件。
實(shí)施例一生物反應(yīng)器用ALR/ff型低回流氣升反應(yīng)罐。其參數(shù)為Ad/Ar=1.158,h/H=0.420。取培養(yǎng)20天的斜面培養(yǎng)物2cm2，接于種液搖瓶。種液搖瓶的培養(yǎng)基中(％)，含有“促進(jìn)因子”1#,9.0，“促進(jìn)因子”2#,2.0，葡萄糖1.5,(NH4)2SO40.35,KH2PO40.08,MgSO4.7H2O 0.05，維生素B類(lèi)0.0005，培養(yǎng)基PH6.5。培養(yǎng)溫度26℃，往復(fù)搖床頻率110次/分。培養(yǎng)3天。以8％接種量接入ALR/ff發(fā)酵培養(yǎng)器。發(fā)酵培養(yǎng)基中(％)含有米糠提取液6.0，葡萄糖2.5,(NH4)2SO40.35,KH2PO40.15,MgSO4·7H2O0.1,B類(lèi)維生素0.0015，培養(yǎng)基PH6.5。裝液量70％。培養(yǎng)前4天，通風(fēng)比為1∶1.0v.v.m，后期1∶1.5v.v.m。發(fā)酵溫度27℃。培養(yǎng)6天，發(fā)酵PH值達(dá)5.4。最終發(fā)酵液的菌絲干重可達(dá)12.80g/每升。
實(shí)施例二本實(shí)施例中，其他條件與實(shí)施例一相同，僅改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的米糠提取物，即用量增加一倍(12％)。同樣溫度發(fā)酵6.5天。最終發(fā)酵PH值達(dá)5.2，發(fā)酵液的菌絲干重可達(dá)18.50g/每升。
權(quán)利要求
1．一種真菌液體培養(yǎng)的方法，其特征在于可適用于絲狀真菌的液體發(fā)酵，尤其是姬松茸的液體發(fā)酵工藝，本工藝的培養(yǎng)基包括含有碳源和氮源的二級(jí)種液菌絲培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有促進(jìn)細(xì)胞分化和生長(zhǎng)的因子。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬松茸的液體發(fā)酵培養(yǎng)的工藝方法，其特征在于姬松茸種液菌絲培養(yǎng)的碳、氮源培養(yǎng)基包含葡萄糖或蔗糖1.0-2.0％,(NH4)2SO40.2-0.5％,KH2PO40.05-0.15％,MgSO4·7H2O 0.04-0.08％,B類(lèi)維生素0.0005％，培養(yǎng)基的PH值范圍為6.0-6.5。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬松茸的液體發(fā)酵培養(yǎng)的方法，其特征在于姬松茸液體發(fā)酵的碳、氮源培養(yǎng)基包含葡萄糖或蔗糖2.0-5.0％,(NH4)2SO40.3-0.4％,KH2PO40.1-0.2％，B類(lèi)維生素0.0015％，培養(yǎng)基的PH值范圍為6.0-6.5。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基還要添加促進(jìn)細(xì)胞分化和生長(zhǎng)的因子，其特征在于是一種柳樹(shù)枝的浸提液和玉米的提取液(即“促進(jìn)因子”1#和“促進(jìn)因子”2#)。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的柳枝浸提液促進(jìn)細(xì)胞分化的因子，其特征在于去皮的柳樹(shù)枝浸提液更好，浸提時(shí)，固液比為20％(w/v)，浸提液在種液菌絲體培養(yǎng)基中的添加量以8.0～10.0％(v/v)為宜。
6．根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基添加玉米浸提液的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，其特征在于玉米浸提液最好采用新鮮玉米。浸泡時(shí)，固液比為30％(w/v)，在培養(yǎng)基中的添加量以1.0％～3.0％(v/v)為宜。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于該培養(yǎng)基包含，米糠、麩皮或棉子殼，使用其固液比為30％(w/v)的浸提液，最好用熱水浸提，培養(yǎng)基中添加量一般為5.0-10.0％(v/v)。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬松茸液體發(fā)酵培養(yǎng)工藝方法，其特征在于一級(jí)種液菌絲培養(yǎng)時(shí)，采用長(zhǎng)頸球型搖瓶，往復(fù)式搖床，搖床頻率為90-120次/分，培養(yǎng)溫度為25-30℃，培養(yǎng)時(shí)間為2-3天為宜，二級(jí)種液可采用反應(yīng)器，通風(fēng)比控制在1∶0.5-1.0vvm,PH5.0-6.0，培養(yǎng)溫度為25-28C，發(fā)酵周期1-2天為宜。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬松茸液體發(fā)酵工藝方法，其特征在于姬松茸液體培養(yǎng)發(fā)酵工藝，是采用氣升環(huán)流反應(yīng)器，最好采用低回流區(qū)的氣升式發(fā)酵反應(yīng)器。一般裝液量可為70％，接種量為8％，通風(fēng)比值在培養(yǎng)前、中期為1∶1.0vvm，后期為1∶1.5vvm，PH值為6.0-5.5，培養(yǎng)溫度為26-28℃。
全文摘要
珍稀藥用絲狀真菌姬松茸Agaricus blazei較難進(jìn)行子實(shí)體栽培,也難于液體培養(yǎng)。本發(fā)明以工業(yè)化生產(chǎn)為目標(biāo),首創(chuàng)性地發(fā)明了廉價(jià)高效的種液菌絲培養(yǎng)基配方與液體發(fā)酵培養(yǎng)其配方,以及種液培養(yǎng)工藝與液體發(fā)酵工藝。并使用可促進(jìn)該菌生長(zhǎng)的專門(mén)發(fā)酵反應(yīng)器,(發(fā)明專利:申請(qǐng)?zhí)?9121894.9)。至今,利用本發(fā)明技術(shù)可獲得該菌最高濃度的細(xì)胞產(chǎn)物,發(fā)酵液的菌絲以干重計(jì)可達(dá)18.50g/每升。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1303923SQ00124928
公開(kāi)日2001年7月18日 申請(qǐng)日期2000年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月7日
發(fā)明者龔建華, 蘇華, 杜遵義 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所