專利名稱：一種利用中國紅豆杉細胞生產(chǎn)紫杉烷類的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紫杉烷的生產(chǎn)方法，具體地說涉及用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉烷的方法。
云南紫杉烷(Taxuyunnanine C,Tc)與紫杉醇同屬于三環(huán)二萜類化合物，文獻(1994)Taxanes from Taxus chinensis.Phytochemistry.38:667-670.報道了該化合物，其結(jié)構(gòu)式如下 紫杉烷Tc(簡稱Tc)被推測是紫杉醇生物合成途徑中的中間代謝物，它們可以作為合成紫杉醇或其它有用物質(zhì)的前體，其本身的藥用價值也正在研究和開發(fā)之中(王紅強博士論文，華東理工大學(xué)，1998)。利用紅豆杉細胞培養(yǎng)高產(chǎn)紫杉烷作為化學(xué)半合成紫杉醇的前體具有潛在的商業(yè)生產(chǎn)價值。
自從紫杉醇的臨床抗癌活性被發(fā)現(xiàn)以來，紫杉醇以及相關(guān)的紫杉烷類化合物受到人們越來越多的關(guān)注。到目前為止，已分離得到一百多種紫杉烷，并發(fā)現(xiàn)一些紫杉烷類具有和紫杉醇相似的活性。美國食品及藥物管理局(FDA)于1992年底正式批準(zhǔn)紫杉醇可用于治療晚期卵巢癌患者。到目前為止，已有十多個國家批準(zhǔn)紫杉醇可用于癌癥的治療。但是，全世界紫杉屬植物資源很有限，而對其的需求量極大。據(jù)估計，全世界每年需要500kg的紫杉醇才能滿足廣大癌癥患者的需求。若光從樹皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200萬棵左右的大樹。即使按全世界每年需要50kg紫杉醇計算，全世界紅豆杉屬植物也僅夠砍伐10-15年。如此大量砍伐將對紅豆杉屬植物的長期存留和地區(qū)分布帶來嚴(yán)重的威脅，造成生物多樣性和生態(tài)環(huán)境的極大破壞和無法彌補的損失。所以，研究紫杉醇的其它來源已成為當(dāng)務(wù)之急。同人工栽培紅豆杉屬植株或化學(xué)全合成紫杉醇等方法相比，專利Japan Patent WO 95/14103、US Patent 5407816等報道的細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)紫杉烷類物質(zhì)由于生產(chǎn)周期短、勞動力省、成本低以及受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點通常被認(rèn)為是一種比較有效的方法。但是用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇目前仍然存在生產(chǎn)效率低的問題，達不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。誘導(dǎo)劑由于其具有的能夠刺激植物細胞次級代謝的能力而被用來進一步提高植物細胞的生產(chǎn)能力，文獻(1996)Methyl jasmonate-induced overproduction of paclitaxel and baccatin Ⅲ inTaxus cell suspension cultures.Nat.Biotechnol.14:1129-1132.和(1999)The kineticsoftaxoid accumulationin cell suspension cultures of Taxus following elicitation withmethyl jasmonate.Biotechnol.Bioeng.62:97-105.報道了茉莉酮酸類物質(zhì)能夠促進紫杉烷類物質(zhì)的產(chǎn)生。但是利用誘導(dǎo)法來提高云南紫杉烷(Tc)生產(chǎn)能力的研究還未見報道。
本發(fā)明的目的在于提供一種利用中國紅豆杉細胞(Taxus chinensis)的懸浮培養(yǎng)，通過誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)和補糖添加組合起來的生產(chǎn)云南紫杉烷(Tc)的新方法，十分顯著地提高了Tc的生產(chǎn)效率，克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。
實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟(1)中國紅豆杉細胞的培養(yǎng)將從植株幼莖外植體誘導(dǎo)愈傷組織中分離獲得的中國紅豆杉(T.chinensis)細胞，移入液體培養(yǎng)基中采用常規(guī)的方法進行繼代培養(yǎng)，該制備過程為一現(xiàn)有技術(shù)，在文獻(1997)Enhanced production oftaxol in suspension cultures of Taxuschinensis by controlling inoculum size.19:353-355.文獻中對該過程已有詳細的描述；培養(yǎng)基采用該文獻公開的Murashige-Skoog(MS)培養(yǎng)基，另添加0.1-1.0mg/L6-芐基腺嘌呤，0.05-0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，0.05-0.5mg/L萘乙酸，20-500mg/L抗壞血酸及10-50g/L蔗糖。每隔14天傳代一次，培養(yǎng)使用旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速為60-200rpm，培養(yǎng)溫度20-30℃，暗培養(yǎng)，接種量為20-200g/L濕重。
(2)Tc的生產(chǎn)將步驟(1)所獲得的中國紅豆杉濕細胞置于含上述培養(yǎng)基的搖瓶中暗培養(yǎng)(接種量為20-200g/L濕重)，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為60-200rpm，溫度20-30℃，培養(yǎng)周期為12-25天，從所獲得的培養(yǎng)物中采用常規(guī)的方法收集Tc,Tc生產(chǎn)率最高可達30.2mg/(L·d)，最高產(chǎn)量可達538.9mg/L。
在搖瓶培養(yǎng)過程中可利用誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)，在培養(yǎng)前期細胞快速生長階段，添加誘導(dǎo)劑二氫甲基茉莉酮酸酯(HMJA)或甲基茉莉酮酸酯(MJA)至培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑的最終濃度為1-1000μM；在添加誘導(dǎo)劑的同時進行補糖，補加量為10-30g/L；所說的糖為蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖等。
(3)Tc的測定方法稱取100mg干細胞，磨成細粉，加入2mL甲醇浸泡3天，離心后取上清液揮干，加入二氯甲烷和蒸餾水各2mL，充分震蕩混合后靜置數(shù)分鐘，離心取下層二氯甲烷相，揮干，加入1mL HPLC級甲醇溶解，用于Tc高效液相色譜分析。采用配有Waters 486紫外檢測儀的Waters 510(英國)型高效液相色譜儀，檢測波長為227nm。采用美國Whatman公司生產(chǎn)的五氟苯硅烷柱(PFP)。流動相為己腈∶水=42∶58，流速為1mL/min。每次進樣量為20μL，進樣前樣品用10000rpm離心取除固體雜質(zhì)。
由上述公開的技術(shù)方案可見，本發(fā)明同時利用誘導(dǎo)和補料來促進細胞的生產(chǎn)能力，獲得的Tc產(chǎn)量大大超過目前文獻報道的最高值，Tc生產(chǎn)率最高可達30.2mg/(L·d)，最高產(chǎn)量可達538.9mg/L，是一種很有工業(yè)應(yīng)用前景的Tc的生產(chǎn)方法。
以下將通過實施例對本發(fā)明的有關(guān)內(nèi)容作進一步的說明。
實施例1采用從植株幼莖外植體誘導(dǎo)愈傷組織得到的中國紅豆杉細胞。250mL搖瓶培養(yǎng)，采用MS培養(yǎng)基，另添加0.5mg/L 6-芐基腺嘌呤，0.2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，0.2mg/L萘乙酸，100mg/L抗壞血酸及30g/L蔗糖。
將真空過濾得到的5g濕細胞接種到含有50mL上述培養(yǎng)基的搖瓶中，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速110rpm,25℃培養(yǎng)。第9天添加MJA至最終濃度為100μM，繼續(xù)培養(yǎng)至21天結(jié)束發(fā)酵，收獲細胞并在40℃干燥。細胞密度在第12天達到最高(干重19.2g/L)，產(chǎn)率為1.0g/(L·d)。另外，干細胞還要進行Tc的分析測定，計算得到結(jié)果見下表(*代表最大值)。
實施例2培養(yǎng)條件同實例1，在第7天添加MJA至100μM，繼續(xù)培養(yǎng)至21天結(jié)束發(fā)酵。細胞密度在第12天達到最高(干重19.2g/L)，產(chǎn)率為1.0g/(L·d)。Tc的生產(chǎn)能力見下表。
實施例3培養(yǎng)條件同實例1，在第7天添加MJA至500μM，繼續(xù)培養(yǎng)至21天結(jié)束發(fā)酵。細胞密度在第12天達到最高(干重11.1g/L)，產(chǎn)率為0.4g/(L·d)。Tc的生產(chǎn)能力見下表。
實施例4培養(yǎng)條件同實例1。第一組作為對照；第二組在第7天添加MJA至100μM；第三組在第7天同時添加MJA至100μM，并且同時添加蔗糖20g/L，繼續(xù)培養(yǎng)至21天結(jié)束發(fā)酵，細胞密度在第18天達到最高(干重23.6g/L)，產(chǎn)率為0.89g/(L·d)。各組的Tc生產(chǎn)能力見下表。
第一組(對照)
第二組(誘導(dǎo))
第三組(同時誘導(dǎo)和補糖)
權(quán)利要求
1．一種利用中國紅豆杉細胞生產(chǎn)紫杉烷類的方法，包括從植株幼莖外植體誘導(dǎo)的愈傷組織中分離獲得中國紅豆杉細胞，其特征在于還包括如下步驟(1)將中國紅豆杉細胞移入液體培養(yǎng)基中采用常規(guī)的方法進行繼代培養(yǎng)；(2)然后將所獲得的中國紅豆杉濕細胞置于含培養(yǎng)基的搖瓶中暗培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為12-25天，從所獲得的培養(yǎng)物中采用常規(guī)的方法收集云南紫杉烷；在搖瓶培養(yǎng)前期細胞快速生長階段，添加誘導(dǎo)劑二氫甲基茉莉酮酸酯或甲基茉莉酮酸酯至培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑的最終濃度為1-1000μM。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在添加誘導(dǎo)劑的同時進行補糖，補加量為10-30g/L；所說的糖為蔗糖、葡萄糖、果糖或乳糖中的一種。
3．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，中國紅豆杉細胞的培養(yǎng)和濕細胞的搖瓶暗培養(yǎng)均采用Murashige-Skoog培養(yǎng)基，并添加0.1-1.0mg/L 6-芐基腺嘌呤，0.05-0.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，0.05-0.5mg/L萘乙酸，20-500mg/L抗壞血酸和10-50g/L蔗糖。
4．如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所說的糖為蔗糖。
5．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，中國紅豆杉濕細胞搖瓶中暗培養(yǎng)時，接種量為20-200g/L濕重，溫度為20-30℃。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用中國紅豆杉細胞生產(chǎn)紫杉烷類的方法。本發(fā)明利用中國紅豆杉細胞(Taxus chinensis)的懸浮培養(yǎng),通過誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)與補糖添加的組合,十分顯著地提高了云南紫杉烷(Tc)的生產(chǎn)效率,獲得的Tc產(chǎn)量大大超過目前文獻報道的最高值,Tc生產(chǎn)率最高可達30.2mg/(L·d),最高產(chǎn)量可達538.9mg/L,是一種很有工業(yè)應(yīng)用前景的Tc的生產(chǎn)方法。
文檔編號C12P7/12GK1288953SQ0012530
公開日2001年3月28日 申請日期2000年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月21日
發(fā)明者鐘建江, 董浩迪 申請人:華東理工大學(xué)