專利名稱：生產(chǎn)蛋白酶的方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1991年10月24日，申請(qǐng)?zhí)枮?1111128.X，發(fā)明名稱為“一種新的蛋白酶”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及一種新的蛋白酶，這種蛋白酶特異性地切割多肽的氨基酸序列上谷氨酸殘基的羧基端的肽鍵，還涉及從芽孢桿菌屬細(xì)菌中生產(chǎn)蛋白酶的方法，編碼該蛋白酶的DNA序列，含有該DNA序列的表達(dá)載體，將該表達(dá)載體引入宿主中而獲得的轉(zhuǎn)化體，以及利用該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)該蛋白酶的方法。
已知來源于金黃色葡萄球菌V8的菌株的V8蛋白酶是一種作用于蛋白質(zhì)(即多肽)并且能特異性地切割谷氨酸(Glu)殘基羧基端的肽鍵的酶(Gabriel R.Drapeau et al.,J.Biol.Chem.247,20,6720-6726,1972)。將這種酶分類為絲氨酸蛋白酶。C.Carmona等人已克隆了編碼這種酶的DNA序列(Nucl.AcidsRes.,15,6757,1987)還已知一種類似的酶，一種對(duì)酸性氨基酸殘基有特異性并且來源于放線菌灰色鏈霉菌的肽鏈內(nèi)切酶(Norio Yoshida et al.,J.Biochem.104,3,451-456,1988)。其次，還有一種來源于枯草芽孢桿菌，特異性地作用于谷氨酸殘基的蛋白內(nèi)切酶也是已知的(Takuro Niidome,Norio Yoshida,Fusahiro Ogata,Akio Ito,and Kosaku Noda,J.Biochem.108,965-970,1990)；日本生物化學(xué)學(xué)會(huì)第62屆全體會(huì)議摘要)。
前面所說的酶適用于為了進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析等而需要在前面所說的位點(diǎn)處對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性切割，或者當(dāng)使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)特定融合蛋白形式的所需蛋白，其中通過切割獲得所需蛋白時(shí)使用前面所述酶。在后一種情況，例如，當(dāng)已產(chǎn)生的所需蛋白是一種融合蛋白形式，該融合蛋白中，所需蛋白通過一個(gè)谷氨酸殘基與另一種蛋白質(zhì)連接時(shí)，可利用這樣一種酶切割而將所需蛋白分離。為此，除了上述的酶之外，非常希望能獲得具有這種類型酶活性的其他蛋白酶。
本發(fā)明的新型蛋白酶克服了上面討論的以及現(xiàn)有技術(shù)中的許多其他的缺陷和不足之處，這種酶來源于地衣形芽孢桿菌，該蛋白酶切割多肽的谷氨酸殘基的羧基端的肽鍵。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該蛋白酶來源于地衣芽孢桿菌ATCC NO.14580。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該蛋白酶有下列性質(zhì)(1)最適pH約8.0和(2)穩(wěn)定的pH范圍pH6.5～8.5，于25℃。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該蛋白酶含有從SEQ ID NO:1中的+1位絲氨酶到+222位上的谷氨酰胺之間的氨基酸序列。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該蛋白酶含有從SEQ ID NO:1中的+1位絲氨酸到+222位谷氨酰胺之間的氨基酸序列，并且切割多肽的谷氨酸殘基的羧基端的肽鍵。
本發(fā)明的DNA序列編碼上文所述的蛋白酶。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該DNA序列含有從SEQ IDNO:1的605位胸腺嘧啶殘基到1270位的腺苷殘基之間的堿基序列。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該DNA序列編碼一種蛋白酶，該蛋白酶含有從SEQ ID NO:1的-94位N-甲酰甲硫氨酸到+222位上的谷氨酰胺之間的氨基酸序列。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該DNA序列含有從SEQ ID NO:1的323位胸腺嘧啶殘基到1270位的腺苷殘基之間的堿基序列。
本發(fā)明的表達(dá)載體含有上文所述的DNA序列。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該表達(dá)載體可在芽孢桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可通過將上述表達(dá)載體引入宿主中而得到。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該宿主是芽孢桿菌屬菌株。
制備本發(fā)明的蛋白酶的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能生產(chǎn)上文所述蛋白酶的地衣形芽孢桿菌菌株以及從培養(yǎng)基中回收產(chǎn)生的蛋白酶。
制備本發(fā)明的蛋白酶的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上文所述的轉(zhuǎn)化體以及從培養(yǎng)基中回收產(chǎn)生的蛋白酶。
應(yīng)說明白，在不超出本發(fā)明范圍和精神的情況下，本領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員可以容易地進(jìn)行各種對(duì)他們來說是顯而易見的修改。因此，本發(fā)明所附帶的權(quán)利要求書的范圍并不是為了限制說明書描述的內(nèi)容，該權(quán)利要求書是用來包括所有存在于本發(fā)明中的可以被授予專利權(quán)的新穎性特征，包括所有那些與本發(fā)明相關(guān)的被本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員認(rèn)為是其等同特征的內(nèi)容。
因此，本文描述的發(fā)明是為了實(shí)現(xiàn)下面的目的(1)提供一種具有能夠在谷氨酸殘基的羧基端對(duì)多肽進(jìn)行特異性切割的酶活性的新型蛋白酶；和(2)提供一種編碼該蛋白酶的DNA序列，含有該DNA序列的表達(dá)載體，將該表達(dá)載體引入宿主而獲得的轉(zhuǎn)化體，以及利用該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)蛋白酶的方法。
本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員通過參考下面所附帶的附圖，可以更好地理解本發(fā)明以及顯而易見地明白發(fā)明的許多目的和優(yōu)點(diǎn)。


圖1-1到1-3顯示本發(fā)明蛋白酸的DNA序列以及從該DNA序列推導(dǎo)出的氨基酶序列。
圖2是用來說明構(gòu)建本發(fā)明表達(dá)載體pHY300BLtt的示意圖。
圖3是描述在本發(fā)明的表達(dá)載體pHY300BLtt的構(gòu)建過程中使用的往復(fù)性載體pHY300PLKtt的構(gòu)建過程的示意圖。
圖4顯示在從培養(yǎng)地衣形芽孢桿菌ATCC NO.14580的培養(yǎng)基中提取和純化該酶的過程中從親和柱子洗脫本發(fā)明酶的坐標(biāo)圖。
發(fā)明人曾經(jīng)進(jìn)行過多次研究，目的是從除上述的金黃色葡萄球菌等以外的微生物中獲得具有在谷氨酸殘基的羧基端切割肽的酶活性的蛋白酶。通過這些研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種從地衣形芽孢桿菌ATCC NO.14580中獲得的具有前面所說特性的新型蛋白酶。而且，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)編碼該蛋白酶的DNA序列，并且制備了含有該DNA序列的一種表達(dá)載體以及將該表達(dá)載體引入宿主中而獲得的轉(zhuǎn)化體，并發(fā)現(xiàn)了利用該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)該蛋白酶的方法，從而完善了本發(fā)明。
本發(fā)明的蛋白酶(下文中稱為BLase)是從芽孢桿菌屬細(xì)菌，尤其是地衣形芽孢桿菌ATCC NO.14580中制備的。該菌株可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。Ⅰ．培養(yǎng)條件培養(yǎng)前面所說的細(xì)菌菌株不需要特殊的培養(yǎng)基，任何類型的常規(guī)培養(yǎng)基均適用于這種培養(yǎng)。例如，可以使用一種含有葡萄糖，黃豆粉，肉汁、玉米浸出液，和各種無機(jī)鹽等的培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基pH是5-9，最好是大約7.0，合適的培養(yǎng)基溫度是15-50℃，最好約為28℃，并且用例如攪拌或振蕩而好氣性培養(yǎng)細(xì)菌約36小時(shí)。本發(fā)明的BLase酶主要是細(xì)胞外分泌的。Ⅱ．酶的收集可以單獨(dú)或聯(lián)合使用已知的酶收集和純化方法從前面所說的肉湯培養(yǎng)液中收集和純化本發(fā)明的酶。例如，將肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行擠壓過濾，超濾，和離心分離，最后得到一種不含細(xì)胞的濃縮液。通過適當(dāng)?shù)募兓椒◤脑摑饪s液中獲得本發(fā)明的酶。例如，首先將前面所說的濃縮液通過離子交換層析進(jìn)行初步純化，然后用S-Sepharose進(jìn)行層析，最后進(jìn)行親和色譜分析，從而獲得本發(fā)明的酶。在下面顯示的實(shí)施例1中，通過這種步驟得到了具有1.9×103到2.4×103u/mg活性(用下面所述的酶活性測(cè)定方法測(cè)定)的酶樣品。該酶樣品用于測(cè)定下面所述的酶特性。Ⅲ．測(cè)定酶活性的方法以Z-苯丙氨酸亮氨酸谷氨酸-pNA(其中Z是芐酯基，pNA是對(duì)-硝基苯胺基)作為底物，將它溶于50mM Tris-HCl(pH7.5，含有2mM CaCl2和2％DMF)，以使最終底物濃度達(dá)到0.2mM。將酶溶液加入這種混和物中，并在37℃使反應(yīng)進(jìn)行10分鐘，然后在410nm下測(cè)定通過酶反應(yīng)而釋放到反應(yīng)液里的對(duì)-硝基苯胺的吸收率。當(dāng)該吸收率是1.0時(shí)所存在的酶活性定義為1單位(U)。Ⅳ．酶特性本發(fā)明BLase的酶特性和蛋白質(zhì)化學(xué)特性如下(1)酶作用和底物特異性(ⅰ)制備表1中顯示的合成底物，并將它的每一種溶于50mlTris-HCl(pH7.5，含有2mM CaCl2和表1所示量的二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亞砜(DMSO))中以達(dá)到表1所示的濃度。然后在該溶液中加入本發(fā)明的酶，使反應(yīng)在25℃進(jìn)行。在410nm處測(cè)定酶反應(yīng)過程中釋放到反應(yīng)液中的對(duì)-硝基苯胺的吸收值，并計(jì)算出每分鐘內(nèi)從1mg底物中釋放出對(duì)-硝基苯胺的量(nmol)；所得結(jié)果顯示于表1中。
表1
*pNA:p-對(duì)硝基酰苯胺(ⅱ)選用氧化的胰島素B鏈作為蛋白質(zhì)底物，利用下面的步驟比較本發(fā)明的酶和從金黃色葡萄球菌中得到的V8蛋白酶作用該底物的情況。首先，將氧化的胰島素B鏈溶于50mM碳酸氫銨(pH7.8)，加入本發(fā)明的酶或前面所說的Va蛋白酶以使酶/底物比例為1/100(W/W)，并在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。然后利用一個(gè)裝有Vydac蛋白C4(300)的4.6×250mm的柱子對(duì)反應(yīng)混和物進(jìn)行HPLC分析，用0.1％TFA中的0-50％的乙腈線性梯度濃度進(jìn)行洗脫，乙腈濃度以1.67％/分鐘的速度提高。肽的結(jié)構(gòu)圖譜分析表明，使用這兩種酶中的任何一種，都切割谷氨酸殘基羧基端肽鍵，并且由這兩種酶誘導(dǎo)的酶水解產(chǎn)物彼此相同。
因此，前面所說的分析(ⅰ)和(ⅱ)的結(jié)果表明本發(fā)明的酶切割谷氨酸殘基羧基端肽鍵，并且的確是一種谷氨酸特異性肽鏈內(nèi)切酶。(2)最適pH和穩(wěn)定的pH范圍以Z-Phe Leu Glu-pNA作為底物溶于含有10％DMF和2mM CaCl2的50mM Tris-HCl中。然后，將本發(fā)明的酶加到該混和物中，反應(yīng)在37℃進(jìn)行15分鐘，在410nm處測(cè)定由酶促反應(yīng)釋放到反應(yīng)液中的對(duì)-硝基苯胺的吸收值。上述反應(yīng)在各種pH值進(jìn)行，結(jié)果表明酶反應(yīng)的最適pH是8.0。
其次，將本發(fā)明的酶以幾種不同的pH值在25℃下保溫24小時(shí)，按照上述酶活性測(cè)定方法中所述的步驟將每一種經(jīng)過這種處理的酶與底物進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果表明本發(fā)明酶的穩(wěn)定pH范圍約為4.0～10.0。在6.5～8.5pH范圍內(nèi)，酶活性維持在100％，在4.0到6.5以及8.5到10.0pH范圍內(nèi)，酶活性維持在80～100％。(3)熱穩(wěn)定性將本發(fā)明的酶在含有2mM氯化鈣pH為7.8的緩沖液中于各種溫度下維持15分鐘。在每一種情況下，按照上述酶活性測(cè)定方法中所述的步驟將經(jīng)過這種處理的酶與底物進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果表明在前面所述條件下，溫度高達(dá)60℃本發(fā)明的酶仍是穩(wěn)定的。當(dāng)以同樣條件將本發(fā)明的酶保持于不含氯化鈣的溶液中，溫度高達(dá)50℃該酶仍是穩(wěn)定的。(4)抑制劑的作用本發(fā)明的酶可以完全被二異丙基氟磷酸(DFP)抑制。這一事實(shí)表明本發(fā)明的酶屬于絲氨酸蛋白酶。
本發(fā)明的酶也完全被Z-Phe Leu Glu CH2Cl抑制。這一事實(shí)表明本發(fā)明的酶是一種谷氨酸特異性的肽鏈內(nèi)切酶。
EDTA可部分抑制本發(fā)明的酶，最大抑制率約為72％。通過加入低濃度的金屬離子(10-4到10-2的鈣離子或鎂離子等)可以使EDTA的抑制作用完全失效。
上述事實(shí)表明本發(fā)明的酶是一種典型的絲氨酸蛋白酶，其穩(wěn)定性與金屬離子的存在有關(guān)。(5)分子量利用15％凝膠(1.0mm)和RainbowTM蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物(Amersham)進(jìn)行SDS-PAGE測(cè)定本發(fā)明酶的分子量。并計(jì)算出為26,000。從根據(jù)下文中描述的基因序列分析試驗(yàn)測(cè)定的氨基酸序列也可計(jì)算出該分子量，這種方法得到的值是23,567，與上述通過SDS-PAGE獲得的值有些差異。但是，下文中描述的各種蛋白質(zhì)化學(xué)分析結(jié)果(氨基酸組成，氨基末端序列，羧基末端附近的氨基酸組成)與從DNA序列推導(dǎo)出的結(jié)構(gòu)非常一致。這一結(jié)果表明通過SDS-PAGE得到的分子量實(shí)際上稍微超過了其真正的值。(6)等電點(diǎn)用pharmacia FAST System(Pharmalite,pH3.0-10.0)測(cè)定本發(fā)明酶的等電點(diǎn)所得值在pH9.0以上，無法得到其正常值。(7)氨基酸組成用4M甲磺酸(含有0.2％的3-(2-氨基乙基)吲哚)，在110℃下使本發(fā)明的酶水解預(yù)定的時(shí)間期間(24,48或72小時(shí))。然后利用Hitachi385型氨基酸分析儀對(duì)各自的水解產(chǎn)物分別進(jìn)行氨基酸序列分析。該分析結(jié)果顯示于表2，并校正了分析過程中發(fā)生的氨基酸降解。從本發(fā)明的酶的DNA序列計(jì)算出的氨基酸組成(描述于下文)也列于表2進(jìn)行對(duì)比。兩組結(jié)果明顯地顯示出良好的一致性。
表2氨基酸組成
(8)部分氨基酸序列(ⅰ)N-末端附近的氨基酸序列利用一種477A型蛋白質(zhì)序列分析儀(Applied Biosystems)對(duì)本發(fā)明酶氨基末端附近的氨基酸序列進(jìn)行分析。予先用DFP對(duì)所用的酶樣品進(jìn)行抑制。從氨基末端到第23位殘基之間的氨基酸序列顯示于表3中。
表3
(ⅱ)C-末端附近的氨基酸序列用羧基肽酶A(CPaseA)或羧基肽酶Y(CPase Y)作用于預(yù)先用DFP抑制的本發(fā)明酶的樣品，用Hitachi 835型氨基酸序列分析儀測(cè)量這些反應(yīng)釋放出的氨基酸的量。但是，用前面所說的羧基肽酶中任一種都不能精確地測(cè)定本發(fā)明酶羧基端附近的氨基酸序列。但是，證實(shí)了羧基末端附近存在有谷氨酸，絲氨酸，丙氨酸和天冬酰胺。V．編碼BLase的DNA序列的測(cè)定本發(fā)明說明書中所用的特定術(shù)語定義如下“寡聚核苷酸”是指一種短單鏈DNA分子。寡聚核苷酸可按已知的方法進(jìn)行化學(xué)合成。除非另有說明，本發(fā)明過程中使用的寡聚核苷酸是化學(xué)合成的，并且是通過利用SephadexG50的凝膠色譜分析和利用反相硅膠柱的高效液相色譜分析(HPLC)進(jìn)行純化的。
“PCR”是“聚合酶鏈反應(yīng)”的首字母縮略詞，并且是指一種特定的DNA區(qū)的酶促擴(kuò)增方法(Saiki et al.,Science,239,487-497,1988)。首先，將所要擴(kuò)增的DNA通過熱變性轉(zhuǎn)變成單鏈形式，并將寡聚核苷酸引物(兩種類型，即有意義和反意義鏈，每一種引物具有與所說單鏈DNA的3’-末端區(qū)互補(bǔ)的序列)退大到該單鏈DNA(即模板DNA)相應(yīng)的3’-末端區(qū)域。接著，利用DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)而完成從相應(yīng)引物上DNA鏈的延伸。通過重復(fù)這種反應(yīng)步驟，靶DNA能擴(kuò)增100,000到1,000,000倍。
“Southeyn吸印試驗(yàn)”是一種用來測(cè)定由特定的限制性酶切割而獲得的DNA片段是否含有一種特定基因的方法。Southern吸印試驗(yàn)的步驟是首先用一種限制性酶消化所要測(cè)定的DNA樣品，該限制性酶特異性地識(shí)別雙鏈DNA上的特定堿基序列并且在特定的位點(diǎn)處切割該DNA。將如此獲得的消化產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，然后用堿處理使其變性為單鏈DNA，并轉(zhuǎn)移至尼龍濾紙上。另外，制備一種構(gòu)成所需測(cè)定基因一部分的寡聚核苷酸或DNA片段并進(jìn)行標(biāo)記而獲得一種探針。然后通過用該探針與尼龍濾紙上的單鏈DNA進(jìn)行雜交而檢測(cè)所需基因的存在。
“連接”是指在兩個(gè)雙鏈DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。在該技術(shù)中，為了避免雙鏈DNA片段的自身連接，采用常規(guī)方法對(duì)其中一個(gè)片段予先進(jìn)行脫磷酸化處理(T.Maniatis et al.,“Molecular Cloning”,133-134,1982)。利用公知類型的緩沖液溶液和反應(yīng)條件，用T4DNA連接酶完成連接反應(yīng)。
“轉(zhuǎn)化”是指一種通過將外源性基因(DNA)引入到所說細(xì)胞中而使該細(xì)胞(即宿主細(xì)胞)基因型發(fā)生轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。已經(jīng)歷過這種轉(zhuǎn)化過程的細(xì)胞被稱之為“轉(zhuǎn)化體”，其特征是能夠使外源性DNA作為核外成份或以整合到所說細(xì)胞染色體中的形式進(jìn)行復(fù)制。
另外，用于測(cè)定本發(fā)明的Blase的DNA序列的方法將按照所包含的步驟的順序進(jìn)行描述。通過聯(lián)合使用PCR分析，South-ern吸印分析，直接的序列分析方法等對(duì)地衣形芽孢桿菌ATCC-NO.14580的基因組DNA進(jìn)行分析而測(cè)定該DNA序列。(1)基因組DNA序列的PCR分析編碼Blase的DNA序列可從例如基因組DNA獲得。為了獲得該DNA，首先，利用常規(guī)技術(shù)從經(jīng)過培養(yǎng)的所述菌株細(xì)胞中分離出地衣形芽孢桿菌ATCC NO.14580的基因組DNA(M.Stahl et al.,J.Bacteriology,154,406-412,1983)。該基因組DNA用作為PCR分析的模板DNA。利用常規(guī)方法，根據(jù)上述第Ⅳ節(jié)第(8)項(xiàng)中測(cè)定的純化酶氨基末端附近的氨基酸序列，和/或所說酶的部分水解獲得的肽的氨基酸序列而合成用于PCR的寡聚核苷酸引物。例如，使用編碼相應(yīng)于從Blase氨基端開始計(jì)算第12位到第19位的氨基酸序列Thr Asn Thr Thr Ala Tyr ProTyr的寡聚核苷酸(見表3)作為有意義引物BL8(如SEQ ID NO:2所示)。該寡聚核苷酸是一個(gè)三嵌合聚體(tricosamer)，它編碼直到C-末端酪氨酸殘基的三聯(lián)體密碼子的第二個(gè)堿基的氨基酸序列。
T TTABL8: 5′-AC AACAC AC GCTTACCC TAC CCG另外，根據(jù)用賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶分解純化酶，隨后進(jìn)行序列分析而得到的肽并且是最可靠的序列合成另一個(gè)寡聚核苷酸引物。如下面的實(shí)施例2的描述，獲得序列Gly Tyr Pro Gly AspLys(SEQ ID NO:8)，然后，用與編碼該氨基酸序列的寡聚核苷酸互補(bǔ)的十八聚體作為反意義引物BL83(由SEQ ID NO:3表示)。
T A TC TBL83:5′-TT TC CC GGATA CCC G GA G然后，利用前面所述的基因組DNA，有意義引物BL8，以及反意義引物BL83進(jìn)行PCR，從而延伸和擴(kuò)增基因組DNA中的靶DNA鏈。如此獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到一個(gè)大約370bp的DNA片段。將該DNA片段引入一個(gè)合適的載體，并且在亞克隆后，利用Sanger技術(shù)測(cè)定該片段的堿基序列。組成制備反意義引物BL83的基本結(jié)構(gòu)的前面所說的氨基酸序列Gly Tyr Pro Gly Asp Lys被識(shí)別為位于Blase的氨基酸序列的第131-136位。(2)基因組DNA的Southern吸印試驗(yàn)分析用SalⅠ限制性內(nèi)切酶消化上面第(1)項(xiàng)中制備的來源于地衣形芽孢桿菌ATCC NO.14580的基因組DNA，在用瓊脂糖凝膠電泳分離后，將得到的DNA片段吸印到尼龍濾膜上，通過Southern技術(shù)進(jìn)行分析。用于雜交的探針是上面第(1)項(xiàng)中獲得的BL8-BL83PCR產(chǎn)物，并已通過常規(guī)方法用32p-dCTp進(jìn)行標(biāo)記。與這種BL8-BL83產(chǎn)物發(fā)生陽性雜交的DNA片段被認(rèn)為是一條與約3.1kb長度相對(duì)應(yīng)的譜帶。(3)通過PCR對(duì)基因組DNA進(jìn)行序列分析用SalⅠ消化上述第(1)項(xiàng)中獲得的地衣形芽孢桿菌ATCCNO.14580的基因組DNA，然后將這種消化產(chǎn)物引入一個(gè)合適的載體，例如，Puc119載體，用該已知DNA序列的一部分作為引物進(jìn)行PCR。例如，使用定位于前面所說基因組DNA上游的pUC119DNA序列的一部分作為有意義引物RV(由SEQ ID NO:4所示)，并且使用與上述第(2)項(xiàng)中分析的375bpDNA片段3’末端附近的序列互補(bǔ)的一個(gè)DNA序列作為反意義引物B125(由SEQ ID NO:5所示)。
RV: 5′-CAGGAAACAGCTATGACB125: 5′ -TGTCCCAACAAGTGATGA通過PCR獲得約1050bp的一個(gè)DNA片段。利用直接DNA序列分析方法可以測(cè)定該片段的堿基序列(Gibbs et al.,Pro.Natl.A-cad.Sci.U.S.A.,86,1919-1923,1989)。用這種方法，可以確認(rèn)出編碼Blase的氨基末端到該序列的中部的DNA序列。
接著，用下面的方法可以測(cè)定基因組DNA3’端的部分序列。首先，按上面描述的相同方法，用SalⅠ消化地衣形芽孢桿菌ATCC NO.14580的基因組DNA，分離出約3.1kb的片段。將該片段插入M13mp11，并進(jìn)行PCR反應(yīng)。用于該P(yáng)CR反應(yīng)的引物是上述第(2)項(xiàng)中分析的375bpDNA片段的部分片段；一種是有意義引物(由SEQ ID No:6所示)，定位于前面所說反意義引物B125的上游，另一種是反意義引物M4(由SEQ ID NO:7所示)，該引物具有與M13mp11的部分DNA序列互補(bǔ)的DNA序列，并且定位于該基因組DNA的上游。
B40: 5′-AAAACCGTCGCAACAGCCM4: 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC前面所說的PCR反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)約2.2kb的DNA片段。通過直接DNA序列分析法可以測(cè)定該DNA片段的堿基序列。以同樣的方法，測(cè)定該基因組DNA的3’末端到中間部分的堿基序列。
以這種方式測(cè)定的Blase的全部DNA序列以及從該DNA序列測(cè)得的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:1和
圖1中。從SEQID NO:1和
圖1可以看出，來源于地衣形芽孢桿菌的為成熟蛋白編碼的基因含有一個(gè)編碼信號(hào)肽的序列(其中的信號(hào)肽由從-94位的N-甲酰甲硫氨酸殘基到-1位的賴氨酸殘基之間的94個(gè)氨基酸殘基組成)，以及一個(gè)編碼成熟蛋白的DNA序列(其中成熟蛋白由從+1位的絲氨酸殘基到+222位的谷氨酰胺殘基之間的222個(gè)氨基酸殘基組成)。正常情況下，ATG編碼蛋氨酸，但在這種情況下TTG(fMet)似乎是轉(zhuǎn)譯起始密碼子。在從SalⅠ切割位點(diǎn)開始的5’未轉(zhuǎn)譯區(qū)域的332bp片段中，有一個(gè)含有-35序列的啟動(dòng)子區(qū)域，一個(gè)Pribnow盒，和一個(gè)Shine-Dal-garno序列(該序列存在于從上述推測(cè)的轉(zhuǎn)譯起始密碼子TTG上游的9個(gè)堿基)。在3’-未轉(zhuǎn)譯區(qū)中，由13個(gè)堿基對(duì)組成的反向互補(bǔ)重復(fù)區(qū)位于終止密碼子TAA下游8個(gè)堿基處。Ⅵ．構(gòu)建表達(dá)載體如圖2所示，通過將編碼SEQ ID NO:1顯示的本發(fā)明的Blase的一個(gè)DNA片段(即含有一個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)編碼信號(hào)肽的DNA序列，一個(gè)編碼Blase成熟肽的DNA序列，和一個(gè)終止因子的DNA片段)插入所說載體pHY300pLKtt，而從往復(fù)性載體pHY300PLKtt(該載體含有來源于枯草芽孢桿菌ATCC NO.6051的一個(gè)堿性蛋白酶終止因子)獲得本發(fā)明的一個(gè)典型的表達(dá)載體pHY300BLtt。如圖3中所示，通過將一個(gè)來源于枯草桿菌ATCC NO.6051的堿性蛋白酶終止因子插入載體pHY300PLK中而從載體pHY300pLK(它是大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的往復(fù)性載體)獲得前面所說的載體pHY300pLKtt。
下面按所涉及方法的順序?qū)ι鲜龇椒ㄗ鬟M(jìn)一步的解釋。首先，如圖3所示，按照M.Stahl等人(見上文)的方法從枯草芽孢桿菌ATCC NO.6051中分離基因組DNA，并將其用作模板DNA。然后，用化學(xué)方法合成一個(gè)由相應(yīng)于來源于枯草芽孢桿菌Ⅰ-168的堿性蛋白酶基因終止因子部分的5’-末端附近序列的DNA序列組成的片段，該片段帶有一個(gè)附加的×baⅠ切割位點(diǎn)，以及合成一個(gè)與相應(yīng)于終止因子部分的3’末端附近序列的一個(gè)DNA序列互補(bǔ)的片段，該片段附帶一個(gè)HindⅢ切割位點(diǎn)，并且用這些片段作為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。然后，用XbaⅠ和HindⅢ切割得到的DNA片段，從而獲得由圖3所顯示的片段(1)。接著，由XbaⅠ和HindⅢ切割pHY300PlK，從而獲得顯示于圖3的較大片段(2)。然后通過連接片段(1)和(2)而構(gòu)建往復(fù)性載體pHY300PLKtt，該載體含有來源于枯草芽孢桿菌ATCC NO.6051的堿性蛋白酶終止因子。
接著，從地衣形芽孢桿菌ATCC NO.14580的培養(yǎng)細(xì)胞中分離基因組DNA，將其用作為模板DNA。然后，合成一個(gè)由相應(yīng)于該模板DNA5’末端附近并附帶一個(gè)EcoRⅠ切割位點(diǎn)的DNA序列組成的片段以及一個(gè)與相對(duì)應(yīng)于該模板DNA3’-末端的DNA序列互補(bǔ)并附帶一個(gè)XbaⅠ切割位點(diǎn)的片段，并分別用作為有意義和反意義引物。利用前面所說的模板DNA，有意義引物，和反意義引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。然后，用EcoRⅠ和XbaⅠ切割所得到的片段，從而獲得編碼Blase的DNA片段(3)(見圖2)。該片段(3)含有一個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)編碼信號(hào)肽的DNA序列，一個(gè)編碼成熟Blase的DNA序列和一個(gè)終止因子。接著，用EcoRⅠ和XbaⅠ切割前面所說的載體pHY300PLKtt，從而獲得較大的片段(4)。然后通過連接前面所說的片段(3)和(4)而獲得本發(fā)明的表達(dá)載體pHY300BLtt(見圖2)。
該表達(dá)載體pHY300Bltt受BlaSe啟動(dòng)子的控制，含有編碼從第-94位的N-甲酰甲硫氨酸殘基到第-1位的賴氨酸殘基的信號(hào)肽的DNA序列，編碼從Blase第+1位的絲氨酸殘基延伸到第+222位的谷氨酰胺殘基的成熟肽的DNA序列；以及包括一個(gè)終止子的3’末轉(zhuǎn)譯區(qū)域。往更遠(yuǎn)的下游處，存在來源于枯草桿菌ATCC NO.6051的堿性蛋白酶終止因子。Ⅶ．轉(zhuǎn)化體的制備以及Blase的生產(chǎn)利用常規(guī)的方法將上述第Ⅵ節(jié)中獲得的表達(dá)載體引入合適的宿主中。例如，利用J.Spiezen等人的方法(proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.44,1072,1958)可將上面所說載體PHY300Bltt引入枯草桿菌ISW1214(Takara Shuzo)。在任何適合于該宿主的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體(枯草桿菌pHY300BLtt/ISW1214)，從而產(chǎn)生本發(fā)明的Blase。最后，從轉(zhuǎn)化體已培養(yǎng)成熟的肉湯培養(yǎng)基中分離出Blase，并用上述第Ⅱ部分中描述的方法進(jìn)行純化。
實(shí)施例現(xiàn)在參考特定的例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋。
實(shí)施例1在pH7.0含有2.0％葡萄糖，2.0％大豆粗粉，0.25％玉米浸漬液，0.5％硫酸銨，0.05％磷酸氫二鉀，0.05％硫酸鎂七水合物，0.01％硫酸鐵七水合物，以及0.3％碳酸鈣的培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)地衣形芽孢桿菌ATCC NO.14580 36小時(shí)。將95升肉湯培養(yǎng)基擠壓過濾，并借助于超過濾模型(Nitto UltrafiltrationModule NTU 2020T P18B(HF)；截止分子量為20,000)濃縮至約14升，并且離心(4200rpm,30分鐘)。用2mM氯化鈣將該經(jīng)過濃縮的不合細(xì)胞的肉湯培養(yǎng)基稀釋到大約28升(1.9ms/cm)。然后加入鹽酸將經(jīng)過稀釋的無細(xì)胞肉湯培養(yǎng)基的pH值調(diào)至6.0。向該溶液中加入大約4升Amberlite CG-50，該Amberlite CG-50已用含有2mM氯化鈣的10mM醋酸緩沖液(pH6.0)進(jìn)行平衡，在室溫下將該混和物攪拌4小時(shí)。在確證其上清液沒有Blase活性后，去掉上清液。然后用Amberlite CG-50裝填14×32cm玻璃柱子。用含有2mM氯化鈣的10mM乙酸緩沖液(pH6.0)約10升洗滌柱子后，用也含有2mM氯化鈣的0.5M醋酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫。
將從AmberHte CG-50洗脫得到的具有Blase活性的分餾物合并(各餾分的總體積為2.7升)并且在水中透析48小時(shí)。將透析物用2mM氯化鈣稀釋至8升(2.23ms/cm)，在將pH調(diào)節(jié)6.0后，使該液體吸附到裝填于5×40cm柱子中的約800ml S-Sepharose上，該裝填有S-Sepharrose的柱子預(yù)先已用含有2mM氯化鈣的5mM醋酸緩沖液(pH6.0)平衡過。在用約5升與用于上面所述平衡過程的緩沖液具有相同組分的緩沖液進(jìn)行洗滌后，用7升該緩沖液在0-0.2M氯化鈉線性梯度下洗脫該柱子。將具有Blase活性的分餾物合并(各餾分總體積是900ml)，在2mM氯化鈣水溶液中透析過夜，從而獲得約950ml的透析物(0.86ms/cm)。將該透析物pH調(diào)節(jié)到7.5，然后快速地進(jìn)行親和層析。該親和層析方法中使用的載體是裝填于3×48cm柱子中的約340ml的CH Sepharose4B(phe Leu-D-GluOMe)，并已用含有2mM氯化鈣的5mM Tris-HCl(pH7.5)進(jìn)行平衡。在該柱子吸附前面所說的透析物后，用與平衡柱子所用緩沖液具相同組分的緩沖液約5升洗滌該柱子，然后在0-0.7M氯化鈉線性梯度下用3.5升同樣組份的緩沖液洗脫該柱子。
利用第Ⅲ部分描述的優(yōu)選實(shí)施例顯示的測(cè)定酶活性的方法測(cè)量上述獲得的每一餾分的Blase活性，結(jié)果顯示于圖4中。測(cè)量每一餾分在280nm處的吸收值作為蛋白質(zhì)濃度的參數(shù)，如此得到的結(jié)果也顯示于圖4中。該圖表明在大約0.5M的氯化鈉濃度時(shí)可以洗脫出Blase。如此獲得的Blase在SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條單一譜帶。用這種方法，可以從95升肉湯培養(yǎng)液中獲得833.1mg的所說酶樣品(用一種BioRad蛋白測(cè)定試劑盒定量)，該樣品具有1.9×103-2×103U/mg的比活性。酶活性的產(chǎn)量為27.5％。
實(shí)施例2測(cè)定編碼Blase的DNA堿基序列(1)基因組DNA內(nèi)部堿基序列的PCR分析將100微克由實(shí)施例(1)中得到的已用DFP處理過的純化酶加入含有1M脲的150μl0.05MTris-HCl(pH9.0)中，并用1μg賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(Wako Pure Chemical Industries,Ltd)在37℃消化5小時(shí)。然后利用一個(gè)用TSKgelODS-120T裝填的柱子(4.6×250mm,Tosoh Co.Ltd)進(jìn)行高效液相色譜分析而分離和純化所得到的酶消化產(chǎn)物。用477A型蛋白質(zhì)序列分析儀(AppliedBiosystems)測(cè)定如此獲得的消化片段的氨基酸序列，從而測(cè)定出5種類型片段的氨基酸序列。其中三種序列如下所示。并表示于SEQ ID NOS:8,9和10。
Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Lys (Ⅰ)Ala-Ile-Val-His-Ile (Ⅱ)Ser-Thr-Arg-Tyr-Phe-Ile-Pro-Ser (Ⅲ)接著，利用M.Stahl等人的方法(見上文)從地衣形芽孢桿菌ATCC NO.14580中分離基因組DNA，將該DNA用作為PCR分析的模板。根據(jù)由地衣形芽孢桿菌ATCC NO.14580產(chǎn)生的Blase的氨基酸序列的已知部分可以制備用于PCR的寡聚核苷酸引物。首先，化學(xué)合成編碼從Blase分子的氨基末端的第12位開始到第19位終止的氨基酸序列(見表3)的寡聚核苷酸。該氨基酸序列是Thr Asn Thr Thr Ala Tyr Pro Tyr(除所說寡聚核苷酸僅延伸到為該寡聚肽羧基末端酪氨酸殘基編碼的三聯(lián)體的第二堿基即所說寡聚核苷酸是一個(gè)三嵌合聚體(tricosamer)的情況外)。用這個(gè)合成的寡聚核苷酸作為有意義引物BL8(顯示于SEQ ID NO:2)。
T TT ABL8:5′-AC AACAC AC GCTTACCC TAC CC G接著，用化學(xué)方法合成一個(gè)十八聚體，它與編碼某一特定氨基酸片段的DNA序列互補(bǔ)，該氨基酸片段是前面所說的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶消化產(chǎn)物并具有最大可靠程度的氨基酸序列[即GlyTyr Pro Gly Asp Lys(由SEQ ID NO:8所示)]。該十八聚體用作反意義引物BL83(如SEQ ID NO:3所示)。
T A T C TBL83:5′-TT TC CC GGATA CCC G G A G用上述模板DNA和寡聚核苷酸引物，通過PCR法(Saiki etal.,Science 239,487-491,1989)擴(kuò)增DNA。通過1％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)一部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而確證了存在有大約370bpDNA片段。分離該片段，用Klenow片段使末端平齊后，將該片段克隆于已用SmaⅠ消化的M13mp11中，通過Sanger方法(Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463-5467,1977)測(cè)定該片段的DNA序列。通過這種方法，測(cè)定375bp片段的堿基序列，并發(fā)現(xiàn)與BL83相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列定位于第131到第136位。再者，還發(fā)現(xiàn)前面所說的氨基酸序列(Ⅱ)和(Ⅲ)分別定位于第21-25位以及第79-86位。(2)基因組DNA的Southern印跡分析用限制性酶SalⅠ消化由上述第(1)項(xiàng)中描述的步驟得到的來源于地衣形芽孢桿菌ATCC NO.14580的基因組DNA，在用1％瓊脂糖凝膠電泳使產(chǎn)物分離后，將該DNA片段吸印到尼龍濾膜上并用Southern方法進(jìn)行分析。用于雜交的探針是上述第(1)項(xiàng)中獲得的BL8-BL83PCR產(chǎn)物，并已通過常規(guī)方法用32p-dcTp進(jìn)行標(biāo)記。與這種BL8-BL83產(chǎn)物顯示陽性雜交反應(yīng)的DNA片段被認(rèn)為是一條對(duì)應(yīng)于約3.1kb長度的譜帶。(3)通過PCR法測(cè)定基因組DNA的序列用SalⅠ消化上述第(1)項(xiàng)中獲得的地衣形芽孢桿菌ATCCNO.14580的基因組DNA，然后用T4DNA聚合酶使該片段形成平齊末端。將該具平齊末端的片段連接到一個(gè)脫磷酸化的SmaⅠ消化的pUC119載體上。用一種商品試劑盒(Takara Shuzo)來完成這一連接反應(yīng)。
接著，用化學(xué)方法合成有意義引物RV(如SEQ ID NO:4所示)和反意義引物B125(由SEQ ID NO:5所示)，其堿基序列也可見下文所示，將其加入等份的上述連接反應(yīng)的反應(yīng)混和物中，以便進(jìn)行PCR反應(yīng)。
有意義引物RV是PUC119的DNA序列的一部分，并定位于前面所說基因組DNA的上游，而反意義引物B125是與在前面第(2)項(xiàng)中分析的375bpDNA片段的3’末端附近的一個(gè)序列互補(bǔ)的一個(gè)DNA序列。
RV: 5′ -CAGGAAACAGCTATGACB125: 5′-TGTCCCAACAAGTGATGA通過前面所說的PCR法獲得約為1050bp的一個(gè)DNA片段。利用直接DNA序列分析法(Gibbs et al.,pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86,1919-1923,1989)可測(cè)定該片段的堿基序列。通過這種方法，確定了編碼本發(fā)明酶的DNA序列是從5’末端到該序列的中間部分。
用SalⅠ消化上述第(1)項(xiàng)中獲得的地衣形芽孢桿菌ATCCNO.14580的基因組DNA，并將催化產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，從而分離出約3.1kb的一個(gè)片段。用Klenow片段使該片段變成平齊末端，并且與脫磷酸化的已用SmaⅠ消化的M13mp11的片段連接。用它作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。用于這種PCR的引物是有意義引物的B40(如SEQ ID NO:6所示)，它是前面第(2)項(xiàng)中分析的375bpDNA片段的一部分(位于前面所述的B125引物的上游)，以及反意義引物M4(如SEQ ID NO:7所示)，它是與定位于該基因組DNA下游的M13mp11的DNA序列的一部分互補(bǔ)的一個(gè)DNA序列。
M4: 5′-GTTTTCCCAGTCACGACB40: 5′-AAAACCGTCGCAACAGCC上述PCR產(chǎn)生一個(gè)約2.2kb的DNA片段。該DNA片段的堿基序列可由直接DNA序列分析法測(cè)定。用這種方法，可以測(cè)定該基因組DNA的3’末端到中間部分的堿基序列。
由這種方法測(cè)得的Blase的全部DNA序列以及從該DNA序列推測(cè)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:1和
圖1-1到1-3。
可以利用Blase的DNA序列以及與所說DNA序列發(fā)生雜交的DNA序列生產(chǎn)具有Blase活性的蛋白酶，該酶也屬于本發(fā)明的范圍。例如，利用下面的方法可以獲得與Blase DNA序列發(fā)生雜交的DNA序列。
利用Blase的全部或一部分DNA序列如從SEQ ID NO:1的第248位的A到第1371位的T之間的一個(gè)1124bpDNA片段作為探針，對(duì)各種DHA片段，例如，來源于各種生物體的DNA片段進(jìn)行篩選。例如通過利用32p標(biāo)記的探針，以及具有下面組份的雜交緩沖液，用Southern雜交反應(yīng)技術(shù)進(jìn)行(Southern,E.M.,J.Mol.Biol.98,503-517,1975)。
O.5MNaH2PO4(pH7.2)1mM EDTA1％ BSA7％ SDS在65℃下使雜交反應(yīng)進(jìn)行過夜后，在室溫下用2×SSC,0.1％SDS洗滌已經(jīng)與探針雜交的濾膜，四次中每次洗滌在室溫下進(jìn)行10分鐘，從而獲得了與BlaseDNA序列具有約65％同源性的一個(gè)DNA片段。在50℃將濾膜再次洗滌20分鐘，可以獲得與BlaseDNA序列具有約80％同源性的一個(gè)DNA片段。(4)表達(dá)載體的構(gòu)建(4)-1構(gòu)建往復(fù)性載體pHY300PLKtt利用M.Stshl等人的方法(同上文)從地衣形芽孢桿菌ATCC NO.6051中分離基因組DNA，并將其用作模板DNA。接著，用化學(xué)方法合成由與枯草芽孢桿菌Ⅰ-168的堿性蛋白酶基因的終止因子部分的5’末端附近相對(duì)應(yīng)的DNA序列組成的一個(gè)片段(Journal of Bacteriology158,4111-418,1984)，該片段附帶一個(gè)XbaⅠ切割位點(diǎn)(有意義引物A，用SEQ ID NO:11表示)，以及合成與對(duì)應(yīng)于終止因子部分3’末端附近的一個(gè)DNA序列互補(bǔ)的一個(gè)片段，該片段附帶一個(gè)HindⅢ切割位點(diǎn)(反意義引物B，用SEQ ID NO:12表示)。以這兩種片段作為引物。
有意義引物A5’-GAGTCTAGAGCAGCTGCACAATAATAG-3’反意義引物B5’-GAGAAGCTTGACAGAGAACAGAGAAG-3’然后，利用前面所說模板DNA和這兩種引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。用XbaⅠ和HindⅢ切割如此獲得的DNA片段，從而獲得圖3中顯示的片段(1)。接著，用XbaⅠ和HindⅢ切割往復(fù)性載體pHY300PLK(Takara Shuzo)，獲得較大的片段(2)(見圖3)。然后通過將這些片段(1)和(2)連接而構(gòu)建含有枯草桿菌ATCC NO.6051的堿性蛋白酶終止因子的往復(fù)載體pHY300PLKtt。
(4)-2構(gòu)建表達(dá)載體pHY300BLtt利用M.Stshl等人的方法(同上文)從地衣形芽孢桿菌ATCC NO.14580的培養(yǎng)細(xì)胞中分離基因組DNA，并用作為模板DNA。然后，合成與該模板DNA5’末端附近相對(duì)應(yīng)的帶有一個(gè)附加的EcoRⅠ切割位點(diǎn)的一條單鏈DNA片段，以及合成與相應(yīng)于模板DNA的3’末端的DNA序列相互補(bǔ)并附帶一個(gè)XbaⅠ切割位點(diǎn)的一條單鏈DNA片段，分別作為有意義引物C(用SEQID NO:13表示)和反意義引物D(用SEQ ID NO:14表示)。
有意義引物C5’-CAAGAATTCGGCTTCCCGTGCGCCTCC-3’反意義引物D
5’-TTGTCTAGAATTTGCCGATCAGCGGTC-3’利用前面所說的模板DNA，有意義引物C，和反意義引物D進(jìn)行PCR反應(yīng)。然后，用EcoRⅠ和XbaⅠ切割如此獲得的片段，從而獲得編碼Blase的DNA片段(3)(見圖2)。接著，用EcoRⅠ和XbaⅠ切割前面所說載體pHHY300PLKtt，從而獲得較大片段(4)。然后用T4DNA連接酶連接前面所述片段(3)和(4)。將連接混合物用于轉(zhuǎn)化E.Coli K-12C600。在含有氨芐青霉素的瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，選擇具氨芐青霉素抗性的菌落。然后，從篩選出的菌落細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA，從限制性酶切割方式可以確證上述的片段(3)以正確的方位插入。(5)制備轉(zhuǎn)化體和生產(chǎn)Blase用J.Spizien等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.44,1072(1958))將上述第(4)項(xiàng)中獲得的表達(dá)載體pHY300BLtt引入枯草桿菌ISW1214(Takara Shuzo)中。然后在含有四環(huán)素的瓊脂平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)菌，并篩選四環(huán)素抗性菌落，從而獲得所需要的轉(zhuǎn)化體(枯草桿菌pHY300BLtt/ISW1214)。
將該轉(zhuǎn)化體移植到5mlLB培養(yǎng)基中(10g胰蛋白胨，5g酵母抽提物，5g氯化鈉，加水至總體積為1升；pH7.2)，并于37℃振蕩培養(yǎng)18小時(shí)。然后，把1ml這種肉湯培養(yǎng)基加入到10mlSc+培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基已在高壓滅菌器中于120℃滅菌20分鐘，于28℃下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。
Sc+培養(yǎng)基配方可溶性淀粉10g甘油 5gBacto soytone 5gCSL 2.5g酵母抽提物1g碳酸鈣3g加水至總體積為1升(pH7.0)將前面所說的肉湯培養(yǎng)液在2500×g離心5分鐘得到上清液。利用本說明書優(yōu)選實(shí)施例中所述的酶活性測(cè)定方法測(cè)定該上清液中的Blase活性。這種測(cè)定結(jié)果如表4所示。根據(jù)估計(jì)的Blase比活性為2500U/mg計(jì)算出每升肉湯培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)的量。
表4
如上所述，本發(fā)明提供一種新的蛋白酶，該蛋白酶特異性地切割多肽氨基酸的谷氨酸殘基羧基端的肽鍵，一種從芽孢桿菌屬細(xì)菌中制備蛋白酶的方法，編碼該蛋白酶的一個(gè)DNA序列，含有該DNA序列的一個(gè)表達(dá)載體，將該表達(dá)載體引入宿主中獲得的轉(zhuǎn)化體，以及利用該轉(zhuǎn)化體制備蛋白酶的方法。這種類型的蛋白酶可用于各種目的，如蛋白質(zhì)分析以及在融合蛋白的所需位點(diǎn)上切割肽鏈等。
SEQ ID NO:1序列類型有相應(yīng)蛋白質(zhì)的核苷酸序列長度1448個(gè)堿基對(duì)股數(shù)雙股局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型基因組來源生物體地衣形芽孢桿菌菌株ATCC NO.14580特征從323至1270bpCDS(E)從323至604bp信號(hào)肽(E)從605至1270bp成熟肽(E)其他信息氨基酸序列第-94位的Xaa甲酰基甲硫氨酸TCGACGGCTT CCCGTGCGCC TCCGGGATCG CTGTGATAAT TGACAACCAC ATTCATCTTT 60TCTTTTCCAA ACCGTTCTGC AACCGCCTTG CCTATACCTT TTGAAGAGCC GGTCACAATT 120GCTGTTTTTC CTTTTAAATC ACTATACAAC CTAAACACCC CTCAATTTCT TTTCTCCATG 180TACATTACCC GGTATCAATA TATGATCAAA CAAAATGTTA ATACACACCT TTAGTATGAT 240CTTTTTTAAA CATATGGAAA ATTCAGAATT ATTTTGTTAA TATCTAACTT GTACTTACAA 300CAAAATAAGG AAGTGATATG AT TTG GTT AGT AAA AAG AGT GTT AAA CGA GGT 352Xaa Val Ser Lys Lys Ser Val Lys Arg Gly-94 -90 -95TTG ATC ACA GGT CTC ATT GGT ATT TCT ATT TAT TCT TTA GGT ATG CAC 400Leu Ile Thr Gly Leu Ile Gly Ile Ser Ile Tyr Ser Leu Gly Mer His-90 -85 -80CCG GCC CAA GCC GCG CCA TCG CCT CAT ACT CCT GTT TCA AGC GAT CCT 448Pro Ala Gln Ala Ala Pro Ser Pro His Thr Pro Val Ser Ser Asp Pro-75 -70 -65TCA TAC AAA GCG GAA ACA TCG GTT ACT TAT GAC CCA AAC ATT AAG AGC 496Ser Tyr Lys Ala Glu Thr Ser Val Thr Tyr Asp Pro Asn Ile Lys Ser-60 -55 -50GAT CAA TAC GGC TTG TAT TCA AAA GCG TTT ACA GGC ACC GGC AAA GTG 544Asp Gln Tyr Gly Leu Tyr Ser Lys Ala Phe Thr Gly Thr Gly Lys Val-45 -40 -35AAT GAA ACA AAG GAA AAA GCG GAA AAA AAG TCA CCC GCC AAA GCT CCT 592Asn Glu Thr Lys Glu Lys Ala Glu Lys Lys Ser Pro Ala Lys Ala Pro-30 -25 -20 -15TAC AGC ATT AAA TCG GTG ATT GGT TCT GAT GAT CGG ACA AGG GTC ACC 640Tyr Ser Ile Lys Ser Val Ile Gly Ser Asp Asp Arg Thr Arg Val Thr-11 5 10AAC ACA ACC GCA TAT CCG TAC AGA GCG ATC GTT CAT ATT TCA AGC AGC 688Asn Thr Thr Ala Tyr Pro Tyr Arg Ala Ile Val His Ile Ser Ser Ser15 20 25ATC GGT TCA TGC ACC GGA TGG ATG ATC GGT CCG AAA ACC GTC GCA ACA 736Ile Gly Ser Cys Thr Gly Trp Met Ile Gly Pro Lys Thr Val Ala Thr30 35 40GCC GGA CAC TGC ATC TAT GAC ACA TCA AGC GGT TCA TTT GCC GGT ACA 784Ala Gly His Cys Ile Tyr Asp Thr Ser Ser Gly Ser Phe Ala Gly Thr45 50 55 60GCC ACT GTT TCG CCG GGA CGG AAC GGG ACA AGC TAT CCT TAC GGC TCA 832Ala Thr Val Ser Pro Gly Arg Asn Gly Thr Ser Tyr Pro Tyr Gly Ser65 70 75GTT AAA TCG ACG CGC TAC TTT ATT CCG TCA GGA TGG AGA AGC GGA AAC 880Val Lys Ser Thr Arg Tyr Phe Ile Pro Ser Gly Trp Arg Ser Gly Asn80 85 90ACC AAT TAC GAT TAC GGC GCA ATC GAA CTA AGC GAA CCG ATC GGC AAT 928Thr Asn Tyr Asp Tyr Gly Ala Ile Glu Leu Ser Glu Pro Ile Gly Asn95 100 105ACT GTC GGA TAC TTC GGA TAC TCG TAC ACT ACT TCA TCA CTT GTT GGG 976Thr Val Gly Tyr Phe Gly Tyr Ser Tyr Thr Thr Ser Ser Leu Val Gly110 115 120ACA ACT GTT ACC ATC AGC GGC TAC CCA GGC GAT AAA ACA GCA GGC ACA 1024Thr Thr Val Thr Ile Ser Gly Tyr Pro Gly Asp Lys Thr Ala Gly Thr125 130 135 140CAA TGG CAG CAT TCA GGA CCG ATT GCC ATC TCC GAA ACG TAT AAA TTG 1072Gln Trp Gln His Ser Gly Pro Ile Ala Ile Ser Glu Thr Tyr Lys Leu145 150 155CAG TAC GCA ATG GAC ACG TAC GGA GGA CAA AGC GGT TCA CCG GTA TTC 1120Gln Tyr Ala Met Asp Thr Tyr Gly Gly Gln Ser Gly Ser Pro Val Phe160 165170GAA CAA AGC AGC TCC AGA ACG AAC TGC AGC GGT CCG TGC TCG CTT GCC 1168Glu Gln Ser Ser Ser Arg Thr Asn Cys Ser Gly Pro Cys Ser Leu Ala175 180 185GTA CAC ACA AAT GGA GTA TAC GGC GGC TCC TCG TAC AAC AGA GGC ACC 1216Val His Thr Asn Gly Val Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Arg Gly Thr190 195 200CGG ATT ACA AAA GAG GTG TTC GAC AAT TTG ACC AAC TGG AAA AAC AGC 1264Arg Ile Thr Lys Glu Val Phe Asp Asn Leu Thr Asn Trp Lys Asn Ser205 210 215 220GCA CAA TAATACACGA AGACAGCCCG CTTCCTTTTG GAACGGGCTG TCACATCTAA 1320Ala GlnCGGCCGTATA CTTAATTTCC TTTAAGCCTG TACTTTTTGC CATCTATTGA TATCGTGAAA1380TTTGAAGGAC CGCTGATCGG CAAATAATAG ACAAGCTGAA ACTCCGCTTC CTCACCAGGT1440TTGAATGG 1448SEQ ID NO:2序列類型核苷酸序列長度23堿基對(duì)股數(shù)單股局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，合成DNAACYAACACYA CYGCTTACCC RTA 23SEQ ID NO:3序列類型核苷酸序列長度18個(gè)堿基對(duì)股數(shù)單股局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，合成DNA
YTTRTCKCCM GGATAKCC 18SEQ ID NO:4序列類型核酸序列長度17個(gè)堿基對(duì)股數(shù)單股局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，合成DNACAGGAAACAG CTATGAC17SEQ ID NO:5序列類型核酸序列長度18個(gè)堿基對(duì)股數(shù)單股局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，合成DNATGTCCCAACA AGTGATGA 18SEQ ID No:6序列類型核酸序列長度18個(gè)堿基對(duì)股數(shù)單股局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，合成DNAAAAACCGTCG CAACAGCC 18
SEQ ID No:7序列類型核酸序列長度17個(gè)堿基對(duì)股數(shù)單股局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，合成DNAGTTTTCCCAG TCACGAC17SEQ ID NO:8序列類型氨基酸序列長度6個(gè)氨基酸局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型肽片段類型內(nèi)部片段來源生物體地衣形芽孢桿菌菌株ATCC NO.14580Gly Tyr Pro Gly Asp Lys1 5SEQ ID NO:9序列類型氨基酸序列長度5個(gè)氨基酸局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型肽片段類型內(nèi)部片段來源生物體地衣形芽孢桿菌菌株ATCC NO.14580Ala Ile Val His Ile1 5SEQ ID NO:10序列類型氨基酸序列長度8個(gè)氨基酸局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型肽片段類型內(nèi)部片段來源生物體地衣形芽孢桿菌菌株ATCC NO.14580Ser Thr Arg Tyr Phe Ile Pro Ser1 5SEQ ID NO:11序列類型核酸序列長度27個(gè)堿基對(duì)股數(shù)單股局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，合成DNAGAGTCTAGAG CAGCTGCACA ATAATAG 27SEQ ID NO:12序列類型核酸序列長度26個(gè)堿基對(duì)股數(shù)單股局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，合成DNAGAGAAGCTTG ACAGAGAACA GAGAAG 26SEQ ID NO:13序列類型核酸序列長度27個(gè)堿基對(duì)股數(shù)單股局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，合成DNACAAGAATTCG GCTTCCCGTG CGCCTCC 27SEQ ID NO:14序列類型核酸序列長度27個(gè)堿基對(duì)股數(shù)單股局部解剖結(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，合成DNA
TTGTCTAGAA TTTGCCGATC AGCGGTC2權(quán)利要求
1．一種生產(chǎn)蛋白酶的方法，其包括下列步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)通過構(gòu)建表達(dá)載體并將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主而得到的轉(zhuǎn)化體，其中表達(dá)載體含有編碼蛋白酶的DNA序列，所述蛋白酶切割多肽的谷氨酸殘基的羧基端肽鍵，并且來源于地衣形芽孢桿菌；從培養(yǎng)基中回收所產(chǎn)生的蛋白酶。
2．權(quán)利要求1的方法，其中蛋白酶來源于地衣形芽孢桿菌ATCCNo.14580。
3．權(quán)利要求1的方法，其中蛋白酶具有下列特性(1)最適pH約為8.0，以及(2)穩(wěn)定的pH范圍pH為6.5-8.5,25℃。
4．一種生產(chǎn)蛋白酶的方法，其包括下列步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)通過構(gòu)建表達(dá)載體并將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主而得到的轉(zhuǎn)化體，其中表達(dá)載體含有編碼蛋白酶的DNA序列，所述蛋白酶切割多肽的谷氨酸殘基的羧基端肽鍵，并且含有SEQ ID No:1的+1位絲氨酸到+222位谷氨酰胺的氨基酸序列；從培養(yǎng)基中回收所產(chǎn)生的蛋白酶。
5．權(quán)利要求4的方法，其中DNA序列含有SEQ ID No:1的605位胸腺嘧啶殘基到1270位的腺嘌呤殘基的堿基序列。
6．權(quán)利要求4的方法，其中蛋白酶含有SEQ ID No:1的-94位N-甲酰甲硫氨酸到+222位的谷氨酰胺的氨基酸序列。
7．權(quán)利要求6的方法，其中DNA序列含有SEQ ID No:1的323位胸腺嘧啶殘基到1270位的腺嘌呤殘基的堿基序列。
8．權(quán)利要求1-7的方法，其中所述宿主是芽孢桿菌菌株。
9．一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體的方法，其包括下列步驟構(gòu)建含有編碼蛋白酶的DNA序列的表達(dá)載體，所述蛋白酶切割多肽的谷氨酸殘基的羧基端肽鍵，并且來源于地衣形芽孢桿菌；并將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主。
10．權(quán)利要求9的方法，其中蛋白酶來源于地衣形芽孢桿菌ATCCNo.14580。
11．權(quán)利要求9的方法，其中蛋白酶具有下列特性(1)最適pH約為8.0，以及(2)穩(wěn)定的pH范圍pH為6.5-8.5,25℃。
12．一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體的方法，其包括下列步驟構(gòu)建含有編碼蛋白酶的DNA序列的表達(dá)載體，所述蛋白酶切割多肽的谷氨酸殘基的羧基端肽鍵，并且含有SEQ ID No:1的+1位絲氨酸到+222位谷氨酰胺的氨基酸序列；將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主。
13．權(quán)利要求12的方法，其中DNA序列含有SEQ ID No:1的605位胸腺嘧啶殘基到1270位的腺嘌呤殘基的堿基序列。
14．權(quán)利要求12的方法，其中蛋白酶含有SEQ ID No:1的-94位N-甲酰甲硫氨酸到第+222位的谷氨酰胺的氨基酸序列。
15．權(quán)利要求14的方法，其中DNA序列含有SEQ ID No:1的323位胸腺嘧啶殘基到1270位的腺嘌呤殘基的堿基序列。
16．權(quán)利要求9-15的方法，其中所述宿主是芽孢桿菌菌株。
全文摘要
提供了一種來源于地衣形芽孢桿菌的新型蛋白酶。該蛋白酶切割多肽的谷氨酸殘基羧基端的肽鍵。該蛋白酶含有從SEQID NO:1的第+1位絲氨酸到第+222位谷氨酰胺之間的氨基酸序列。
文檔編號(hào)C12R1/10GK1310232SQ00126248
公開日2001年8月29日 申請(qǐng)日期2000年8月19日 優(yōu)先權(quán)日1990年10月24日
發(fā)明者寺岡宏, 玉木干男, 中村悅男, 新優(yōu), 吉田信男, 續(xù)木博茂, 藤原孝司, 松本浩一 申請(qǐng)人:鹽野義制藥株式會(huì)社