專利名稱：東方田鼠特異dna序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種從東方田鼠分子遺傳學(xué)標(biāo)志序列和其抗日本血吸蟲相關(guān)基因序列。屬于基因工程、生物技術(shù)、分子遺傳學(xué)標(biāo)志領(lǐng)域。
東方田鼠是我國血吸蟲病疫區(qū)唯一對日本血吸蟲病具有抗性的嚙齒類哺乳動物，國內(nèi)從60年開始，對東方田鼠為什么能對抗日本血吸蟲感染進(jìn)行了一系列研究，當(dāng)人工感染日本血吸蟲尾蚴于東方田鼠后，盡管日本血吸蟲蟲體在感染后11天內(nèi)能正常發(fā)育，但從第12天開始，蟲體發(fā)育停滯，到第20～28天蟲體在東方田鼠體內(nèi)全部消亡。經(jīng)解剖數(shù)以萬計的東方田鼠，無一只發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲或蟲卵。說明東方田鼠具有對抗日本血吸蟲感染的特性。1999年國家科技部將東方田鼠抗日本血吸蟲機(jī)理研究作為“九五”國家科技攻關(guān)項目予以立項支持，對其進(jìn)行分子遺傳學(xué)標(biāo)志的建立和抗性基因克隆研究，從東方田鼠基因組內(nèi)獲得對抗日本血吸蟲的這一特異性DNA片段。東方田鼠的分子遺傳學(xué)背景是一片空白，經(jīng)國際互聯(lián)網(wǎng)查詢，在幾個國際知名的基因數(shù)據(jù)庫中均無有關(guān)東方田鼠的DNA序列資料，更無任何有關(guān)東方田鼠分子遺傳學(xué)標(biāo)志序列和抗日本血吸蟲相關(guān)基因序列，本發(fā)明的東方田鼠特異性DNA序列是世界首次克隆、測序獲得，并被美國基因數(shù)據(jù)庫Genbank中登錄(登錄號AF277394)。
本發(fā)明的目的是將東方田鼠具有對抗日本血吸蟲感染的遺傳特性和分子遺傳學(xué)標(biāo)志，并從中獲得這一基因DNA片段進(jìn)行克隆、測序，再使用基因重組技術(shù)得到該抗血吸蟲病的基因產(chǎn)品，應(yīng)用于人類對日本血吸蟲病感染的預(yù)防和治療。
實現(xiàn)本發(fā)明目的的方法是采用DNA提取技術(shù)、基因體外擴(kuò)增、分子雜交、基因重組技術(shù)、DNA序列分析技術(shù)、生物信息分析技術(shù)等；首先設(shè)計出小鼠H2基因外顯子2引物，用該引物擴(kuò)增東方田鼠基因組DNA，得到DNA片段并經(jīng)測序后，再設(shè)計內(nèi)引物進(jìn)行體外擴(kuò)增東方田鼠基因組DNA，將得到的DNA片段經(jīng)測序后，獲得了東方田鼠的特異性DNA片段的核苷酸序列。
以下是對本發(fā)明基因序列作進(jìn)一步說明一種東方田鼠抗日本血吸蟲特異DNA相關(guān)基因序列的獲得，首先設(shè)計合成小鼠H2基因外顯子2(包括外顯子2及兩測序列)的引物擴(kuò)增東方田鼠基因組DNA。設(shè)計出小鼠H2基因外顯子2引物，其序列是H2E2．1 5’-ATGTACCAAGTACCGTTTGCGT-3’H2E2．2 5’-CTGCTTAGCCTCCCTGAGCTG-3’擴(kuò)增東方田鼠基因組DNA后將其產(chǎn)物(DNA片段)回收、測序，再合成內(nèi)引物進(jìn)行體外擴(kuò)增。內(nèi)引物序列是MF上游引物741MF2．1 5’-ACCACTGCGACCTGGTGGTTGTGT-3’A741mf2．1 5’-CACTGCGACCTGGTGGTTGTGTTC-3’MF下游引物741MF2．2 5’-TCCTTCTTACTCCGTGGGTGACC-3’B741mf2．2 5’-TTCCTTCTTACTCCGTGGGTGAC-3’將上游引物和下游引物交替配對(741MF2．1對741MF2．2；741MF2．1對B741MF2．2；A741MF2．1對741MF2．2；A741MF2．1對B741MF2．2)，組成4對引物或者4種引物混合使用，進(jìn)行東方田鼠基因組DNA體外擴(kuò)增，用于基因分型、物種鑒定、分子遺傳學(xué)標(biāo)志確定產(chǎn)品開發(fā)。由內(nèi)引物擴(kuò)增東方田鼠基因組DNA，得到一條特異性的區(qū)帶。將特異的PCR產(chǎn)物克隆、序列測定，切除兩端多余部分，其長度為618bp，在Genbank中進(jìn)行同源性比較，沒有發(fā)現(xiàn)高度同源序列。經(jīng)證實用這些特異引物同時擴(kuò)增人、昆明小鼠、Balb／小鼠、C57小鼠和東方田鼠基因組DNA，只有東方田鼠的樣品能夠擴(kuò)增出這樣一條特異性區(qū)帶，其他樣品均為陰性(無特異性區(qū)帶)。以東方田鼠618bp特異片段作為探針，進(jìn)行斑點雜交，只有在東方田鼠DNA樣品中能得到陽性信號，而在所檢測的幾種其它物種樣品中均無特異陽性信號。用MF上游引物和MF下游引物擴(kuò)增東方田鼠基因組所獲得特異性DNA片段其核苷酸序列是1 tccttcttactccgtgggtgaccgggtgactgggtgactgacccctgatattctcctgtc 6061 cttgttctcttgctcctccttctcccttctctcagGGTTCTCCTTCTATTTATCCTCTCT120V L L L F I L S121 TCCTGCCAGCCCCACCTATCCTTGCCCCTGCATCGTTATTGGCCAGTCATCTTTTTATTA180S C Q P H L S L P L H R Y W P V I F L L
181 GGACCATCAGGTGTTTTAGACAGACACAGTAACACAGCTTCAGAGTTAAACAAATACAGC240G P S G V L D R H S N T A S E L N K Y S241 ATAAACAAAAGTTACACACCTGAAAATAATATTCCCCCAAATTCACTCTTTCCTTGCCTC300I N K S Y T P E N N I P P N S L F P C L301 TTgtcatcctttctgctttggccaccagggcactagcagcagtcatcagattccagagcc360L361 aagacacagaagaggcgaagacacgtaaaggaaattatagacactcttgccatttgcatt420421 gaaaatagcacaaccgccggatggtggtgtgcacacctttaattccagcactcgagaggc480481 agaggcaagcgggatctctgtgagttcgaggccagcctggtctacaagagctagttccag540541 gacaggctccaaagctacagagagaccctatatgtgcagcgggatggggaggaggaacac600601 aaccaccaggtcgcagtg 618東方田鼠特異DNA序列由于其單個苷酸多態(tài)性(SNP)形成的等位基因，根據(jù)東方田鼠特異DNA序列的等位基因序列，可設(shè)計引物或通過其它方式進(jìn)行東方田鼠基因分型、物種鑒定、分子遺傳學(xué)標(biāo)志確定產(chǎn)品開發(fā)。將擴(kuò)增所得到的特異性東方田鼠基因組DNA序列及其等位基因進(jìn)行基因分型、物種鑒定、分子遺傳學(xué)標(biāo)志確定。對東方田鼠特異DNA片段進(jìn)行進(jìn)一步分析得到編碼的多肽產(chǎn)物，這種多肽編碼產(chǎn)物的序列是VLLLFILSSCQPHLSLPLHRYVVPVIFLLGPSGVLDRHSNTASELNKYSINKSYTPENNIPPNSLFPCLLSSFLLVVPPGH利用多肽編碼產(chǎn)物(部分或全部)可以進(jìn)行抗日本血吸蟲的系列產(chǎn)品開發(fā)。東方田鼠特異DNA序列及其等位基因編碼的多肽產(chǎn)物序列，兩頭延伸，但包含了上述序列進(jìn)行抗日本血吸蟲病防治產(chǎn)品開發(fā)。
將東方田鼠特異DNA序列的等位基因(部分或全部)插入真核表達(dá)載體、原核表達(dá)載體和其它表達(dá)載體，生產(chǎn)抗日本血吸蟲的蛋白質(zhì)，用于抗日本血吸蟲病的防治。將東方田鼠特異DNA序列及其等位基因序列兩頭延伸，但包含了上述序列，插入真核表達(dá)載體、原核表達(dá)載體或其它表達(dá)載體，生產(chǎn)抗日本血吸蟲病的蛋白質(zhì)基因藥物。
本發(fā)明的用途在于利用MF上游引物和MF下游引物可以擴(kuò)增東方田鼠基因組DNA，進(jìn)行基因分型、物種鑒定、分子遺傳學(xué)標(biāo)志的確定。同時，利用東方田鼠特異DNA片段的核苷酸序列及其等位基因，設(shè)計引物或通過其它方式，進(jìn)行東方田鼠基因分型、物種鑒定，分子遺傳標(biāo)志確定。根據(jù)東方田鼠特異DNA片段的核苷酸序列及其等位基因和以上序列編碼的多肽產(chǎn)物，可以生產(chǎn)出抗日本血吸蟲的相關(guān)蛋白質(zhì)，進(jìn)行抗日本血吸蟲病的產(chǎn)品開發(fā)與研究。


圖1為東方田鼠基因組DNA體外擴(kuò)增結(jié)果顯示圖。
圖2為東方田鼠620bp片段與其它幾種基因組DNA的斑點雜交結(jié)果顯示圖。
實施例如圖1所示，經(jīng)證實東方田鼠基因組DNA體外擴(kuò)增結(jié)果M100bpDNA ladder1-5為東方田鼠基因組DNA，而人、昆明小鼠、Bbalb／c小鼠、C57小鼠基因組DNA無擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖2所示，經(jīng)東方田鼠618bp片段與其它幾種基因組DNA的斑點雜交后，A1～A6顯示東方田鼠基因組DNA；B1～B3顯示Balb／c小鼠基因組DNA，B4～B6顯示C57小鼠基因組DNA，C1～C6顯示昆明小鼠基因組DNA，D1～D6顯示人基因組DNA。
權(quán)利要求
1.一種東方田鼠抗日本血吸蟲病相關(guān)基因序列是利用小鼠H2基因外顯子2設(shè)計的引物進(jìn)行體外擴(kuò)增，設(shè)計的引物序列是H2E2．1 5’-ATGTACCAAGTACCGTTTGCGT-3’H2E2．2 5’-CTGCTTAGCCTCCCTGAGCTG-3’其特征在于將設(shè)計的引物進(jìn)行體外擴(kuò)增東方田鼠基因組DNA后，將其產(chǎn)物(DNA片段)回收、測序，再設(shè)計合成出內(nèi)引物進(jìn)行體外擴(kuò)增，其內(nèi)引物序列是MF上游引物741MF2．1 5’-ACCACTGCGACCTGGTGGTTGTGT-3’A741mf2．1 5’-CACTGCGACCTGGTGGTTGTGTTC-3’MF下游引物741MF2．2 5’-TCCTTCTTACTCCGTGGGTGACC-3’B741mf2．2 5’-TTCCTTCTTACTCCGTGGGTGAC-3’
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東方田鼠抗日本血吸蟲的相關(guān)基因序列，其特征在于將上游引物和下游引物交替配對(741MF2．1對741MF2．2；741MF2．1對B741MF2．2；A741MF2．1對741MF2．2；A741MF2．1對B741MF2．2)，組成4對引物或者4種引物混合使用，進(jìn)行東方田鼠基因組DNA體外擴(kuò)增，用于基因分型、物種鑒定、分子遺傳學(xué)標(biāo)志確定產(chǎn)品開發(fā)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的東方田鼠特異DNA序列，其特征在于利用MF上游引物和MF下游引物擴(kuò)增后得到的DNA片段并測序，得到東方田鼠特異DNA序列，其東方田鼠特異DNA序列是1 tccttcttactccgtgggtgaccgggtgactgggtgactgacccctgatattctcctgtc 6061 cttgttctcttgctcctccttotcccttctotcagGGTTCTCCTTCTATTTATCCTCTCT120V L L L F I L S121 TCCTGCCAGCCCCACCTATCCTTGCCCCTGCATCGTTATTGGCCAGTCATCTTTTTATTA180S C Q P H L S L P L H R Y W P V I F L L181 GGACCATCAGGTGTTTTAGACAGACACAGTAACACAGCTTCAGAGTTAAACAAATACAGC240G P S G V L D R H S N T A S E L N K Y S241 ATAAACAAAAGTTACACACCTGAAAATAATATTCCCCCAAATTCACTCTTTCCTTGCCTC300I N K S Y T P E N N I P P N S L F P C L301 TTgtcatcctttctgctttggccaccagggcactagcagcagtcatcagattccagagcc360L361 aagacacagaagaggcgaagacacgtaaaggaaattatagacactcttgccatttgcatt420421 gaaaatagcacaaccgcoggatggtggtgtgcacacctttaattccagcactcgagaggc480481 agaggcaagcgggatctctgtgagttcgaggccagcctggtctacaagagctagttccag540541 gacaggctccaaagctacagagagaccctatatgtgcagcgggatggggaggaggaacac600601 aaccaccaggtcgcagtg 618
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的東方田鼠特異DNA序列，其特征在于將擴(kuò)增得到東方田鼠特異性DNA序列編碼的多肽產(chǎn)物(部分或全部)能進(jìn)行日本血吸蟲病防治的產(chǎn)品開發(fā)，其多肽編碼的序列是VLLLFILSSCQPHLSLPLHRYWPVIFLLGPSGVLDRHSNTASELNKYSINKSYTPENNIPPNSLFPCLLSSFLLWPPGH
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的東方田鼠特異DNA序列，其特征在于東方田鼠特異DNA序列由于其單個核苷酸多態(tài)性(SNP)形成的等位基因，根據(jù)東方田鼠特異DNA序列的等位基因序列，設(shè)計引物或通過其它方式進(jìn)行東方田鼠基因分型、物種鑒定、分子遺傳學(xué)標(biāo)志確定的產(chǎn)品開發(fā)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的東方田鼠特異DNA序列，其特征在于將東方田鼠特異DNA序列或者東方田鼠特異DNA序列的等位基因序列，部分或全部插入真核表達(dá)載體、原核表達(dá)載體和其它表達(dá)載體，生產(chǎn)抗日本血吸蟲蛋白質(zhì)的基因藥物。
7.按照權(quán)利要求3或6所述的東方田鼠特異DNA序列，其特征在于將東方田鼠特異DNA序列及其等位基因序列兩頭延伸，但包含了上述序列，插入真核表達(dá)載體、原核表達(dá)載體或其它表達(dá)載體，生產(chǎn)抗日本血吸蟲的蛋白質(zhì)。
8.按照權(quán)利要求4所述的東方田鼠特異DNA序列，其特征在于東方田鼠特異DNA序列及其等位基因編碼的多肽產(chǎn)物序列，兩頭延伸，但包含了上述序列，進(jìn)行日本血吸蟲病防治的產(chǎn)品開發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種東方田鼠特異DNA序列,該序列為抗日本血吸蟲相關(guān)基因序列。依據(jù)小鼠H2外顯子2及其兩側(cè)序列,設(shè)計引物,抗增東方田鼠基因組DNA,將擴(kuò)增產(chǎn)物測序后設(shè)計合成內(nèi)引物再進(jìn)行東方田鼠基因組DNA體外擴(kuò)增,得到特異性擴(kuò)增帶并進(jìn)行序列分析,證實抗日本血吸蟲相關(guān)基因序列只存在于東方田鼠基因組,其中有一個編碼多肽鏈的外顯子。利用該相關(guān)基因序列可進(jìn)行基因分型、物種鑒定、分子遺傳學(xué)標(biāo)志確定,并對抗日本血吸蟲的基因藥物生產(chǎn)具有重要應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/63GK1295126SQ0012660
公開日2001年5月16日 申請日期2000年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月26日
發(fā)明者胡維新, 楊榕, 彭興華 申請人:湖南醫(yī)科大學(xué)