專利名稱：一種細胞結構的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到用細胞器顯色劑檢測細胞結構的方法。
近年來，細胞結構的研究已經取得很大進展，然而，現有的方法多以免疫反應為基礎，其中所用的抗原抗體及熒光標記物的制備均較復雜，條件要求很高，需較昂貴的設備且耗時較長。因此，探討一種新的簡單快速省事而可靠的方法便成為當前之重要課題。
本發(fā)明的目的之一在于提供一種利用細胞器顯色劑檢測細胞結構、信息傳遞、細胞周期及小分子物質運轉的方法。
本發(fā)明的目的之二在于提供一種利用細胞器顯色劑診斷惡性腫瘤的方法。
本發(fā)明利用細胞器顯色劑檢測細胞結構的方法包括步驟如下1)培養(yǎng)細胞；2)加入細胞器顯色劑；和3)觀察細胞結構。
本發(fā)明中可用的細胞器顯色劑包括四唑及其復合物。
上述四唑及其復合物包括3-(4,5-二甲噻唑-2-基)-2,5-聯苯四唑溴(MTT，又稱四唑溴，英文名為3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)；噻唑蘭(TB)，英文名為thiazolyl blue,2-(2 Benzothiazolyl)-5-styryl-3-(4phthalhydrazidyl)tetrazolium chloride;
四唑蘭，又稱二氧3,3’-[3,3’-二甲氧基(1,1’-聯苯)-4,4’-二基]-二[2,5聯苯-2H-四唑]，英文名為tetrazolium blue:3,3’-[3,3’-dimethoxy(1,1’-biphenyl)-4,4’-diyl]-bis[2,5-diphenyl-2H-tetrazolium]dichloride;
(1H)-四唑，英文名為1H-tetrazole；四唑紅(1,3,5-三苯四唑，或氯化2,3,5-三苯四唑)，英文名為tetrazolium red:1,3,5-triphenyltetrazolium or 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride:
氯化(2,3,5-三苯-2-H-四唑，英文名為2,3,5-triphenyl-2-H-tetrazolium;
氯化5-氰基-2,3-二聯甲苯四唑(CTC)，英文名為5-cyano-2,3-ditolyltetrazolium chloride;
P-碘硝基四唑紫羅蘭，又稱(2-[4-典苯]-3-[4-硝基苯]-5-苯基四唑氯)(INT)，英文名為p-iodonitrotetrazolium violet or(2-[4-iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetrazolium chloride;
硝基四唑紫羅蘭；氯化碘硝基四唑；四唑紫羅蘭；紫羅蘭四唑，又稱氯化(2,5-聯苯-3-[α-奈基]-四唑)，英文名為tetrazoliumviolet:(2,5-diphenyl-3-[α-naphthyl]-tetrazolium chloride;
氯化2(P-碘苯)-P-硝基苯-5-苯四唑(INPT)，英文名為2-(p-iodophenyl)-p-itrophenyl-5-phenyltetrazolium chloride;
氯化P-硝基蘭四唑；氯化硝基蘭單四唑；氧化硝基新四唑；氯化m-硝基蘭四唑；氯化蘭四唑；胡椒基四唑蘭，英文名為piperonyl tetrazolium blue；甲苯基四唑紅(oTTR或p-TTR)，英文名為o-Tolyl tetrazolium red，或p-Tolyl tetrazolium red；氯化新四唑，又稱氯化2,2’,5,5’-四苯-3,3’-[p-二亞苯]二四唑)，英文名為neotetrazolium chloride:(NT:2,2’,5,5’-tetraphenyl-3,3’-[p-diphenylene]ditetrazolium chlorid);
氧化硝基蘭四唑，也稱氯化P-硝基蘭四唑，或氯化2,2’-雙-硝基苯-5,5’-二苯基-3,3’[3,3’-二甲氧-4,4二次苯基]-二四唑(NBT)，英文名為nitro blue tetrazoliumor p-nitrotetrazolium blue or 2,2’di-p-nitrophenyl-5,5’-diphenyl-3,3’[3,3’-dimethoxy-4,4’diphenylene]-tetrazolium chloride；四硝基蘭四唑(TNBT)，英文名為tetranitro blue tetrazolium；硝基蘭四唑(NBT)，英文名為nitro blue tetrazolium氯化2,2’-二[p-硝苯]-5,5’-二[p-硫代氨基甲酰苯]-3,3’-[3,3’-二甲氧-4,4’-二亞苯]二四唑(TC-NBT)，英文名為2,2’-di[p-nitrophenyl]-5,5’di[p-thiocarbamylphenyl]-3,3’-[3,3’-dimethoxy-4,4’-biphenylene]ditetrazolium chloride，又稱硫代氨基甲酰硝基蘭四唑，英文名為thiocarbamylnitro blue tetrazolium；四唑化聯茴香胺(TTD)，英文名為tetrazotized 0-dianisidine；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2 H-四唑鹽(MTS)，英文名為3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium salt;
4-(3-碘苯基)-2-(4-硝基苯)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸鹽(WST-1)，英文名為4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate;
2,2-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-羧基酰基苯胺(XTT)，英文名為2,2-bis(2-methoxyl-4-notro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide;
1-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴(1-DDTT)，英文名為1-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-iphenyltetrazolium bromide;
四唑溴，又稱3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴(3-DDTT)，英文名為3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-iphenyltetrazolium bromide;
3’-[1-[(苯基氨基)-碳酰]-3,4-四唑]-雙(4-甲氧基-6-硝基)苯-磺基酸氫氧化鈉(PCTT)，英文名為sodium 3’-[1-[phenylamino)-carbonyl]-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro)benzene-sulfonic acid hydrate)；氯化茴香蘭四唑(pABT或pApNBT)，英文名為p-Anisyl blue tetrzolium chloride，或p-Anisyl-p-nitro blue tetrazolium chloride；藜胡基四唑蘭。
以上細胞器顯色劑(細胞器晶體化物質)可單選或多選。
多選較單選作用效果好?？筛鶕煌康倪x用不同的細胞器顯色劑。如，四唑紅可用于中心體的染色，而MTT則用于微絲微管、內織網、細胞核、核膜、中心粒、中心體、紡錘體等的染色。
本發(fā)明中的主要成份可因不同需要而制成各種劑型，也可因不同需要而制成各種濃度。
本發(fā)明細胞器顯色劑的濃度因具體情況而定，可從0.1微克/毫升-800微克/毫升，以5微克/毫升-500微克/毫升為佳，以20微克/毫升-200微克/毫升為最佳。
本發(fā)明明細胞器顯色劑可制成多種劑型。如，針劑、渾懸液、軟膏及固態(tài)如顆粒及粉末。但不限于此。
本發(fā)明中的細胞器包括所有細胞結構和微絲微管系統(tǒng)包括所有亞細胞結構，如，但不限于，內織網、細胞核、核膜、核板、核質、核孔復合體、核套、染色體、染色質、核心管、著絲粒、端粒、漿膜、高爾基體、中心粒、溶酶體、中心體、旁中心粒物質、收縮環(huán)、核糖體、核內體、吞噬體、蛋白酶體、過氧物酶體、紡錘體、微絨毛、鞭毛、纖毛、及其它微絲微管等。
本發(fā)明中的細胞器也包括位于上述結構上的蛋白及小分子肽等。
作為三羧酸循環(huán)的關鍵酶，琥珀酸脫氫酶除了存在于線粒體，還廣泛分布于其它細胞器中，在腫瘤細胞中較正常細胞明顯增高。當含四唑的復合物存在時，琥珀酸脫氫酶可將之轉化為相應的晶體產物。由于琥珀酸脫氫酶借其膜嵌頓蛋白牢固結合于細胞器的膜性結構上，所形成的晶體并非游離于胞漿及細胞外液，而是集中在富含該酶的細胞器上。晶體化的細胞結構在顯微鏡下清晰可見。
癌細胞中的琥珀酸脫氫酶較正常細胞明顯增高，癌細胞中的細胞結構較正常細胞明顯異常。其中，中心體及微絲微管等數量明顯增多。當含四唑的復合物存在時，琥珀酸脫氫酶可將之轉化為相應的晶體產物從而使富含琥珀酸脫氫酶的細胞結構晶體化。由于琥珀酸脫氫酶借其膜嵌頓蛋白牢固結合于細胞器的膜性結構上，所形成的晶體并非游離于胞漿及細胞外液，而是集中在富含該酶的細胞器上。晶體化的細胞結構在顯微鏡下清晰可見。比較細胞結構晶體化的程度有利于細胞良惡性的鑒別。細胞結構的晶體化不僅導致細胞的機械性損失，還可引起功能停滯，信息傳遞受阻，細胞分裂停滯。
本發(fā)明檢測細胞結構的方法的基礎是新的細胞器顯色劑的應用。琥珀酸脫氫酶除了存在于線粒體，還廣泛分布于其它細胞器，在腫瘤細胞較正常細胞明顯增高。琥珀酸脫氫酶是腫瘤賴以生存的物質基礎，其作用是維持腫瘤細胞及其血管的無限增生除能夠清除瘤細胞中的抗癌物質或降低腫瘤細胞對抗癌物質的攝取從而降低許多化療藥物的抗腫瘤作用并導致交叉耐藥性的產生外并可調節(jié)保護系統(tǒng)及功能系統(tǒng)的活性及表達。因此，以琥珀酸脫氫酶為主的細胞器顯色劑不僅可以用作細胞結構的檢測，而且可以用于細胞性質的鑒別。具有廣泛的應用基礎。
本發(fā)明還確定了許多藥物，特別是抗有絲分裂藥物均作用于琥珀酸脫氫酶。因此，這一發(fā)現為評價此類藥物的治療效果提供了一種新的方法及理論指導。
本發(fā)明應用一種細胞器顯色劑檢測細胞結構的方法可通過以下實施例進一步加以說明，但不限于此。
實施例1觀察腦腫瘤細胞中心體。
將9L膠質肉瘤細胞培養(yǎng)24小時，然后加入四唑紫羅蘭20微克/毫升，處理5-10小時，觀察細胞中心體，如


圖1(放大200倍)。圖中可見瘤細胞中心體呈星狀結構。
實施例2觀察肺腫瘤細胞中心體。
將SHP77肺癌細胞培養(yǎng)24小時，然后加入四唑紅70微克/毫升處理12小時，觀察細胞中心體，如圖2(放大200倍)。圖中可見瘤細胞中心體呈星狀結構。
實施例3觀察腦腫瘤細胞微管結構。
將9L膠質肉瘤細胞培養(yǎng)24小時，然后加入MTT30微克/毫升處理4-8小時，觀察細胞微管結構，如圖3(放大400倍)。圖中可見瘤細胞做管結構放射狀伸展。
實施例4觀察肺腫瘤細胞微管結構。
將SHP77肺癌細胞4000培養(yǎng)24小時，然后加入MTT50微克/毫升處理12小時，觀察細胞做管結構，如圖4(放大400倍)。圖中可見瘤細胞微管結構放射狀伸展。
實施例5觀察腦腫瘤細胞溶酶體結構。
將9L膠質肉瘤細胞培養(yǎng)24小時，然后加入MTT30微克/毫升處理12-18小時，觀察腦腫瘤細胞線粒體結構。如圖5(放大200倍)。圖中可見腫瘤細胞線粒體呈珍珠狀包圍細胞核。
實施例6觀察腦腫瘤細胞核膜和/或內織網結構。
將9L膠質肉瘤細胞培養(yǎng)24小時，然后加入MTT30微克/毫升處理12-24小時，觀察腦腫瘤細胞核膜和/或內織網結構。如圖6(放大200倍)。圖中可見腫瘤細胞、腦腫瘤細胞核膜和/或內織網結構環(huán)層狀包圍細胞核。
除上述應用外本發(fā)明應用細胞器顯色劑檢測細胞結構的方法還可應用于腫瘤細胞的診斷及鑒別診斷、細胞結構的動態(tài)觀察。監(jiān)測抗癌藥物特別是抗細胞分裂藥物的療效，以及小分子物質的運轉、細胞信息傳遞以及細胞周期等領域的研究。因此，本發(fā)明將對細胞生物學及腫瘤學的研究產生巨大的推動作用，具有非常廣泛的應用前景及顯著的經濟和社會價值。
上述實施例旨在舉例說明而非僅局限于應用細胞器顯色劑檢測細胞結構的方法。
權利要求
1．一種細胞結構的檢測方法，包括應用一種可經琥珀酸脫氫酶還原成晶體的細胞器顯色劑，具體步驟如下1)培養(yǎng)細胞；2)加入細胞器顯色劑；和3)觀察細胞結構。
2．根據權利要求1所述的細胞結構的檢測方法，其特征在于，所述細胞器顯色劑包括四唑及其復合物。
3．根據權利要求2所述細胞結構的檢測方法，其特征在于，所述細胞器顯色劑四唑及其復合物包括3-(4,5-二甲噻唑-2-基)-2,5-聯苯四唑溴、噻唑蘭、四唑蘭，(1H)-四唑、四唑紅、氯化2,3,5-三苯-2-H-四唑、氯化5-氰基-2,3-二聯甲苯四唑、P-碘硝基四唑紫羅蘭、硝基四唑紫羅蘭、氯化碘硝基四唑、四唑紫羅蘭，紫羅蘭四唑、氯化2(P-碘苯)-P-硝基苯-5-苯四唑、氯化P-硝基蘭四唑、氯化硝基蘭單四唑、氯化硝基新四唑、氯化m-硝基蘭四唑、氯化蘭四唑、胡椒基四唑蘭、甲苯基四唑紅、氯化新四唑、氯化硝基蘭四唑、四硝基蘭四唑、硝基蘭四唑、氯化2,2’-二[p-硝苯]-5,5’-二[p-硫代氨基甲酰苯]-3,3’[3,3’-二甲氧-4,4’-二亞苯]二四唑、四唑化聯茴香胺、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽、4-[3-(碘苯基)-2-(4-硝基苯)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸鹽、2,2-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-羧基?；桨?、1-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴、四唑溴、3’-[1-[(苯基氨基)-碳酰]-3,4-四唑]-雙(4-甲氧基-6-硝基)苯-磺基酸氫氧化鈉、氯化茴香蘭四唑、藜胡基四唑蘭，以上細胞器晶體化物質可單選或多選。
4．根據權利要求1所述細胞結構的檢測方法，其特征在于，所述細胞器顯色劑包括所有亞細胞結構，如，內織網、細胞核、核膜、核板、核質、核孔復合體、核套、染色體、染色質、核心管、著絲粒、端粒、漿膜、高爾基體、中心粒、溶酶體、中心體、旁中心粒物質、收縮環(huán)、核糖體、核內體、吞噬體、蛋白酶體、過氧物酶體、紡錘體、微絨毛、鞭毛、纖毛、及其它微絲微管。
5．根據權利要求1所述細胞結構的檢測方法，其特征在于，所述細胞器顯色劑可從0.1微克/毫升～800微克/毫升，以5微克/毫升～500微克/毫升為佳，以20微克/毫升～200微克/毫升為最佳。
6．根據權利要求1所述細胞結構的檢測方法，其特征在于，所述的細胞包括源于人及動物的正常及腫瘤細胞、炎癥細胞，具有亞細胞結構的微生物細胞、各種雜交瘤細胞。
7．根據權利要求1所述細胞結構的檢測方法，其特征在于，所述細胞器顯色劑可制成各種劑型及藥合，如針劑、渾懸液、軟膏及固態(tài)如顆粒及粉末。
8．一種診斷惡性腫瘤的方法，包括使用權利要求1-7所述的細胞結構的檢測方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用細胞器顯色劑檢測細胞結構的方法。該方法細胞器顯色劑可經琥珀酸脫氫酶還原成晶體,從而使富合該酶的細胞器及微管系統(tǒng)晶體化,便于顯微鏡觀察。本發(fā)明的方法能簡便、快速、有效地檢測細胞結構,具有很高的應用價值。
文檔編號C12Q1/00GK1299876SQ0012931
公開日2001年6月20日 申請日期2000年11月13日 優(yōu)先權日2000年11月13日
發(fā)明者孔慶忠 申請人:孔慶忠