專利名稱：編碼eno基因的新核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了編碼eno基因的核苷酸序列，和用棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸、尤其是L-賴氨酸的方法，其中棒狀細(xì)菌中eno基因是擴(kuò)增的。
氨基酸、尤其是L-賴氨酸用于人用藥物及制藥工業(yè)，但特別是用于動(dòng)物營養(yǎng)。
已知氨基酸可通過棒狀細(xì)菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于氨基酸的極其重要性，已持續(xù)進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對抗代謝物如賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸有抗性或重要的調(diào)節(jié)氨基酸營養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株。
一段時(shí)間以來，重組DNA技術(shù)的方法也用于棒桿菌的生產(chǎn)氨基酸的菌株的改良，其是通過擴(kuò)增個(gè)體氨基酸生物合成基因，并研究對氨基酸生產(chǎn)的影響來改良生產(chǎn)氨基酸的棒桿菌菌株。相關(guān)參考文獻(xiàn)有Kinoshita(“谷氨酸細(xì)菌”，工業(yè)微生物的生物學(xué)，Demain和Solomon編輯，Benjamin Cummings，英國倫敦，1985，115-142)，Hilliger(BioTec 2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸，6261-272(1994))，Jetten和Sinskey(生物技術(shù)關(guān)鍵綜述15，73-103(1995))和Sahm等(紐約科學(xué)協(xié)會(huì)年報(bào)782，25-39(1996))。
本發(fā)明人目的在于為改良發(fā)酵制備氨基酸、特別是L-賴氨酸而提供新措施。
氨基酸、尤其是L-賴氨酸用于人用藥物及制藥工業(yè)，但特別是用于動(dòng)物營養(yǎng)。因而感興趣的是提供新的制備氨基酸，尤其L-賴氨酸的改良方法。
當(dāng)在下文提及L-賴氨酸或賴氨酸時(shí)，不僅僅是堿，還可以是鹽，如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。
本發(fā)明提供了來自棒狀細(xì)菌的分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼包括與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及d)包括a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其優(yōu)選是能復(fù)制的DNA，包括(ⅰ)SEQ ID NO1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于序列(ⅰ)的至少一個(gè)序列，或(ⅲ)與互補(bǔ)于序列(ⅰ)或(ⅱ)的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地，(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中義突變。
本發(fā)明還提供了權(quán)利要求4的多核苷酸，包括SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，權(quán)利要求6的多核苷酸，其編碼包括SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽，含有權(quán)利要求1的多核苷酸的載體，特別是穿梭載體或質(zhì)粒載體，以及含有所述載體的作為宿主細(xì)胞的棒狀細(xì)菌。
本發(fā)明還提供了多核苷酸，其基本上包括一個(gè)多核苷酸序列，其可通過用含有SEQ ID NO1所述多核苷酸的序列或其片段的探針雜交相應(yīng)的基因文庫，并分離所述的DNA序列來篩選獲得，所述的文庫含有具有相應(yīng)于SEQ ID NO1的多核苷酸序列的完整基因。本發(fā)明的多核苷酸序列適用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼烯醇化酶的全長cDNA，以及分離與烯醇化酶基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列還適用作通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備編碼烯醇化酶的DNA或基因的引物。
作為探針或引物的這種寡核苷酸含有至少30個(gè)、優(yōu)選至少20個(gè)、特別優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)堿基。具有至少40或50個(gè)堿基對的寡核苷酸也是合適的。
“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來。
“多核苷酸”一般地指多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。
“多肽”應(yīng)理解為包括經(jīng)肽鍵結(jié)合的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽，特別是具有烯醇化酶生物學(xué)活性的多肽，以及與SEQ ID NO2的多肽至少70％、優(yōu)選至少80％相同、特別是與SEQ ID NO2的多肽至少90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本發(fā)明還提供了用尤其已生產(chǎn)氨基酸的棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸、尤其L-賴氨酸的方法，其中編碼eno基因的核苷酸序列是擴(kuò)增的，尤其是超量表達(dá)的。
文中術(shù)語“擴(kuò)增”是指微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶的胞內(nèi)活性的提高，例如通過提高基因的拷貝數(shù)，或用強(qiáng)啟動(dòng)子或編碼高活性相應(yīng)酶的基因，及如果需要組合使用這些方法。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸，此微生物可以是棒狀細(xì)菌的代表菌，尤其是棒桿菌屬。在棒桿菌屬中尤其應(yīng)提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
適當(dāng)?shù)陌魲U菌菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032醋谷棒桿菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC 13870嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539Corynebacterium melassecola ATCC17965黃色短桿菌ATCC 14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC 14020和從中獲得的生產(chǎn)生產(chǎn)L-賴氨酸的突變體或菌株如谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709黃色短桿菌FERM-P 1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P 1712谷氨酸棒桿菌FERM-P 6463谷氨酸棒桿菌FERM-P 6464和谷氨酸棒桿菌DSM5715本發(fā)明人已成功地分離谷氨酸棒桿菌的編碼烯醇化酶(EC4．2．1．11)的eno基因。
為了分離谷氨酸棒桿菌的eno基因或其他基因，首先在大腸桿菌中建立這一微生物的基因文庫?？筛鶕?jù)通常已知的教材和手冊建立基因文庫。例如由Winnacker所著教材基因與克隆，基因工程入門(Verlag Chemie，Weinheim，德國，1990)，或由Sambrook等所著手冊分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。一非常熟知的基因文庫是已由Kohara等(細(xì)胞50，495-508(1987))在λ載體中建立的E．coli K-12菌株W3110的基因文庫。Bathe等(分子及普通遺傳學(xué)，252255-265，1996)闡述了借助于粘粒載體SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA，842160-2164)，在E．coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中建立的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因文庫。Bormann等(分子微生物學(xué)6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。為在大腸桿菌中制備谷氨酸棒桿菌的基因文庫，也可使用質(zhì)粒如pBR322(Bolivar，生命科學(xué)25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19259-268)。合適的宿主尤其是限制和重組缺陷的大腸桿菌菌株，一個(gè)例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美國科學(xué)院院報(bào)7(1990)4645-4649)所述。借助于粘粒克隆的長DNA片段隨后可亞克隆并用適于測序的通用載體測序，如Sanger等(美國科學(xué)院院報(bào)745463-5467，1977)所述。
以此方式可獲得編碼eno基因的谷氨酸棒桿菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO1，用前述方法從此DNA序列中也已衍生出相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。所得eno基因產(chǎn)物的氨基酸序列以SEQ IDNO2表示。
通過遺傳密碼的簡并性從SEQ ID NO1產(chǎn)生的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分。同樣，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。另外，蛋白質(zhì)中的保守氨基酸置換，如丙氨酸和甘氨酸的置換，或谷氨酸和天冬氨酸的置換，本領(lǐng)域已知是“有義突變”，其不引起蛋白質(zhì)活性的基本改置換，本領(lǐng)域已知是“有義突變”，其不引起蛋白質(zhì)活性的基本改變，即是功能中性的。另外已知蛋白質(zhì)N和／或C-末端的改變基本不影響其功能，或者甚至可以穩(wěn)定其功能，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在以下文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)對此的論述，參見Ben-Bassat等(細(xì)菌學(xué)雜志169751-757(1987))O’Regan等(基因77237-251．(1989))，Sahin-Toth等(蛋白質(zhì)科學(xué)3240-247(1994))，Hochuli等(生物／技術(shù)61321-1325(1988))，及已知關(guān)于遺傳和分子生物學(xué)的教材。以相應(yīng)方式產(chǎn)生自SEQ ID NO2的氨基酸序列也是本發(fā)明的一部分。
同樣，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的組成部分。最后，用產(chǎn)生自SEQ ID NO1的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備的DNA序列也是本發(fā)明的組成部分。這種寡核苷酸典型地具有至少15bp的長度。
通過雜交鑒別DNA序列的指導(dǎo)可參見寶靈格曼海姆有限公司的手冊“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)用戶指南”(曼海姆，德國，1993)以及Liebl等(系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)國際雜志(1991)41255-260)。用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA序列的指導(dǎo)參見Gait的手冊寡核苷酸合成實(shí)用方法(IRL出版社，英國牛津，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德國，1994)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，eno基因超量表達(dá)后，棒狀細(xì)菌以改進(jìn)的方式生產(chǎn)氨基酸特別是L-賴氨酸。
為獲得超量表達(dá)，可提高相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或可使位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點(diǎn)突變。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以同樣方式工作。通過可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，在L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)期間增強(qiáng)表達(dá)也是可能的。通過目的在于延長mRNA壽命的措施，也可改良表達(dá)。通過防止酶蛋白的分解也可提高酶活性?；蚧蚧驑?gòu)建體可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或可在染色體中整合與擴(kuò)增?；蛘撸ㄟ^改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件，也可獲得相關(guān)基因的超量表達(dá)。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員從以下文獻(xiàn)中可發(fā)現(xiàn)對此的詳述，參見Martin等(生物／技術(shù)5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物／技術(shù)6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專利說明書EPS0472869，美國專利4，601，893，Schwarzer和Puhler(生物／技術(shù)9，84-87(1991))，Reinscheid等(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60，126-132(1994))，LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175，1001-1007(1993))，專利申請WO 96／15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特許公開JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術(shù)及生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物學(xué)綜述60512-538(1996))及已知關(guān)于遺傳及分子生物學(xué)的教材。
例如，本發(fā)明的eno基因可用質(zhì)粒超量表達(dá)。適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒是那些在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒。一些已知質(zhì)粒載體如pZ1(Menkel等，應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)(1989)64549-554)，pEKEx1(Eikmanns等，基因10293-98(1991))，或pHS2-1(Sonnen等，基因10769-74(1991))，是基于隱蔽性質(zhì)粒pHM1519，pBL1或pGA1。其它質(zhì)粒載體，如那些基于pCG4(US-A4，489，160)，或pNG2(Serwold-Davis等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信66，119-124(1990))，或pAG1(US-A5，158，891)的載體可以相同方式使用。
另外，除eno基因之外，超量表達(dá)特定生物合成途徑，糖酵解，回補(bǔ)反應(yīng)，檸檬酸循環(huán)或氨基酸輸出的一或多種酶，對氨基酸尤其是L-賴氨酸的生產(chǎn)是有益的。
因此，例如，當(dāng)生產(chǎn)L-賴氨酸時(shí)，·編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B0197335)可以同時(shí)超量表達(dá)，或·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns等，細(xì)菌學(xué)雜志1746076-6086(1992))可以同時(shí)超量表達(dá)，或·編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因(Eikmanns等，細(xì)菌學(xué)雜志1746076-6086(1992))可以同時(shí)超量表達(dá)，或·編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns等，細(xì)菌學(xué)雜志1746076-6086(1992))可以同時(shí)超量表達(dá)，或·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns等，細(xì)菌學(xué)雜志1746076-6086(1992))可以同時(shí)超量表達(dá)，或·編碼賴氨酸輸出的lysE基因(DE-A-19548222)可以同時(shí)超量表達(dá)。
除了超量表達(dá)eno基因之外，消除非所需的副反應(yīng)對氨基酸特別是L-賴氨酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，倫敦，英國，1982)。
為生產(chǎn)氨基酸，特別是L-賴氨酸，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)培養(yǎng)或用分批方法(分批培養(yǎng))，或補(bǔ)料分批(補(bǔ)料法)或重復(fù)補(bǔ)料分批方法(重復(fù)補(bǔ)料法)分批培養(yǎng)。已知的培養(yǎng)法由Chmiel(Bioprozesstechnik 1．Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(Bioreaktorenund periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick／Wiesbaden，1994))所著教材中提供。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合特定菌株的需求，關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于，美國細(xì)菌學(xué)會(huì)的“細(xì)菌學(xué)通用方法手冊”(華盛頓D．C．，USA，1981)?？墒褂玫奶荚窗ㄌ羌疤妓衔?，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸，這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用?？墒褂玫牡窗ê袡C(jī)化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或無機(jī)化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用?？墒褂玫牧自窗姿?，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，也可使用促進(jìn)生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中。上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間以適當(dāng)方式加入培養(yǎng)物中。
可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH值，抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃～40℃，持續(xù)培養(yǎng)直至賴氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小時(shí)范圍達(dá)到。
L-賴氨酸的分析可通過陰離子交換層析，隨后經(jīng)茚三酮衍生化作用進(jìn)行，如Speckman等(分析化學(xué)，30，(1958)，1190)所述。
本發(fā)明方法用于發(fā)酵制備氨基酸，尤其是L-賴氨酸。
本發(fā)明借助于以下提供的實(shí)施例得以更詳述闡述。
實(shí)施例1制備谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因組粘?；蛭膸烊鏣auch等(1995，質(zhì)粒33168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。購自Stratagene公司(La Jolla，USA，產(chǎn)品描述SuperCosl粘粒載體試劑盒，編碼251301)的粘粒載體SuperCosl(Wahl等(1987)美國科學(xué)院院報(bào)842160-2164)的DNA用限制性內(nèi)切酶XbaI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述XbaI，編碼27-0948-02)酶切并類似地用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，編碼27-0868-04)酶切。以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC13032 DNA片段混合并用T4 DNA連接酶(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，編碼27-0870-04)處理。連接混合物然后用GigapackⅡXL包裝提取物(Stratagene，La Jolla，USA，產(chǎn)品描述GigapackⅡXL包裝提取物，編碼200217)包裝進(jìn)噬菌體中。為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，將細(xì)胞懸浮于10mM MgSO4并與噬菌體懸液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港)所述進(jìn)行粘粒文庫的感染和滴定，細(xì)胞在含100微克／毫升氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學(xué)，1190)上鋪板。在37℃保溫過夜后，選擇重組克隆。
實(shí)施例2 eno基因的分離和測序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號27106，Qiagen，Hilden，德國)根據(jù)廠商指導(dǎo)分離各個(gè)菌落的粘粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。凝膠電泳分離后，用QiaExⅡ凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號20021，Qiagen，Hilden，德國)分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產(chǎn)品描述Zero背景克隆試劑盒，產(chǎn)品號K2500-01)的測序載體pZero-1的DNA用限制性內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，產(chǎn)品號27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港)所述進(jìn)行粘粒片段在測序載體pZero-1中的連接，其中DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國)保溫過夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信，123343-7)進(jìn)大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美國科學(xué)院院報(bào)874645-4649)并在含有50微克／毫升zeocin的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學(xué)，1190)上鋪板。重組克隆的質(zhì)粒制備用Biorobot 9600(產(chǎn)品號900200，Qiagen，Hilden，德國)進(jìn)行。測序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美國科學(xué)院院報(bào)745463-5467)的雙脫氧鏈終止法進(jìn)行。使用得自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(產(chǎn)品號403044，Weiterstadt，德國)的“RR羅丹明終止循環(huán)測序試劑盒”。用購自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國)的“ABI Prism 377”測序儀在“RotiphoresisNF 丙烯酰胺／雙丙烯酰胺”凝膠(291)(產(chǎn)品號A124．1，Roth，Karlsruhe，德國)中進(jìn)行凝膠電泳分離和序列分析。
得到的原始序列數(shù)據(jù)然后用Staden軟件包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個(gè)序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP軟件(Staden，1986，核酸研究，14217-231)進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助編碼區(qū)分析。進(jìn)一步的分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)對“國家生物技術(shù)信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。對該核苷酸序列的分析顯示一1275堿基對的開放讀框，其被稱為eno基因。eno基因編碼425個(gè)氨基酸的多肽。
序列表<110>，德古薩-于爾斯股份公司<120> 編碼eno基因的新核苷酸序列<130> 990152 BT<140><141><160> 2<170> Patent In Ver．2．1<210> 1<211> 1578<212> DNA<213> 谷氨酸棒桿菌<220><221> CDS<222> (151)．．(1425)<400> 1ggctggggat atgggtagtt ttcgccacta atttcaactg attgcctcat cgaaacaaga 60ttcgtgcaac aattgggtgt agacgtgatt gaagacattt gatcacgtga ataattctag 120ttagctccca agttggcata ggaggccaca gtg gct gaa atc atg cac gta ttc 174Val Ala Glu Ile Met His Val Phe1 5gct cgc gaa att ctc gac tcc cgc ggt aac cca acc gtc gag gca gag 222Ala Arg Glu Ile Leu Asp Ser Arg Gly Asn Pro Thr Val Glu Ala Glu10 15 20gtt ttc ctg gat gac ggt tcc cac ggt gtc gca ggt gtt cca tcc ggc 270Val Phe Leu Asp Asp Gly Ser His Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Gly25 30 35 40gca tcc acc ggc gtc cac gag gct cat gag ctg cgt gac ggt ggc gat 318Ala Ser Thr Gly Val His Glu Ala His Glu Leu Arg Asp Gly Gly Asp45 50 555 cgc tac ctg ggc aag ggc gtt ttg aag gca gtt gaa aac gtc aac gaa 366Arg Tyr Leu Gly Lys Gly Val Leu Lys Ala Val Glu Asn Val Asn Glu60 65 70gaa atc ggc gac gag ctc gct ggc cta gag gct gac gat cag cgc ctc 414Glu Ile Gly Asp Glu Leu Ala Gly Leu Glu Ala Asp Asp Gln Arg Leu75 80 85atc gac gaa gca atg atc aag ctt gat ggc acc gcc aac aag tcc cgc 462Ile Asp Glu Ala Met Ile Lys Leu Asp Gly Thr Ala Asn Lys Ser Arg90 95 100ctg ggt gca aac gca atc ctt ggt gtt tcc atg gct gtt gca aag gct510Leu Gly Ala Asn Ala Ile Leu Gly Val Ser Met Ala Val Ala Lys Ala105 110 115 120gct gct gat tcc gca ggc ctc cca ctg ttc cgc tac atc ggt gga cca558Ala Ala Asp Ser Ala Gly Leu Pro Leu Phe Arg Tyr Ile Gly Gly Pro125 130 135aac gca cac gtt ctt cca gtt cca atg atg aac atc atc aac ggt ggc606Asn Ala His Val Leu Pro Val Pro Met Met Asn Ile Ile Asn Gly Gly140 145 150gct cac gct gac tcc ggt gtt gac gtt cag gaa ttc atg atc gct cca654Ala His Ala Asp Ser Gly Val Asp Val Gln Glu Phe Met Ile Ala Pro155 160 165atc ggt gca gag acc ttc tct gag gct ctc cgc aac ggc gcg gag gtc702Ile Gly Ala Glu Thr Phe Ser Glu Ala Leu Arg Asn Gly Ala Glu Val170 175 180tac cac gca ctg aag tcc gtc atc aag gaa aag ggc ctg tcc acc gga750Tyr His Ala Leu Lys Ser Val Ile Lys Glu Lys Gly Leu Ser Thr Gly185 190 195 200ctt ggc gat gag ggc ggc ttc gct cct tcc gtc ggc tcc acc cgt gag798Leu Gly Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Ser Val Gly Ser Thr Arg Glu205 210 215gct ctt gac ctt atc gtt gag gca atc gag aag gct ggc ttc acc cca846Ala Leu Asp Leu Ile Val Glu Ala Ile Glu Lys Ala Gly Phe Thr Pro220 225 230ggc aag gac atc gct ctt gct ctg gac gtt gct tcc tct gag ttc ttc894Gly Lys Asp Ile Ala Leu Ala Leu Asp Val Ala Ser Ser Glu Phe Phe235 240 245aag gac ggc acc tac cac ttc gaa ggt ggc cag cac tcc gca gct gag942Lys Asp Gly Thr Tyr His Phe Glu Gly Gly Gln His Ser Ala Ala Glu250 255 260atg gca aac gtt tac gct gag ctc gtt gac gcg tac cca atc gtc tcc990Met Ala Asn Val Tyr Ala Glu Leu Val Asp Ala Tyr Pro Ile Val Ser265 270 275 280atc gag gac cca ctg cag gaa gat gac tgg gag ggt tac acc aac ctc1038Ile Glu Asp Pro Leu Gln Glu Asp Asp Trp Glu Gly Tyr Thr Asn Leu285 290 295acc gca acc atc ggc gac aag gtt cag atc gtt ggc gac gac ttc ttc1086Thr Ala Thr Ile Gly Asp Lys Val Gln Ile Val Gly Asp Asp Phe Phe300 305 310gtc acc aac cct gag cgc ctg aag gag ggc atc gct aag aag gct gcc1134Val Thr Asn Pro Glu Arg Leu Lys Glu Gly Ile Ala Lys Lys Ala Ala315 320 325aac tcc atc ctg gtt aag gtg aac cag atc ggt acc ctc acc gag acc 1182Asn Ser Ile Leu Val Lys Val Asn Gln Ile Gly Thr Leu Thr Glu Thr330 335 340ttc gac gct gtc gac atg gct cac cgc gca ggc tac acc tcc atg atg 1230Phe Asp Ala Val Asp Met Ala His Arg Ala Gly Tyr Thr Ser Met Met345 350 355 360tcc cac cgt tcc ggt gag acc gag gac acc acc att gct gac ctc gca 1278Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Thr Ile Ala Asp Leu Ala365 370 375gtt gca ctc aac tgt ggc cag atc aag act ggt gct cca gca cgt tcc 1326Val Ala Leu Asn Cys Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Ala Arg Ser380 385 390gac cgt gtc gca aag tac aac cag ctt ctc cgc atc gag cag ctg ctt 1374Asp Arg Val Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile Glu Gln Leu Leu395 400 405ggc gac gcc ggc gtc tac gca ggt cgc agc gca ttc cca cgc ttt cag 1422Gly Asp Ala Gly Val Tyr Ala GIy Arg Ser Ala Phe Pro Arg Phe Gln410 415 420ggc taaataaaag cgcttttcga cgcccggtaa cctcaaggtt gccgggcgtc1475Gly425gttgccttac tactgttact ggtgtgacta tgatcgagga ttatggcaaa gcagaagaaa 1535actcataaag gccttgttcc tgtctcaagc agggaacgtg ctt 1578<210> 2<211> 425<212> PRT<213> 谷氨酸棒桿菌<400> 2Val Ala Glu Ile Met His Val Phe Ala Arg Glu Ile Leu Asp Ser Arg1 5 10 15Gly Asn Pro Thr Val Glu Ala Glu Val Phe Leu Asp Asp Gly Ser His20 25 30Gly Val Ala Gly Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Val His Glu Ala35 40 45His Glu Leu Arg Asp Gly Gly Asp Arg Tyr Leu Gly Lys Gly Val Leu50 55 60Lys Ala Val Glu Asn Val Asn Glu Glu Ile Gly Asp Glu Leu Ala Gly65 70 75 80Leu Glu Ala Asp Asp Gln Arg Leu Ile Asp Glu Ala Met Ile Lys Leu85 90 95Asp Gly Thr Ala Asn Lys Ser Arg Leu Gly Ala Asn Ala Ile Leu Gly100 105 110Val Ser Met Ala Val Ala Lys Ala Ala Ala Asp Ser Ala Gly Leu Pro115 120 125Leu Phe Arg Tyr Ile Gly Gly Pro Asn Ala His Val Leu Pro Val Pro130 135 140Met Met Asn Ile Ile Asn Gly Gly Ala His Ala Asp Ser Gly Val Asp145 150 155 160Val Gln Glu Phe Met Ile Ala Pro Ile Gly Ala Glu Thr Phe Ser Glu165 170 175Ala Leu Arg Asn Gly Ala Glu Val Tyr His Ala Leu Lys Ser Val Ile180 185 190Lys Glu Lys Gly Leu Ser Thr Gly Leu Gly Asp Glu Gly Gly Phe Ala195 200 205Pro Ser Val Gly Ser Thr Arg Glu Ala Leu Asp Leu Ile Val Glu Ala210 215 220Ile Glu Lys Ala Gly Phe Thr Pro Gly Lys Asp Ile Ala Leu Ala Leu225 230 235 240Asp Val Ala Ser Ser Glu Phe Phe Lys Asp Gly Thr Tyr His Phe Glu245 250 255Gly Gly Gln His Ser Ala Ala Glu Met Ala Asn Val Tyr Ala Glu Leu260 265 270Val Asp Ala Tyr Pro Ile Val Ser Ile Glu Asp Pro Leu Gln Glu Asp275 280 285Asp Trp Glu Gly Tyr Thr Asn Leu Thr Ala Thr Ile Gly Asp Lys Val290 295 300Gln Ile Val Gly Asp Asp Phe Phe Val Thr Asn Pro Glu Arg Leu Lys305 310 315 320Glu Gly Ile Ala Lys Lys Ala Ala Asn Ser Ile Leu Val Lys Val Asn325 330 335Gln Ile Gly Thr Leu Thr Glu Thr Phe Asp Ala Val Asp Met Ala His340 345 350Arg Ala Gly Tyr Thr Ser Met Met Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu355 360 365Asp Thr Thr Ile Ala Asp Leu Ala Val Ala Leu Asn Cys Gly Gln Ile370 375 380Lys Thr Gly Ala Pro Ala Arg Ser Asp Arg Val Ala Lys Tyr Asn Gln385 390 395 400Leu Leu Arg Ile Glu Gln Leu Leu Gly Asp Ala Gly Val Tyr Ala Gly405 410 415Arg Ser Ala Phe Pro Arg Phe Gln Gly420 42權(quán)利要求
1.來自棒狀細(xì)菌的分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼包括與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及d)包括a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是能在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的優(yōu)選地為重組的DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求2的多核苷酸，包括如SEQ ID NO1所示的核酸序列。
5.權(quán)利要求2的能復(fù)制的DNA，包括(ⅰ)如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于的序列(ⅰ)的至少一個(gè)序列，或(ⅲ)與互補(bǔ)于序列(ⅰ)或(ⅱ)的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中義突變。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸序列，其編碼含包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
7.發(fā)酵制備L-氨基酸尤其是L-賴氨酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟(a)發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀細(xì)菌，該細(xì)菌中至少eno基因或編碼該基因的核苷酸序列是擴(kuò)增的，尤其是超量表達(dá)的，(b)富集培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中的L-氨基酸，及(c)分離L-氨基酸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所用細(xì)菌中所需的L-氨基酸生物合成途徑的其它基因被額外擴(kuò)增。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所用細(xì)菌中，降低L-賴氨酸生成的代謝途徑至少被部分消除。
10.權(quán)利要求7的方法，其中使用經(jīng)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，且此質(zhì)粒載體攜帶編碼eno基因的核苷酸序列。
11.權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的方法，其中使用產(chǎn)生L-賴氨酸的棒狀細(xì)菌。
12.權(quán)利要求8的方法，其中編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因同時(shí)超量表達(dá)。
13.權(quán)利要求8的方法，其中賦予S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸抗性的DNA片段同時(shí)擴(kuò)增。
14.權(quán)利要求8的方法，其中編碼甘油醛-3-磷酸的gap基因同時(shí)超量表達(dá)。
15.權(quán)利要求8的方法，其中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因同時(shí)超量表達(dá)。
16.權(quán)利要求8的方法，其中編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因同時(shí)超量表達(dá)。
17.權(quán)利要求8的方法，其中編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因同時(shí)超量表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的多核苷酸,其包括選自如下一組的多核苷酸序列:a)與編碼包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)編碼含括與SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸,以及d)包括a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。本發(fā)明還涉及用eno基因的擴(kuò)增而發(fā)酵制備L－氨基酸的方法。
文檔編號C12R1/15GK1290750SQ0012957
公開日2001年4月11日 申請日期2000年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月5日
發(fā)明者貝蒂娜·默克爾, 瓦爾特·普費(fèi)弗勒, 托馬斯·赫爾曼, 阿爾弗雷德·普爾勒, 約恩·卡利諾夫斯基, 布里吉特·巴特 申請人:德古薩－于爾斯股份公司