專利名稱：一種體外免疫人b淋巴細(xì)胞生產(chǎn)人單克隆抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生產(chǎn)人單克隆抗體的生物技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明提供了用加載抗原的人樹突狀細(xì)胞免疫人外周血單核細(xì)胞，然后用EB病毒轉(zhuǎn)化其中的產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞進(jìn)而生產(chǎn)單克隆抗體的方法，本方法既適用于在實驗室水平制備人單克隆抗體，也適用于人單克隆抗體的工業(yè)化生產(chǎn)。
單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)是由克隆的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的只識別某一特定抗原決定簇的高度均質(zhì)和高度專一性的純化抗體。Milstein和Kohler在1975年報道了生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)，并因此在1984年獲得諾貝爾獎。生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)的要點是用特異性抗原免疫小鼠；把小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞；分離單克隆的產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞；將雜交瘤細(xì)胞接種小鼠腹腔或體外培養(yǎng)生產(chǎn)單克隆抗體。用這種技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體是小鼠單克隆抗體，也稱鼠源化單克隆抗體。此類單克隆抗體已被廣泛應(yīng)用于實驗室研究、臨床疾病診斷和生物分子提純等方面，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
雖然，用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的鼠源化單克隆抗體具有多方面的應(yīng)用，但它在治療人類疾病的應(yīng)用上卻受到很大限制。這是因為，鼠源性單克隆抗體對于人體來說是異種蛋白，在應(yīng)用后會刺激人體產(chǎn)生針對鼠源性單克隆抗體的抗體。這種人抗鼠抗體一方面會加速鼠源性單克隆抗體的清除使之失效，另一方面又會因反復(fù)應(yīng)用可在人體引起超敏反應(yīng)性疾病。因此，尋找人源化單克隆抗體的生產(chǎn)方法對于生產(chǎn)在人類疾病治療中有應(yīng)用價值的人源化單克隆抗體具有重要意義。
目前，主要有兩類生產(chǎn)人源化單克隆抗體的技術(shù)一類以雜交瘤技術(shù)為基礎(chǔ)，另一類以EB病毒轉(zhuǎn)化人B淋巴細(xì)胞為基礎(chǔ)。第一類技術(shù)有兩種，一是采用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人的單克隆抗體。其具體做法是，用特異性抗原免疫小鼠；取小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞；從雜交瘤細(xì)胞分離得到編碼特異性鼠源抗體的cDNA；采用DNA重組技術(shù)，用編碼人抗體恒定區(qū)的cDNA片段置換鼠源抗體的cDNA片段，獲得鼠源抗體可變區(qū)的cDNA和人源抗體恒定區(qū)的cDNA相融合的cDNA；在大腸桿菌、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)人源化單克隆抗體。二是采用人免疫球蛋白基因小鼠產(chǎn)生人單克隆抗體。其具體做法是，采用基因敲除(knock out)和基因敲進(jìn)(knock in)技術(shù)生產(chǎn)含有人免疫球蛋白基因的小鼠，此小鼠的免疫球蛋白基因位點為人免疫球蛋白基因位點。用特異性抗原免疫此含有人免疫球蛋白基因的小鼠，將此小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合得到產(chǎn)生特異性人源化單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。培養(yǎng)此雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)人源化單克隆抗體。
1987年，Goossens等報道，將反復(fù)接觸同種異體紅細(xì)胞抗原的人外周血淋巴細(xì)胞用EB病毒轉(zhuǎn)化，可獲得多個產(chǎn)生人單克隆抗體的永生化B細(xì)胞克隆。這些克隆的B淋巴細(xì)胞分別產(chǎn)生Ph(D)、Ph(G)、Ph(C)、Ph(E)、Kell、A和Al血型抗原的人單克隆抗體，其濃度平均可達(dá)4-50微克/毫升。這些B淋巴細(xì)胞克隆細(xì)胞在四年內(nèi)可在體外培養(yǎng)條件下穩(wěn)定地產(chǎn)生單克隆抗體(Goossens D等，J. Immunol Methods，1987 Aug 3；101(2)193-200)。1993年，Delneste等從全身性血管炎患者體內(nèi)分離B淋巴細(xì)胞，用EB病毒將其轉(zhuǎn)化；用人內(nèi)皮細(xì)胞系細(xì)胞黏附篩選產(chǎn)生人內(nèi)皮細(xì)胞特異性單克隆抗體的轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆，得到產(chǎn)生人內(nèi)皮細(xì)胞表面分子特異性的人單克隆抗體的兩個B細(xì)胞克隆(Delneste Y等，Cell Immunol.，1993 Aug，150(1)15-26)。1994年，Buchacher等用EB病毒轉(zhuǎn)化HIV-1陽性志愿者的外周血淋巴細(xì)胞，分別得到產(chǎn)生HIV-1包膜蛋白和核心蛋白特異性單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞株，這些細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體具有診斷、研究和治療HIV-1的價值(Buchacher A等，AIDS Res.Hum Retroviruses，1994 Apr.，10(4)259-69)。
盡管采用以EB病毒轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞技術(shù)可生產(chǎn)多種人源化單克隆抗體，但該技術(shù)存在一個最大的也是顯而易見的局限性，即不能根據(jù)具體需要，用特定抗原免疫人，然后分離接受免疫者的淋巴細(xì)胞并將其用EB病毒轉(zhuǎn)化。本發(fā)明提供的技術(shù)突破了上述以EB病毒轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞技術(shù)的局限性。
本發(fā)明的目的是提供一種方法，該方法包括用加載抗原的人樹突狀細(xì)胞免疫人外周血單核細(xì)胞，然后用EB病毒轉(zhuǎn)化其中的產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞，從而生產(chǎn)針對上述抗原的單克隆抗體。采用本發(fā)明的技術(shù)可使免疫在體外培養(yǎng)條件下完成，避免了B淋巴細(xì)胞的體內(nèi)免疫，從而使通過EB病毒轉(zhuǎn)化方法制備各種抗原的人源化單克隆抗體成為可能。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下1、分離培養(yǎng)人的樹突狀細(xì)胞1)取人外周血；2)用等體積RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋人外周血；3)加稀釋的人外周血于淋巴細(xì)胞分離液上，室溫離心，吸取單核細(xì)胞層的細(xì)胞。收集自體血漿備用；4)以等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基離心洗滌細(xì)胞；5)將分離的外周血單核細(xì)胞接種于培養(yǎng)板上，37℃，CO2孵箱培養(yǎng)，棄培養(yǎng)上清；6)加入含自體血漿和慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃，CO2孵箱培養(yǎng)；加入粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素4(IL-4)，繼續(xù)在37℃，CO2孵箱中培養(yǎng)；通過上述步驟可分離得到樹突狀細(xì)胞。
7)鑒定樹突狀細(xì)胞。
2、用特異性抗原加載樹突狀細(xì)胞1)在上述培養(yǎng)條件下，加特異性抗原刺激分離得到的樹突狀細(xì)胞；2)繼續(xù)培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞。
3、分離人外周血單核細(xì)胞1)取人外周血；
2)用等體積RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋人外周血；3)加稀釋的人外周血于淋巴細(xì)胞分離液上，室溫離心，吸取單核細(xì)胞層的細(xì)胞；4)以等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基離心洗滌細(xì)胞。
4、免疫人B淋巴細(xì)胞將分離的外周血單核細(xì)胞和加載抗原的成熟樹突狀細(xì)胞接種于含RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，37℃，CO2孵箱培養(yǎng)。
5、用EB病毒轉(zhuǎn)化免疫的人B淋巴細(xì)胞；1)在上述接受免疫的人B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中滴加EB病毒上清，加環(huán)孢霉素，擴(kuò)增EB病毒，液氮保存；2)37℃，CO2孵箱培養(yǎng)上述滴加EB病毒上清的接受免疫的人B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液，移去培養(yǎng)液，補(bǔ)充含胎牛血清和慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；3)在倒置顯微鏡下觀察，將表現(xiàn)生長的細(xì)胞移入含10％胎牛血清RPMI-1640的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4)觀察細(xì)胞，可見其成簇或以單細(xì)胞懸液的形式生長，根據(jù)具體生長情況傳代。
6、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)1)在含胎牛血清和慶大霉素/毫升的RPMI-1640培養(yǎng)基中系列稀釋轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞，接種培養(yǎng)板，37℃，CO2孵箱培養(yǎng)。從第二天開始每天觀察細(xì)胞，并對只有一個細(xì)胞克隆生長的孔做標(biāo)記；2)取含單克隆細(xì)胞轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞的孔的培養(yǎng)上清，用ELISA方法檢測其中存在的抗體。
7、采用ELISA方法篩選產(chǎn)生特異性單克隆抗體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆1)將可溶性抗原溶于包被液，加到培養(yǎng)板中，室溫過夜，4℃放置；2)吸棄包被液，用PBS/Tween洗滌；每孔加封閉液，室溫放置；3)吸棄封閉液，用PBS/Tween洗滌；4)每孔加待檢上清(取自含單克隆細(xì)胞的培養(yǎng)孔)，設(shè)兩個復(fù)孔，室溫放置；5)用PBS/Tween洗滌；6)加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人抗體，室溫孵育；7)用PBS/Tween洗滌，再用雙蒸水洗滌；8)加鄰-苯二胺(OPD)磷酸鹽/檸檬酸鹽底物顯色液(pH 5.0)，室溫靜置，待明顯的顏色出現(xiàn)。加NaOH終止反應(yīng)；9)采用酶標(biāo)儀測定OD值。
8、擴(kuò)增、保存產(chǎn)生單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞1)在含胎牛血清和慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，CO2孵箱擴(kuò)增培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)生單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞；2)在液氮中保存產(chǎn)生單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞。
9、培養(yǎng)生產(chǎn)人單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞在含胎牛血清和慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，CO2孵箱擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清。
10、分離純化單克隆抗體培養(yǎng)上清中含有大量特異地針對上述抗原的人單克隆抗體，采用常規(guī)的生物化學(xué)技術(shù)分離純化得到相應(yīng)的人單克隆抗體。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明解決了不能通過使用抗原免疫人體而制備人單克隆抗體的難題，提供了可生產(chǎn)針對各種抗原的人源化單克隆抗體的方法。例如，利用本發(fā)明提供的方法可生產(chǎn)多種可用于治療多種嚴(yán)重疾病如自身免疫性疾病和惡性腫瘤等的人源化單克隆抗體，從而為這些疾病的治療奠定基礎(chǔ)。此外，利用本發(fā)明提供的方法還可制備可用于人體細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)定位的人源化單克隆抗體標(biāo)記的放射性示蹤物，從而為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究和臨床診斷與治療所應(yīng)用。
下面敘述
具體實施例方式一、抗人腫瘤壞死因子(TNF)的人源化單克隆抗體的生產(chǎn)。
生產(chǎn)方法如下1、分離培養(yǎng)人的樹突狀細(xì)胞1)用注射器抽取10毫升人外周血；2)用等體積RPMI-1640培養(yǎng)基(Biowhittaker，Walkersville，Maryland，USA)(含肝素10IU/毫升，不含胎牛血清)稀釋抽取的人外周血；3)稀釋的人外周血于Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液上，二者的體積比是2∶1。室溫離心，1000g，15分鐘。吸取單核細(xì)胞層的細(xì)胞，收集自體血漿備用；4)以等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基(含5％的胎牛血清)離心洗滌細(xì)胞(200g，15分鐘)兩次；5)將分離的外周血單個核細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板(Falcon，Lincoln Park，NJ，USA)，每孔含8×106個細(xì)胞，3毫升含1％自體血漿，20微克慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。37□C，CO2孵箱培養(yǎng)2小時。吸棄培養(yǎng)上清；6)加入3毫升含1％自體血漿，20微克慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。37□C，CO2孵箱培養(yǎng)2小時。加入100IU/毫升粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和800U/毫升白細(xì)胞介素4(IL-4)，繼續(xù)在37℃，CO2孵箱中培養(yǎng)6天；用上述方法可分離到1.5-4×105個樹突狀細(xì)胞。
7)鑒定樹突狀細(xì)胞細(xì)胞，其表型為CD83+，p55/fascin+，CD115/MCSF-R-，CD86+。
2、用腫瘤壞死因子加載樹突狀細(xì)胞1)在上述培養(yǎng)條件下，加經(jīng)突變的腫瘤壞死因子(0.1毫克)刺激分離的樹突狀細(xì)胞(1.5-4×105)；2)繼續(xù)培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞48小時。
3、分離人外周血單個核細(xì)胞1)用注射器抽取10毫升人外周血；2)用等體積RPMI-1640培養(yǎng)基(含肝素10IU/毫升，不含胎牛血清)稀釋抽取的人外周血；3)加稀釋的人外周血于Fidcoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液上，二者的體積比是2∶1。室溫離心，1000g，15分鐘。吸取單核細(xì)胞層的細(xì)胞；4)以等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基(含5％的胎牛血清)離心洗滌細(xì)胞(200g，15分鐘)兩次。
4、免疫人B淋巴細(xì)胞將分離的外周血單個核細(xì)胞(7.5×106)和加載突變的腫瘤壞死因子的成熟樹突狀細(xì)胞(1×105)接種于6孔培養(yǎng)板(Falcon，Lincoln Park，NJ，USA)，于3毫升含10％胎牛血清，20微克慶大霉素/毫升的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，CO2孵箱培養(yǎng)2天。
5、用EB病毒轉(zhuǎn)化免疫的人B淋巴細(xì)胞1)滴加0.5毫升EB病毒上清，加5微升環(huán)孢霉素使其終濃度為0.2微克/毫升。采用B95-8 marmoset細(xì)胞擴(kuò)增EB病毒，液氮保存(Hudson L，PracticalImmunology，Blackwell Scientific Publications，1989，Third Edition，第460-461頁)；2)37℃，CO2孵箱培養(yǎng)7天，移除1毫升舊培養(yǎng)液，補(bǔ)充10毫升含10％胎牛血清，20微克/毫升慶大霉素/毫升的RPMI-1640(Biowhittaker，Walkersville，Maryland，USA)培養(yǎng)基，37□C，CO2孵箱培養(yǎng)3-4周；2)在倒置顯微鏡下觀察，將表現(xiàn)生長的細(xì)胞移入含10毫升RPMI-1640培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)的25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)于37□C，CO2孵箱培養(yǎng)；3)觀察細(xì)胞可見其成簇或以單細(xì)胞懸液的形式生長，1周后或根據(jù)具體情況進(jìn)行傳代。
6、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)1)采用在含15％胎牛血清、20微克慶大霉素/毫升的RPMI-1640(Biowhittaker，Walkersville，Maryland，USA)培養(yǎng)基中系列稀釋的轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，調(diào)其濃度為8-10個細(xì)胞/毫升。取100微升接種96孔培養(yǎng)板。37℃，CO2孵箱培養(yǎng)7-10天。從第二天開始每天觀察細(xì)胞，并對只有一個細(xì)胞克隆生長的孔做標(biāo)記；2)取含單克隆細(xì)胞轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞的孔的培養(yǎng)上清，用ELISA方法檢測其中存在的抗體。
7、采用ELISA方法篩選產(chǎn)生特異性單克隆抗體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆1)、將人腫瘤壞死因子(1-6微克/毫升)溶于Bicarbonate包被液(1.59克Na2CO3，2.93克NaHCO3，0.2克NaN3，用雙蒸水補(bǔ)齊至1升，pH 9.6)，加100微升于96孔培養(yǎng)板的孔中，室溫(20-25℃)過夜，4℃繼續(xù)放置4-12小時；2)吸棄包被液，用PBS/Tween(含0.05％Tween 20的PBS)洗三次。每孔加100微升PBS/BSA/Tween封閉液(含0.05％Tween 20，1％BSA的PBS)，室溫(20-25℃)放置80分鐘；3)用PBS/Tween(含0.05％Tween 20的PBS)洗滌三次；4)每孔加75微升待檢上清(取自含單克隆細(xì)胞的培養(yǎng)孔)，設(shè)兩個復(fù)孔，室溫(20-25℃)放置2小時；5)吸棄孔中液體，用PBS/Tween(含0.05％Tween 20的PBS)洗三次；
6)加75微升辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人抗體，室溫孵育2小時；7)用PBS/Tween(含0.05％Tween 20的PBS)洗滌三次，雙蒸水洗滌一次；8)加100微升鄰-苯二胺(OPD)(溶于磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液，pH 5.0)底物顯色液，室溫靜置15-60分鐘，待明顯的顏色出現(xiàn)；加40微升3M NaOH終止反應(yīng)；9)采用酶標(biāo)儀在492納米波長測定OD值。
8、擴(kuò)增、保存產(chǎn)生人腫瘤壞死因子特異性單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞1)采用含10％胎牛血清、20微克慶大霉素/毫升的RPMI-1640(Biowhittaker，Walkersville，Maryland，USA)培養(yǎng)基，37□C，CO2孵箱擴(kuò)增培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)生人腫瘤壞死因子特異性單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞；2)在液氮中保存產(chǎn)生人腫瘤壞死因子特異性單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞。
9、培養(yǎng)生產(chǎn)人單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞采用含10％胎牛血清和20微克慶大霉素/毫升的RPMI-1640(Biowhittaker，Walkersville，Maryland，USA)培養(yǎng)基，37℃，CO2孵箱擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)生特異性抗人腫瘤壞死因子的人單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清。
10、分離純化單克隆抗體培養(yǎng)上清中含有大量特異性抗人腫瘤壞死因子的人單克隆抗體，采用常規(guī)的生物化學(xué)技術(shù)分離純化人腫瘤壞死因子的人單克隆抗體。
此種單克隆抗體可表現(xiàn)出很好的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、Crohn′s病(Crohn′s disease)和感染性休克等疾病的效果。文獻(xiàn)中已有關(guān)于抗人腫瘤壞死因子的單克隆抗體的療效的報道(Raza A，Microsc.Res.Tech.，2000 Aug 1，50(3)229-35；Brandt J.等，Arthritis Rheum.，2000 Jun.，43(6)1346-52；Vincent JL.，J.Clin.Pract.2000 Apr.，54(3)190-3；Kavanaugh A等，J. Rheumatol.，2000 Apr；27(4)841-50；Maini RN.和Taylor PC.，Annu.Rev.Med.，2000，51207-29)，但卻沒有解決單克隆抗體的人源化問題。本發(fā)明所提供的方法解決了此問題。二、抗HER2抗原人源化單克隆抗體的生產(chǎn)。
生產(chǎn)方法如下重復(fù)實施例一的步驟1到步驟10，不同的只是在步驟2中用經(jīng)突變的HER2特異性抗原(0.1毫克)刺激分離得到的樹突狀細(xì)胞。最后得到的是特異性抗HER2抗原的人單克隆抗體。
HER2抗原是由HER2原癌基因編碼的185kDa的跨膜受體糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性轉(zhuǎn)化細(xì)胞活性。HER2抗原在10-40％的人乳腺腫瘤細(xì)胞有過度表達(dá)，因此成為乳腺癌免疫治療的靶點。動物實驗表明，采用人源HER2特異性的單克隆抗體制成的免疫毒素對乳腺癌的治療有明顯的治療作用。文獻(xiàn)中已有關(guān)于HER2特異性單克隆抗體對于乳腺癌療效的報道(Rosenblum MG.等，Int.J.Cancer，2000 Oct 15，88(2)267-273；Dillman RO.，Cancer Biother.Radiopharm.，1999 Feb.，14(1)5-10；Dakappagari N.K.等，Cancer Res.，2000 Jul.15，60(14)3782；Klapper L.N.等，Cancer Res.，2000 Jul.1，60(13)3384-8)，但卻沒有解決單克隆抗體的人源化問題。本發(fā)明所提供的方法解決了此問題。
權(quán)利要求
1.一種體外生產(chǎn)人源化單克隆抗體的方法，其特征在于用加載抗原的人樹突狀細(xì)胞免疫人外周血單核細(xì)胞，然后用病毒轉(zhuǎn)化其中的生產(chǎn)特異性抗體的B淋巴細(xì)胞，以生產(chǎn)針對上述抗原的特異性人源化單克隆抗體；進(jìn)一步，其特征在于該方法包括以下步驟1)分離、培養(yǎng)與鑒定人樹突狀細(xì)胞；2)應(yīng)用抗原加載由上述步驟1)得到的人樹突狀細(xì)胞；3)分離人外周血單核細(xì)胞；4)應(yīng)用由上述步驟2)得到的加載抗原的人樹突狀細(xì)胞免疫由上述步驟3)得到的人B淋巴細(xì)胞；5)應(yīng)用病毒轉(zhuǎn)化由上述步驟4)得到的被免疫的人B淋巴細(xì)胞；6)克隆化培養(yǎng)由上述步驟5)得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；7)應(yīng)用ELISA方法篩選由上述步驟6)得到的生產(chǎn)針對上述抗原的特異性單克隆抗體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞克??；8)擴(kuò)增、保存由上述步驟7)得到的生產(chǎn)上述特異性單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞；9)培養(yǎng)由上述步驟8)得到的生產(chǎn)上述特異性人單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞；10)分離純化由上述步驟9)得到的針對上述抗原的特異性人源化單克隆抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說的病毒為EB病毒；
3.權(quán)利要求1的方法，其中所說的抗原包括任何一種可刺激產(chǎn)生單克隆抗體的抗原；
4.權(quán)利要求3的抗原，其中所說的抗原是人腫瘤壞死因子(TNF)；
5.權(quán)利要求3的抗原，其中所說的抗原是HER2抗原；
6.權(quán)利要求1的方法，其中所說的人源化單克隆抗體包括任何一種用權(quán)利要求1提供的方法生產(chǎn)的針對權(quán)利要求3的抗原的人源化單克隆抗體；
7.權(quán)利要求6的人源化單克隆抗體，其中所說的人源化單克隆抗體是抗人腫瘤壞死因子(TNF)的人源化單克隆抗體；
8.權(quán)利要求6的人源化單克隆抗體，其中所說的人源化單克隆抗體是抗HER2抗原的人源化單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用加載抗原的人樹突狀細(xì)胞體外免疫人外周血單核細(xì)胞,然后用EB病毒轉(zhuǎn)化其中的生產(chǎn)特異性抗體的B淋巴細(xì)胞進(jìn)而生產(chǎn)針對上述抗原的人源化單克隆抗體的方法。使用本發(fā)明所提供的方法可獲得生產(chǎn)針對上述抗原的人源化單克隆抗體的人B淋巴細(xì)胞克隆,培養(yǎng)這些人B淋巴細(xì)胞就可生產(chǎn)針對各種抗原的、具有臨床治療和臨床診斷價值的人源化單克隆抗體。本方法既適用于在實驗室水平制備人單克隆抗體,也適用于人單克隆抗體的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P21/08GK1348011SQ00129579
公開日2002年5月8日 申請日期2000年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月8日
發(fā)明者于永利 申請人:于永利