專利名稱：從魚類的精原細胞中提取dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從魚類的精原細胞中大量提取脫氧核糖核酸(DNA)的方法。
脫氧核糖核酸(DNA)作為遺傳信息密碼的生物高分子，廣泛存在于所有生命體中。DNA是由磷酸、4種堿基、脫氧核糖形成的生物高分子，因具有固有的物理化學和生物學特性，廣泛用于生化實驗材料、化妝品、醫(yī)藥、食品添加劑等。
另外，烏賊的精原細胞是加工烏賊過程中大量得到的副產(chǎn)物。烏賊捕獲后，大部分加工成烏賊干或魷魚干等，在此過程中烏賊的內(nèi)臟作為副產(chǎn)物產(chǎn)生。此外，烏賊的魚子和精原細胞作為飯館等的基本菜使用。烏賊的精原細胞中含有豐富的DNA，因此比其他原料更容易得到DNA。DNA以往從鯡魚或大馬哈魚的精原細胞中提取，從明太魚的精原細胞中用陰離子表面活性劑和氯化鈉提取DNA方法記載在韓國專利第35973號中。
以往大量提取DNA的方法可舉出使用苯酚的方法(美國專利第3838148號)、使用陰離子表面活性劑和高濃度氯化鈉的方法(韓國專利第35972號)等。這些方法在提取過程中大量產(chǎn)生公害物質(zhì)，而且這些公害物質(zhì)處理費用高。本發(fā)明為解決這些問題，提供完全不產(chǎn)生公害物質(zhì)，并且其廢液可用作肥料的方法。
因此，本發(fā)明著眼于精原細胞大量含有DNA，發(fā)現(xiàn)用含有高濃度鹽的堿性溶液，可以非常經(jīng)濟地精制DNA，由此完成本發(fā)明。本發(fā)明的目的是代替對人體有害的苯酚、陰離子表面活性劑SDS(十二烷基硫酸鈉)、有害于土壤的氯化鈉等環(huán)境污染物質(zhì)，使用土壤復(fù)活改善劑物質(zhì)，把從魚類精原細胞中提取DNA工藝所產(chǎn)生的副產(chǎn)物全部用作植物營養(yǎng)源，該方法比以往方法簡便且容易提取DNA。
另外，本發(fā)明的其他目的是將所述方法中的副產(chǎn)物作為液體氮肥。
為達到本發(fā)明所述目的，從魚類的精原細胞中提取DNA的方法包括A)破碎、分離魚類的精原細胞，得到乳白色的膠體；B)用含有1M以上的pH值為8～12的一價離子鹽的堿性溶液處理所述膠體；C)向上述混合物中加入乙醇，沉淀DNA。
另外，本發(fā)明的從魚類的加工副產(chǎn)物---精原細胞中提取DNA的方法，由A)將魚類的精原細胞加入到含有1M以上的pH值為8～12的一價離子鹽的堿性溶液中并進行破碎；B)在所述破碎溶液中加入酸酐進行酰化反應(yīng)；C)在?；磻?yīng)的破碎溶液中加入乙醇沉淀DNA的步驟組成的。
本發(fā)明中可使用多種多樣的魚類精原細胞，但最好使用廉價并容易大量購得的烏賊、明太魚的精原細胞。
將魚類的精原細胞與蒸餾水一起在粉碎機中粉碎形成膠狀，再用篩過濾，除去未粉碎的部分后，可加入含有高濃度鹽的堿性溶液。另外，本發(fā)明的方法可在含有高濃度鹽的堿性溶液中破碎魚類的精原細胞，魚類的精原細胞同蒸餾水一同破碎，并且該溶液用高濃度鹽溶液處理后，再用pH值為8～12的堿性溶液處理。
本發(fā)明的方法也可增加?；磻?yīng)步驟，而所述?；磻?yīng)是在堿性溶液處理的破碎溶液中加入酸酐進行的。本發(fā)明的酸酐可使用乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐等。
本發(fā)明的方法中可使用的堿性化合物有硝酸鈉、碳酸鈉、磷酸鈉等。
所述A)步驟后也可增加RNA分解步驟。RNA的分解采用堿處理或RNA酶(RNase)分解。
下面詳細說明本發(fā)明。
如果破碎細胞，核酸結(jié)合蛋白質(zhì)在高濃度鹽中顯示更強的正電性，弱化了與DNA的吸附狀態(tài)，而與DNA分離。魚精蛋白類的核酸蛋白質(zhì)的蓖麻子白朊含量非常高。蓖麻子白朊基由于含有氨基，在高濃度鹽中顯示正電性。核酸結(jié)合蛋白質(zhì)內(nèi)顯示正電性的氨基被堿性溶液脫正電性，而成為反應(yīng)性極大的作用基與酸酐反應(yīng)，因此失去與DNA的離子結(jié)合性親和力(Roger L.Lundbland and Claudia M.Noyes.,Chemical Reagents for Protein Modification,Vol.I CRC Press,Inc.,1984,page 130～131；Riordan,J.F.And Vallee,B.L.,Acetylation,Meth.Enzymol.,11,page 565～570,1967)。另外，堿性溶液可以水解RNA。因此，不另外使用RNase也能分解RNA得到核酸。
所述脫正電性的氨基與酸酐反應(yīng)，蛋白質(zhì)的氨基和RNA的氨基被?；?，失去正電性，因此，即使堿性鹽的濃度低，核酸結(jié)合蛋白質(zhì)也不可能再次與DNA連接。然后，加入乙醇，DNA以纖維狀態(tài)從溶液中分離，將其收集并用乙醇洗滌、干燥，得到白色DNA纖維。
為將得到的副產(chǎn)物作為肥料使用，加入與所用堿同當量的硝酸或磷酸，將pH調(diào)整到中性后，進行單純蒸餾。此時回收的乙醇可再用于該工藝。蒸餾后殘留的副產(chǎn)物含有90％以上的硝酸鹽和各種有機物、磷酸鹽等，因此可直接作為肥料使用。硝酸鈉的氮含量為16％，可作為使土質(zhì)變成弱堿性的土壤復(fù)活劑。因此，本發(fā)明完全不產(chǎn)生引起環(huán)境問題的污染物，能經(jīng)濟地提取DNA，并且殘留的副產(chǎn)物可作為液體氮肥使用，非常經(jīng)濟。
本發(fā)明中精制DNA，如


圖1至圖4所示，有效地分離DNA，并用核糖核酸水解酶(RNAse A)和核酸水解酶(DNAseⅠ)分別處理后，用瓊脂電泳凝膠確認結(jié)果，可確認是由純DNA構(gòu)成。
下面舉實施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實施例的限定。實施例1在含有4M NaNO3、0.1M Na2CO3、20mM EDTA的溶液(溶液1，pH值約11)300ml和含有4M NaNO3、0.1M NaHCO3、20mM EDTA的溶液(溶液2，pH值約8.3)300ml中分別加入25g烏賊的精原細胞，用家庭用攪拌器粉碎5分鐘，在冷藏室內(nèi)粉碎1小時并過濾。在過濾液中加入2ml的乙酸酐，4℃?；磻?yīng)1小時。為選擇性地除去蛋白質(zhì)，在用乙酸酐處理的前或后，加入硫酸銨使其最終濃度為50％，進行沉淀反應(yīng)。然后，添加乙醇至其最終濃度為20～80％，在4℃下攪拌混合30分鐘，離心分離，回收DNA沉淀物。該物質(zhì)再次用70％乙醇5ml洗滌兩次后，真空下蒸出乙醇，得到DNA。所述回收的DNA溶解在TE(Tris-EDTA)緩沖液中，進行1.8％瓊脂糖膠電泳，將TE溶液中DNA樣品0.1ml加入到1.9ml的蒸餾水中，測定吸光度。其結(jié)果如
圖1和表1所示。
圖1中泳道1是使用溶液1得到的精原細胞提取物立即進行電泳的結(jié)果；泳道2同泳道1但使用溶液2的結(jié)果；泳道3是使用溶液1得到的精原細胞提取物以乙酸酐處理后，立即進行電泳的結(jié)果；泳道4同泳道3但使用溶液2的結(jié)果；泳道5是使用溶液1得到的精原細胞提取物以硫酸銨處理，沉淀蛋白質(zhì)，殘留的上清液用乙醇沉淀的結(jié)果；泳道6同泳道5使用溶液2的結(jié)果；泳道7是使用溶液1得到的精原細胞提取物用乙酸酐處理后，以硫酸銨沉淀，殘留的上清液用乙醇沉淀的結(jié)果；泳道8同泳道7，但代替溶液1使用溶液2的結(jié)果；泳道9是使用溶液1得到的精原細胞提取物以乙酸酐處理后，用20％乙醇沉淀的結(jié)果；泳道10同泳道9但用40％乙醇沉淀的結(jié)果；泳道11同泳道9但用60％乙醇沉淀的結(jié)果；泳道12及15同泳道9但用80％乙醇沉淀的結(jié)果；泳道13是使用溶液1得到的精原細胞提取物不做乙酸酐處理，用乙醇沉淀的結(jié)果；泳道14同泳道13但使用溶液2的結(jié)果；泳道16同泳道15但使用溶液2的結(jié)果。
表1測定實施例1中分離的DNA的吸光度
如
圖1所示，與未進行乙酸酐處理相比較，經(jīng)乙酸酐處理的DNA分離更好；與用弱堿性(pH值8.3)溶液2處理相比，用高堿性溶液(pH值11)處理的實驗結(jié)果，DNA的提取效率高。為沉淀蛋白質(zhì)使用硫酸銨時，與未使用硫酸銨比較沒有太大差異。觀察表1的吸光度，發(fā)現(xiàn)與使用弱堿性pH值8.3溶液相比，高堿性pH值11的溶液1可得到高純度DNA。實施例2在含有4MNaNO3、0.1MNa2CO3的溶液(溶液1、pH值約11)500ml和4M NaNO3、0.1M NaHCO3的溶液(溶液2、pH值約8.3)500ml中分別加入51g烏賊的精原細胞，用家庭用攪拌器粉碎5分鐘，在冷藏室內(nèi)用超聲波粉碎器粉碎1小時并過濾。在過濾液中加入2ml的乙酸酐，4℃酰化反應(yīng)1小時后，再加入2ml乙酸酐，用超聲波粉碎器粉碎15分鐘左右后，再次進行1小時?；磻?yīng)。然后，添加乙醇至其最終濃度為20％,30％,40％,50％,60％,70％，使其最終體積為20ml后(參照表2)，在4℃攪拌混合30分鐘，離心分離，回收DNA沉淀物。進而將其用70％乙醇5ml洗滌2次在真空下蒸發(fā)出乙醇得到DNA。在所述回收的DNA中加入TE緩沖液(pH 8.0)5ml，待溶解后，進行1.8％瓊脂糖膠電泳，TE溶液中DNA樣品0.1ml加入到1.9ml的蒸餾水中，測定OD值。其結(jié)果如
圖1和表3所示。
表2不同乙醇濃度的樣品容量
圖2中泳道1和泳道4是使用溶液1的結(jié)果；泳道2和泳道5是使用溶液2的結(jié)果；泳道3和泳道6是使用除去抑制核酸水解酶作用的20mM EDTA的溶液1的結(jié)果。
表3不同乙醇濃度時測定的吸光度
如圖2和表3所示，乙醇濃度為20％,30％,40％時，雖純度高但回收率低，乙醇濃度為40％,50％,60％時，純度相對低，但回收率高。另外，細胞提取物立即進行電泳時(泳道1～3)，蛋白質(zhì)成分和DNA凝結(jié)，留在穴內(nèi)，進行?；磻?yīng)后，DNA能與蛋白質(zhì)有效地分離。實施例3在所述實施例1和實施例2中，為確認DNA完全被提取和分離，進行DNase和RNase酶實驗。所述實施例1和2中得到的DNA樣品10μl、和10倍濃縮反應(yīng)緩沖液(10mM Tris,pH 7.6,10mM MgCl2,50mMNaCl,1mM二硫蘇糖醇DTT)10μl、酶(DNase或RNase)10μl、D.W.70μl混合，總體積為100μl后，在36.7℃下反應(yīng)2小時30分鐘，在低溫箱中放置一夜后進行1.8％瓊脂糖膠電泳。其結(jié)果如圖3所示。如該圖所示，用DNase處理結(jié)果，幾乎沒有留下推測存在DNA的譜帶，用RNase處理時，DNA完全留在其中。實施例4在含有4M NaNO3、0.1M Na2CO3的溶液(PH值約11)300ml中加入25g明太魚的精原細胞，用家庭用攪拌器粉碎，在冷藏室內(nèi)用超聲波粉碎器粉碎1小時并過濾。在過濾液中加入2ml的乙酸酐，4℃?；磻?yīng)1小時后，再加入2ml乙酸酐，4℃進行2小時?；磻?yīng)。然后，添加乙醇至其最終濃度為50～60％，在4℃攪拌混合30分鐘，離心分離，回收DNA沉淀物。該沉淀物用70％乙醇洗滌一次后，蒸發(fā)乙醇，得到DNA。所述回收的DNA溶解在TE(PH8.0))緩沖液中。為確認得到的DNA純粹提取和分離，進行DNase酶實驗。上面得到的DNA樣品10μl和10倍濃縮反應(yīng)緩沖液(10mM Tris,pH7.6,10mMMgCl2,50mM NaCl,lmM DTT)10μl、蒸餾水70μl混合，總體積為100μl后，在36.7℃放置過夜(16小時)反應(yīng)后，進行1.8％瓊脂糖膠電泳。其結(jié)果如圖4所示。如圖4所示，用DNase處理結(jié)果，幾乎沒有留下推測存在DNA的譜帶。在該圖中，泳道1表示明太魚的精原細胞提取的DNA，泳道2表示從所述明太魚的精原細胞中提取的核酸，用DNase水解的結(jié)果。另外，測定吸光度結(jié)果，在常溫進行?；磻?yīng)時，OD260/280=1.93,DNA的濃度(mg/ml)為1.15，而在低溫進行?；磻?yīng)時，OD 260/280=1.96,DNA濃度(mg/ml)為1.05，證明低溫?；磻?yīng)的提取率高。
如以上說明所述，本發(fā)明不使用污染物質(zhì)，容易且有效地分離魚類的DNA。另外，本發(fā)明方法的殘留的副產(chǎn)物中含有硝酸鹽、磷酸鹽、各種有機物等，直接作為液體肥料成分使用，非常經(jīng)濟。
圖2為不同乙醇濃度的瓊脂糖膠電泳照片。
圖3為用核酸分解酶處理的瓊脂糖膠電泳動照片。
圖4為從明太魚的精原細胞分離的DNA的瓊脂糖膠電泳動照片。
權(quán)利要求
1．從魚類的精原細胞中提取核酸的方法，其特征是包括下列步驟A)破碎魚類的精原細胞，得到乳白色的膠體；B)在所述膠體中加入含有1M以上的pH值為8～12的一價離子鹽的堿性溶液；C)向上述步驟得到的混合溶液中加入乙醇，沉淀核酸。
2．權(quán)利要求1所述的從魚類的精原細胞中提取核酸的方法，其特征是所述魚類的精原細胞為烏賊的精原細胞或明太魚的精原細胞。
3．權(quán)利要求1所述的從魚類的精原細胞中提取核酸的方法，其特征是同時進行所述的步驟A)和步驟B)。
4．權(quán)利要求1或3所述的從魚類的精原細胞中提取核酸的方法，其特征是在所述步驟B)中增加在制備的混合溶液中加入?；磻?yīng)物的步驟。
5．權(quán)利要求4所述的從魚類的精原細胞中提取核酸的方法，其特征是所述?；磻?yīng)物是酸酐。
6．權(quán)利要求5所述的從魚類的精原細胞中提取核酸的方法，其特征是所述酸酐是乙酸酐。
7．權(quán)利要求1所述的從魚類的精原細胞中提取核酸的方法，其特征是所述鹽選自由硝酸鈉、碳酸鈉、磷酸鈉所組成的組中。
8．權(quán)利要求1所述的從魚類的精原細胞中提取核酸的方法，其特征是用旋轉(zhuǎn)葉片型粉碎器或超聲波粉碎器破碎精原細胞。
9．權(quán)利要求1所述的從魚類的精原細胞中提取核酸的方法，其特征是增加RNA分解的步驟。
10．權(quán)利要求9所述的從魚類的精原細胞中提取核酸的方法，其特征是所述RNA分解步驟采用堿處理或RNA酶分解。
11．液體肥料，其特征是破碎魚類的精原細胞，在其破碎液中加入pH值為8～12的堿性溶液得到制備溶液，從制備溶液中分離DNA，所殘留的溶液為液體肥料。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種不使用污染產(chǎn)生物質(zhì),從魚類的精原細胞中方便且有效地得到DNA,并使其副產(chǎn)物作為液體氮肥使用的方法。該方法包括:A)破碎、分離魚類的精原細胞,得到浮白色的膠體;B)將所述膠體用含有1M以上的pH值為8~12的一價離子鹽堿性溶液處理;C)向所述混合物中加入乙醇,沉淀DNA。
文檔編號C12N5/02GK1302810SQ0012998
公開日2001年7月11日 申請日期2000年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月23日
發(fā)明者樸韓浯, 李仁雨 申請人:株式會社百尼爾