專利名稱：人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽、其編碼序列及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽，其與天然人Neurturin相比，N-末端缺失了2-6個(gè)氨基酸。本發(fā)明還涉及編碼所述人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽的多核苷酸，含有所述多核苷酸的表達(dá)載體，用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，以及生產(chǎn)所述人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽的方法。
本領(lǐng)域公知的是，在大腸桿菌中表達(dá)異源蛋白常遇到表達(dá)量低和形成不溶性包涵體的問題。采用表達(dá)融合蛋白的策略(如與TrxA,GST等融合)、降低溫度等方法雖可部分解決問題，但很多情況下，基因本身的編碼序列對(duì)表達(dá)的影響更顯著。在原核生物中，由于不同的tRNA在含量上的差異很大，產(chǎn)生了對(duì)密碼子的偏愛性，從而影響了基因的表達(dá)，特別是靠近起始密碼區(qū)稀有密碼子的聚集對(duì)表達(dá)的抑制更嚴(yán)重(Hu等，蛋白質(zhì)表達(dá)與純化，7,289-293,1996)。另外研究表明在成熟蛋白N末端存在精氨酸時(shí)常會(huì)影響其表達(dá)和穿過內(nèi)膜的功能(Andersson等，F(xiàn)EBS通信，347,169-172,1994)。
Neurturin(NTN)是1996年底新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，其成熟肽與GDNF有42％的同源性，它們共同組成了TGF-β超家族的一個(gè)亞家族。NTN對(duì)多巴胺能神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及外周神經(jīng)系統(tǒng)的各類交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元等都有很強(qiáng)的營養(yǎng)作用和損傷修復(fù)作用，為帕金森病及肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)等神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷疾病的治療開辟了新的途徑。由于這些因子在體內(nèi)含量甚微，提取困難，造價(jià)昂貴，利用E.coli來生產(chǎn)，具有低成本、高效率、短周期的特點(diǎn)，已越來越成為人們研究的熱門領(lǐng)域。但是已有的實(shí)踐表明，人Neurturin蛋白在原核系統(tǒng)的表達(dá)不是令人滿意，究其原因，可能是由于人Neurturin基因5′端有多個(gè)稀有密碼子聚集，且第二個(gè)氨基酸為精氨酸。因此，本發(fā)明人由此入手，通過缺失和突變編碼人Neurturin基因的5′端序列而在體外高效表達(dá)和制備具有Neurturin活性的人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽，因而具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種編碼人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽的DNA序列，該DNA序列能在原核系統(tǒng)如大腸桿菌中高產(chǎn)量表達(dá)。
本發(fā)明的再一目的在于提供所述的人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽本發(fā)明的又一目的在于提供生產(chǎn)人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽的DNA序列，其特征在于，其表達(dá)產(chǎn)物與天然人Neurturin相比，N-末端缺失了2-6個(gè)氨基酸，并且在不改變所編碼的氨基酸組成的前提下，該多核苷酸的5′端有4個(gè)密碼子突變?yōu)?個(gè)大腸桿菌嗜用的密碼子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA序列如SEQ ID NO:1中的核苷酸序列所示。在SEQ ID NO:1中，編碼人Neurturin蛋白的N-末端頭兩個(gè)氨基酸Ala和Arg的兩個(gè)密碼子被缺失(在SEQ ID NO:1以橫線示出)，另外，編碼人Neurturin蛋白的N-末端第3、4、6和9位氨基酸的密碼子被突變?yōu)榇竽c桿菌嗜用的密碼子，突變涉及T→C,G→T,G→T,G→C的突變(在SEQID NO:1中以斜體示出)。本發(fā)明的DNA序列可摻入任何已知的原核表達(dá)載體，從而在原核系統(tǒng)特別是大腸桿菌中高效表達(dá)。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA序列摻入表達(dá)載體pHM39(本發(fā)明人構(gòu)建，其圖譜見


圖1)中，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pHM39-NTNLM，然后用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HB101。由此得到的轉(zhuǎn)化菌株命名為HB101-NTNLM，其于1999年10月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO.0421。另外，為促進(jìn)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的純化，本發(fā)明的多核苷酸可與例如六組氨酸標(biāo)記序列融合，以利于用金屬螯合親和層析法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。本發(fā)明的DNA序列也可與硫氧還蛋白編碼基因或pelB基因融合以提高表達(dá)產(chǎn)量及產(chǎn)物的可溶性。
本發(fā)明的另一方面涉及利用大腸桿菌細(xì)胞制備人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽的方法，所述的方法包括將本發(fā)明的DNA序列克隆到原核表達(dá)載體中，以重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，最后分離純化表達(dá)的人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽。如此獲得的產(chǎn)物的表達(dá)量占菌體總蛋白的5-30％，其中可溶性表達(dá)占20-40％，天然NTN蛋白則沒有可溶性表達(dá)。并且所表達(dá)的人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽經(jīng)純化后具有完好的生物學(xué)活性(見實(shí)施例部分)。
以下將參照附圖和實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。其中
圖1示出重組質(zhì)粒pHM39-NTNLM的構(gòu)建。
圖2示出SDS-PAGE檢測(cè)實(shí)施例3獲得的純化NTNLM蛋白純度的結(jié)果。圖中泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(Promega公司)，分子量由大至小為31.0KD,20.4/19.7kD,16.9kD,14,4kD,8.1kD；泳道2為作為對(duì)照的大腸桿菌細(xì)胞裂解液；泳道3為表達(dá)NTNLM的遺傳工程大腸桿菌細(xì)胞裂解液；泳道4為經(jīng)純化得到的NTNLM多肽。
圖3為如實(shí)施例4所述用雞背胚根神經(jīng)節(jié)測(cè)定NTNLM的活性，圖中a為未加NTNLM的對(duì)照組；b為加入NTNLM的活性組。
實(shí)施例1人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽(NTNLM)編碼序列的擴(kuò)增1、提取人染色體DNA收集約20毫升新鮮血液，加入裝有3.5毫升酸性檸檬酸葡萄糖溶液B(ACD)的試管中，以1300g離心15分鐘，棄去上層血漿，小心吸取淡黃層移至另一試管中再次離心，第二次吸取的淡黃層重懸于15毫升抽提緩沖液中，37℃溫育1小時(shí)。然后按Sambrook等的分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)提供的方法提取染色體DNA。2、NTNLM基因的合成根據(jù)從GenBank查詢的人Neurturin(NTN)cDNA序列(GenBank登記號(hào)為U78110)設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，用DNA合成儀及亞磷酸三酯法合成兩條寡核苷酸鏈。所述引物序列為上游引物1(21mer)刪除了NTN的N-末端前兩個(gè)氨基酸的密碼子，并選用大腸桿菌嗜用的密碼子(*表示突變的堿基，[]內(nèi)為人天然NTN基因的堿基)5′-*C[T]TGGG*T[G]GCGCG*T[G]CCTTGCGG*C[G]-3′下游引物2(27mer)為克隆方便起見，在5′末端增加限制性內(nèi)切酶BamHⅠ的位點(diǎn)5′-CGGGATCCTCACACGCAGGCGCACTCG-3′BamHⅠ以上述步驟1中獲得的人染色體DNA為模板，在上述合成的引物參與下經(jīng)30輪PCR循環(huán)制得NTNLM基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中PCR循環(huán)條件為94℃變性1分鐘，59℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，所使用的PCR反應(yīng)混合物總反應(yīng)體積為100微升。實(shí)施例2重組質(zhì)粒pHM39-NTNLM的構(gòu)建及鑒定如
圖1所示，將本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的表達(dá)載體pHM39用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ酶切，加入dNTP和DNA聚合酶Klenow大片段補(bǔ)平，然后再用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ酶切。將實(shí)施例1中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ酶切后與上述處理好的表達(dá)載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組克隆。從中獲得的重組質(zhì)粒命名為pHM39-NTNLM。
以重組質(zhì)粒pHM39-NTNLM為底物，在上述克隆引物參與下經(jīng)30輪PCR循環(huán)制得擴(kuò)增產(chǎn)物，其中PCR循環(huán)條件為94℃變性1分鐘，69℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，所使用的PCR反應(yīng)混合物總反應(yīng)體積為20微升。經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，可見PCR擴(kuò)增得到310bp DNA克隆片段，與預(yù)期的一致。
將經(jīng)過鑒定的重組質(zhì)粒pHM39-NTNLM進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明克隆的NTNLM基因序列正確，且與天然NTN基因(GenBank登記號(hào)U78110)相比，在基因的5′端缺失了GCG CGG六個(gè)堿基，且有4個(gè)堿基突變。NTNLM基因的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
實(shí)施例3 NTNLM多肽的表達(dá)和純化以實(shí)施例2所得的重組質(zhì)粒pHM39-NTNLM轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HB101，得到相應(yīng)的遺傳工程細(xì)胞。
挑取平板上單個(gè)工程菌菌落接種加入適當(dāng)抗生素的TP培養(yǎng)基(胰蛋白胨2％，酵母膏1.5％,Na2HPO40.2％,KH2PO40.1％,NaCl 0.8％,121℃滅菌20分鐘，用前加入20％葡萄糖，使其終濃度為0.2％)，37℃搖床培養(yǎng)過夜，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接于三角瓶中，應(yīng)用2L搖瓶培養(yǎng)遺傳工程菌株。工程菌培養(yǎng)至OD6000.4～0.6后，加入0.4mmol/LIPTG誘導(dǎo)3～5小時(shí)，以促進(jìn)NTNLM多肽的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)NTNLM多肽的表達(dá)量可大于菌體總蛋白的20％以上。
收集如此得到的培養(yǎng)液，于4℃下以6000rpm離心10分鐘收集菌體，用預(yù)冷的PBS(0.8％NaCl,0.02％KCl,0.02％Na2HPO4,0.02％KH2PO4pH7.3)洗滌，然后按10ml/g濕重向收獲的細(xì)胞中加入菌體裂解液(50mmol/L Tris.Cl pH8.0,1mmol/L EDTA,100mmol/LNaCl,1mmol/L苯甲基磺酰氟PMSF，1mg/ml溶菌酶)，4℃30分鐘，然后通過超聲波破碎裂解細(xì)胞。12,000g離心15分鐘，可溶性蛋白在上清中，包涵體在沉淀中。SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NTNLM多肽主要以包涵體形式表達(dá)。當(dāng)NTNLM多肽與硫氧還蛋白融合表達(dá)時(shí)，40％以上的表達(dá)蛋白以可溶狀態(tài)存在(數(shù)據(jù)未示出)。
從包涵體中純化NTNLM多肽如下進(jìn)行。其中純化過程中使用的溶液為包涵體洗滌液50mmol/L Tris-HCl(pH8.0),2mmol/L EDTA,0.1％TritonX-100,10mmol/L MgCl2,2mol/L Gdn-HCl包涵體溶解液6mol/L Gdn-HCl,50mmol/L Tris-HCl pH8.0,用前加入10mmol/L β-巰基乙醇或2mmol/L DTT蛋白復(fù)性緩沖液50mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.5mol/L Gdn-HCl,GSH/GSSG 2mmol/L/1mmol/L基本步驟(1)包涵體的洗滌細(xì)菌裂解物用5,000g 4℃離心20分鐘，棄上清，沉淀中加入等體積的包涵體洗滌液混勻，冰浴30分鐘后6,000g 4℃離心20分鐘得沉淀。
在純化過程中，包涵體的分離是個(gè)關(guān)鍵，包涵體密度大，不溶于水，因此通過低速離心可與胞漿中可溶性蛋白及小的細(xì)胞碎片分離。但包涵體表面常因帶負(fù)電荷而吸附酸性的核酸、胞漿蛋白、膜蛋白及內(nèi)毒素等雜質(zhì)。利用DNase可以降解核酸，利用表面活性劑Triton X-100可以溶解膜蛋白和脂質(zhì)，EDTA可以抑制蛋白酶活性同時(shí)螯合一些膜蛋白，PMSF可以抑制蛋白酶活性。實(shí)驗(yàn)中采用含上述物質(zhì)的菌體裂解液和洗滌液，保證了得到高質(zhì)量的包涵體。
(2)包涵體的裂解洗滌后的包涵體加入適量的裂解液(含10mmol/L β-巰基乙醇或2mmol/L DTT,)，4℃攪拌過夜或37℃1小時(shí)，10000g 4℃離心10分鐘，收集上清。
由于SDS、尿素裂解包涵體不利于復(fù)性，且有化學(xué)修飾作用，因此選用鹽酸胍作為NTNLM多肽包涵體促溶劑。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，濃度為4M的鹽酸胍即可溶解包涵體，但溶解不完全，沉淀中含有較多NTNLM多肽。6M的鹽酸胍可以完全溶解包涵體。在鹽酸胍中加入2mM DTT或10mMβ-巰基乙醇可提高包涵體溶解的效率，使二硫鍵完全被打開。
(3)NTNLM的復(fù)性--雙體形式、有生物學(xué)活性的NTNLM多肽的獲得用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算稀釋體積使蛋白終濃度在0.02～0.2mg/ml之間。將純化的單體形式、變性蛋白溶液緩慢加入復(fù)性緩沖液中，4℃放置36-72小時(shí)。10000rpm離心20min去除沉淀。
(4)Q-Sepharose離子交換層析純化NTNLM將離心得到的上清液通過平衡好的Q-Sepharose FF柱(柱體積2.6×6cm)，起始平衡液為20mmol/L Tris.HCl pH8.0，流速為1ml/min，階段洗脫，洗脫液A為20mmol/L Tris.HCl+1mol/L NaClpH8.0，洗脫液B為20mmol/L Tris.HCl+2mmol/L EDTA+4mol/L尿素pH8.0，收集含目標(biāo)蛋白質(zhì)NTNLM的洗脫峰，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度，見圖2。
實(shí)施例4 NTNLM多肽的生物學(xué)活性的測(cè)定采用雞背胚根神經(jīng)節(jié)測(cè)定NTNLM的活性。
于無菌條件下，取8天齡雞胚背根神經(jīng)節(jié)，小心剝離脂肪和結(jié)締組織，置于MEM培養(yǎng)液中，隨機(jī)接種于24孔板內(nèi)，每孔3-5個(gè)，加入雞血漿、重組NTNLM、凝血酶各25μl,37℃ 5％ CO2，培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。背根神經(jīng)節(jié)周圍可見放射狀的感覺神經(jīng)軸突向外伸展(圖3a)，對(duì)照組(圖3b)則僅可見圍繞背根神經(jīng)節(jié)的散在的成纖維細(xì)胞，這表明NTNLM具有較好的生物活性。SEQ ID NO1(人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物基因和多肽序列)CTG GGT GCG CGT CCT TGC GGC CTG CGC GAG CTG GAG GTG 45Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val 15CGC GTG AGC GAG CTG GGC CTG GGC TAC GCG TCC GAC GAG ACG GTG 90Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Gln Thr Val 30CTG TTC CGC TAC TGC GCA GGC GCC TGC GAG GCT GCC GCG CGC GTC 135Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val 45TAC GAC CTC GGG CTG CGA CGA CTG CGC CAG CGG CGG CGC CTG CGG 180Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg 60CGG GAG CGG GTG CGC GCG CAG CCC TGC TGC CGC CCG ACG GCC TAC 225Arg Glu Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr 75GAG GAC GAG GTG TCC TTC CTG GAC GCG CAC AGC CGC TAC CAC ACG 270Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr 90GTG CAC GAG CTG TCG GCG CGC GAG TGC GCC TGC GTG TGA 309Val His Glu Leu Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val Ter 10權(quán)利要求
1.編碼人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽的DNA序列，其特征在于，其表達(dá)產(chǎn)物與天然人Neurturin相比，N-末端缺失了2-6個(gè)氨基酸，并且在不改變所編碼的氨基酸組成的前提下，該多核苷酸的5′端有4個(gè)密碼子突變?yōu)?個(gè)大腸桿菌嗜用的密碼子。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其具有如SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列。
3.含有如權(quán)利要求1或2所述的DNA序列的表達(dá)載體。
4.用權(quán)利要求3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。
5.如權(quán)利要求4所述的大腸桿菌，其為大腸桿菌菌株HB101-NTNLM，其于1999年10月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO.0421。
6.人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽，所述的多肽與天然人Neurturin相比，N-末端缺失了2-6個(gè)氨基酸。
7.如權(quán)利要求6所述的人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽，其具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
8.一種生產(chǎn)人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽的方法，所述的人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽與天然人Neurturin相比，N-末端缺失了2-6個(gè)氨基酸，所述方法包括培養(yǎng)用權(quán)利要求3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌使其表達(dá)人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽，以及純化所述的人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽。
9.如權(quán)利要求8的方法，其中所述的人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽具有SEQID NO:1中所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽,其與天然人Neurturin相比,N－末端缺失了2－6個(gè)氨基酸。本發(fā)明還涉及編碼所述人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽的多核苷酸,在不改變所編碼的氨基酸組成的前提下,該多核苷酸的5′端有4個(gè)密碼子突變?yōu)?個(gè)大腸桿菌嗜用的密碼子。本發(fā)明還涉及含有所述多核苷酸的表達(dá)載體,用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌,以及生產(chǎn)所述人Neurturin結(jié)構(gòu)類似物多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1311331SQ0013025
公開日2001年9月5日 申請(qǐng)日期2000年11月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月1日
發(fā)明者馬雪梅, 黃秉仁 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所