專利名稱：α－酮戊二酸脫氫酶基因的制作方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1995年6月7日，申請(qǐng)?zhí)枮?5194559.9，發(fā)明名稱為“α-酮戊二酸脫氫酶基因”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及用于L-谷氨酸和L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的棒狀桿菌的培育和利用。特別地，本發(fā)明涉及α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)有缺陷的棒狀產(chǎn)L-谷氨酸細(xì)菌，一種利用該細(xì)菌生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，一種編碼具有α-KGDH活性的酶并來源于棒狀產(chǎn)α-谷氨酸細(xì)菌的基因(α-KGDH基因)，含有該基因的重組DNA，攜帶該重組DNA的棒狀桿菌以及一種利用攜帶該重組DNA并具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
迄今為止在工業(yè)上利用短桿菌或棒狀桿菌屬的棒狀桿菌采用發(fā)酵方法生產(chǎn)L-谷氨酸。
最近公開一種大腸桿菌突變株，其中α-KGDH活性缺陷或降低并且谷氨酸分解活性降低，具有高的L-谷氨酸生產(chǎn)能力(日本公開專利5-244970號(hào))。
相反地，據(jù)報(bào)道一種短桿菌屬的細(xì)菌突變株與其母本菌株相比，α-KGDH活性降低，L-谷氨酸生產(chǎn)能力卻近似相等(農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，44,1897(1980)，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，46,493(1982))。因此認(rèn)為α-KGDH活性水平對(duì)棒狀桿菌中L-谷氨酸的生產(chǎn)并不重要。
另一方面，發(fā)現(xiàn)一種短桿菌屬的產(chǎn)L-谷氨酸細(xì)菌的突變株，其α-KGDH活性降低，將該細(xì)菌培養(yǎng)于以過量生物素為碳源且不加入如青霉素及表面活性劑的有抑制生物素效應(yīng)的物質(zhì)的培養(yǎng)基中，細(xì)菌高效地生產(chǎn)L-谷氨酸(最大產(chǎn)率53％)(日本公開專利6-23779號(hào))。然而，如上述已認(rèn)為α-KGDH活性水平對(duì)棒狀桿菌中L-谷氨酸的生產(chǎn)并不重要，卻沒有已將產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH基因克隆并分析的例子。并且并未發(fā)現(xiàn)α-KGDH完全缺陷的棒狀桿菌突變株。
本發(fā)明的一個(gè)目的是得到來源于產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH基因，制備含有該基因的重組DNA，利用該重組DNA轉(zhuǎn)化的微生物搞清α-KGDH活性對(duì)L-谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的影響，并因而提供一種培育產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌的新方法。具體地，本發(fā)明的一個(gè)目的是通過破壞染色體DNA上α-KGDH基因得到α-KGDH活性缺陷的產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌，并提供一種用該細(xì)菌生產(chǎn)L-谷氨酸的方法。而且，本發(fā)明試圖提供一種攜帶含有α-KGDH基因的重組DNA的棒狀桿菌，和一種利用攜帶該重組DNA并具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
本發(fā)明人得到一種來源于產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH基因，闡明其結(jié)構(gòu)，用已引入該基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一種產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌，并研究得到的轉(zhuǎn)化體的α-KGDH活性水平與L-谷氨酸生產(chǎn)能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-KGDH活性顯著影響L-谷氨酸的生產(chǎn)。而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一種菌株，其中通過破壞產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌染色體上α-KGDH基因消除了α-KGDH活性，該菌株培養(yǎng)于含有過量生物素且不加入如表面活性劑和青霉素的任何抑制生物素作用的物質(zhì)的培養(yǎng)基中，生產(chǎn)并積累相當(dāng)量的L-谷氨酸。另外，本發(fā)明人將含有α-KGDH基因的重組DNA導(dǎo)入具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，得到轉(zhuǎn)化體的L-賴氨酸生產(chǎn)能力顯著提高，于是本發(fā)明在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成。
換句話說，本發(fā)明提供(1)一種產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌，它由于染色體上編碼具有α-KGDH活性的酶的基因及其啟動(dòng)子的核苷酸序列中一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的替換、缺失、插入、加入或倒位而造成α-KGDH活性缺失。
(2)一種生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，包括在液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)上述(1)款的產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌，在培養(yǎng)液中生產(chǎn)并積累L-谷氨酸，再收集。
(3)一種來源于產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH基因。
(4)通過將來源于產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH基因與在棒狀桿菌中起作用的載體相連接得到的重組DNA。
(5)攜帶上述(4)款的重組DNA的棒狀桿菌。
(6)一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶上述(4)款的重組DNA并具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌，在培養(yǎng)液中生產(chǎn)并積累L-賴氨酸，再收集。
本發(fā)明進(jìn)一步如下詳述，
本發(fā)明的產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌包括以前歸類于短桿菌屬但現(xiàn)在屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌(國(guó)際系統(tǒng)微生物學(xué)雜志，41,255,(1981))，還包括屬于短桿菌屬但與棒狀桿菌屬親緣關(guān)系近的細(xì)菌。這樣的產(chǎn)L-谷氨酸棒狀細(xì)菌舉例如下嗜乙酰酸棒狀桿菌乙酰谷氨酸棒狀桿菌頸棒狀桿菌谷氨酸棒狀桿菌百合棒狀桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)melassecola棒狀桿菌擴(kuò)展短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)黃色短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)immariophilum短桿菌乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)玫瑰色短桿菌糖分解短桿菌生硫短桿菌嗜熱產(chǎn)氨(thermoaminogenes)棒狀桿菌特別地，舉下列菌株為例嗜乙酰酸棒狀桿菌ATCC13870乙酰谷氨酸棒狀桿菌ATCC15806頸棒狀桿菌ATCC15991谷氨酸棒狀桿菌ATCC13020百合棒狀桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC15990melassecola棒狀桿菌ATCC17965擴(kuò)展短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC14020黃色短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC14067immariophilum短桿菌ATCC14068乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825糖分解短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240
嗜熱產(chǎn)氨棒狀桿菌AJ12340(FERM BP1539)本發(fā)明的α-KGDH基因可以如下述那樣從上述產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌野生菌株或其突變株的染色體DNA中獲得。
已知大腸桿菌的α-KGDH復(fù)合體由三個(gè)亞基E1(α-酮戊二酸脫氫酶EC1.2.4.2)，E2(二氫硫辛胺琥珀酰氨轉(zhuǎn)移酶EC2.3.1.61)，和E3(硫辛胺脫氫酶1.6.4.3)組成，E1和E2基因形成操縱子結(jié)構(gòu)，E3與丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.4.1)共用。大腸桿菌E1與E2基因的核苷酸序列已搞清(歐洲生物化學(xué)雜志，141,351(1984)，細(xì)菌學(xué)雜志，141,361(1984))。
對(duì)枯草芽孢桿菌，E1和E2基因的核苷酸序列也已搞清(細(xì)菌學(xué)雜志，171,3667(1989)，基因，61,217(1987)，等)。
于是通過利用大腸桿菌和枯草芽孢桿菌E1基因核苷酸序列的同源性，本發(fā)明人成功地分離并克隆了來源于產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH基因。并且給出下述步驟。
首先，選擇大腸桿菌和枯草芽孢桿菌α-KGDH的E1亞基基因中有高度同源性的區(qū)段，根據(jù)其兩端的序列合成引物，只要滿足下列條件具有隨機(jī)核苷酸組成，E+C的含量約50％，不形成特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，相互之間不互補(bǔ)，任何序列均可用作引物。常用20-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列。特別地，序列表中SEQ ID NOS:3和4中的序列用作例子。
其次，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR法)從引物和枯草芽孢桿菌染色體DNA制備含有部分枯草芽孢桿菌α-KGDH基因的探針。任何長(zhǎng)度不小于20個(gè)核苷酸的探針均可應(yīng)用，不過，探針長(zhǎng)度最好不小于約100個(gè)核苷酸。探針最好具有與目的基因序列互補(bǔ)的核苷酸序列，不過，具有高度同源性的探針也可采用。
另一方面，提取產(chǎn)L-谷氨酸棒狀細(xì)菌的染色體DNA，用限制性內(nèi)切酶消化染色體DNA得到的DNA片段與載體相連接，制備重組DNA，重組DNA用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌?？捎美鏐amHⅠ,EcoRⅠ,XhoⅠ的限制性內(nèi)切酶。采用來源于大腸桿菌的載體，如pUC19和pBR322。任何適于載體復(fù)制的菌株均可用做重組DNA的受體菌株。例如可用大腸桿菌菌株如HB101,JW109和DH5。
從這樣得到的轉(zhuǎn)化體中用菌落雜交手段選擇與探針DNA雜交的菌株，從該轉(zhuǎn)化體中回收重組DNA。分析與載體連接的產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌染色體DNA的限制性內(nèi)切酶片段的結(jié)構(gòu)。
得到的DNA片段并不一定包含編碼目的酶的基因的全長(zhǎng)。這種情況下，用另一種限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌的染色體DNA，并使之與載體連接。制備重組DNA。重組DNA用來進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用上面的方法利用菌落雜交選擇并分析限制性內(nèi)切酶片段。于是可得到含有α-KGDH基因全長(zhǎng)的DNA片段。操作過程中，可方便地利用第一次得到的DNA片段作探針進(jìn)行菌落雜交。
含有α-KGDH基因的DNA片段與另一適當(dāng)載體重組后導(dǎo)入產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌?？捎玫妮d體例如在棒狀桿菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒。特別地，例子有pAM330(日本公開專利58-67699號(hào))，pHM1519(日本公開專利58-77895號(hào))，pAJ655,pAJ611,pAJ1844(日本公開專利58-192900號(hào))，前三者，pCG1(日本公開專利57-134500號(hào))，pCG2(日本公開專利58-35197號(hào))，pCG4,pCG11(日本公開專利57-183799號(hào))，pHK4(日本公開專利5-7491號(hào))等。
為了通過將上述載體與產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌α-KGDH基因相連接制備重組DNA，事先用限制性內(nèi)切酶切割載體。用來切割的限制性內(nèi)切酶與用來切割染色體DNA的相同。備選地，用可產(chǎn)生與染色體DNA片段切割面互補(bǔ)的切割面的限制性內(nèi)切酶來切割。通常用例如74DNA連接酶連接。
用迄今見于報(bào)道的轉(zhuǎn)化方法將不同的重組DNA導(dǎo)入受體。例如對(duì)大腸桿菌K-12報(bào)導(dǎo)有一種方法用氯化鈣處理受體細(xì)胞增加DNA通透能力(分子生物學(xué)雜志，53,159,(1970))。對(duì)枯草芽孢桿菌報(bào)導(dǎo)有一種方法用增殖期細(xì)胞制備轉(zhuǎn)化態(tài)細(xì)胞以導(dǎo)入DNA(C.H.基因，1,153,(1977)。備選地，也可用一種方法將DNA受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化成可容易地導(dǎo)入重組DNA的原生質(zhì)體或原生質(zhì)狀態(tài)后將重組DNA導(dǎo)入DNA受體，已知該法用于枯草芽孢桿菌、放線菌和酵母(分子基因遺傳學(xué)，168,111(1979),Nature,274,398(1978)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，75,1929(1978))。
用原生質(zhì)體方法，既使在上述用于枯草芽孢桿菌的方法的情況下也能得到足夠高的頻率，不過，日本公開專利57-183799號(hào)公開，也可利用一種方法，其中棒狀桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞的原生質(zhì)體接觸二價(jià)金屬離子和聚乙二醇與聚乙烯醇二者任一種的狀態(tài)下導(dǎo)入DNA。不加聚乙二醇和聚乙烯醇而加入羧甲基纖維素、葡聚糖、Ficoll.Bruronic F68(Selva公司制造)等也協(xié)助DNA導(dǎo)入。本發(fā)明實(shí)施例應(yīng)用的轉(zhuǎn)化方法是電脈沖法(見日本公開專利2-207791號(hào))。
這樣得到的細(xì)菌菌株，其中導(dǎo)入了含有來源于產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌α-KGDH基因的重組DNA培養(yǎng)于含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和可選的有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)的普通培養(yǎng)基。于是可以在細(xì)胞中高水平地生產(chǎn)具有α-KGDH活性的酶。
糖類如葡萄糖、蔗糖、糖蜜廢料、淀粉水解物或有機(jī)酸如乙酸和檸檬酸，以及醇類如乙醇用作碳源，脲、銨鹽、液氨、氨氣等用作氮源，磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽、鐵鹽、錳鹽等用作無(wú)機(jī)鹽。氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸以及含有它們蛋白胨、酵母提取物、大豆蛋白水解物等用作有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)。
供氧條件下培養(yǎng)10-40小時(shí)，溫度5-37℃，pH控制在5-9。
培養(yǎng)完成后，定量確定培養(yǎng)液中生產(chǎn)并積累的L-谷氨酸，并測(cè)量細(xì)菌細(xì)胞中α-KGDH活性水平。用農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，44,1897(1980)中描述的方法等測(cè)量活性通過離心等方法從培養(yǎng)物中回收的細(xì)菌細(xì)胞用超聲處理(Frech Prees處理等粉碎，然后離心去除細(xì)胞殘片，凝膠過濾去除小分子量物質(zhì)得到測(cè)量用樣本。
于是對(duì)含有擴(kuò)增基因的產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌和一種不含擴(kuò)增基因的細(xì)菌研究α-KGDH活性水平與L-谷氨酸生產(chǎn)能力的關(guān)系。結(jié)果表明，在由于基因擴(kuò)增而α-KGDH活性水平升高的細(xì)菌中L-谷氨酸生產(chǎn)能力降低，見下述參考實(shí)施例1。
本發(fā)明的基因的利用包括通過插入藥物相關(guān)基因等制備α-KGDH活性缺陷菌株，通過修飾啟動(dòng)子等制備表達(dá)下降的菌株，從而可能有效地培育一種細(xì)菌菌株，其L-谷氨酸生產(chǎn)能力與普通產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌相比進(jìn)一步提高。
用利用化學(xué)試劑誘變的方法或基于基因重組的方法得到α-KGDH活性缺陷的菌株。然而在利用化學(xué)試劑引入突變的方法中，獲得α-KGDH活性降低的菌株相對(duì)容易，獲得該活性完全缺失的菌株難。為得到后一種菌株，由于如上述α-KGDH基因的結(jié)構(gòu)已闡明，通過基因同源重組修飾或破壞染色體上α-KGDH基因，這樣的方法可能是有利的。通過同源重組破壞基因的方法已被建立，可以用利用線性DNA的方法，利用溫度敏感性質(zhì)的方法等。
特別地，用定點(diǎn)突變生成方法(Kramer,W和Frits.H.J.,酶學(xué)方法，154,350(1987))或用化學(xué)試劑如次硫酸鈉和羥胺處理(Shortle,D與Nathans,D.,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，75,270,(1978))在α-KGDH基因編碼區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列中造成一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、缺失、插入、增加或倒位。這樣修飾或破壞的基因用來替代染色體上的正?；颉Ｒ蚨赡苋コ?KGDH作為基因產(chǎn)物的活性或使α-KGDH基因不能轉(zhuǎn)錄。
定點(diǎn)突變生成方法利用一段合成寡聚核苷酸。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)在可選的有限堿基對(duì)中引入可選的替換、缺失、插入、加入或倒位，用該方法，首先，具有確定的DNA核苷酸序列的目的基因并被克隆的質(zhì)粒變性，制備單鏈。然后合成一段與將要產(chǎn)生突變的部分互補(bǔ)的合成寡聚核苷酸。不過，合成寡聚核苷酸不該具有完全互補(bǔ)的序列，而且有可選的核苷酸替換、缺失、插入、加入或倒位。單鏈DNA然后與具有可選的核苷酸替換、缺失、插入、加入或倒位的合成寡聚核苷酸退火。用DNA聚合酶1的Klenow片段和T4連接酶合成完整的雙鏈質(zhì)粒。導(dǎo)入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化態(tài)細(xì)胞。這樣得到的一些轉(zhuǎn)化體含有其中可選核苷酸替換、缺失、插入、加入或倒位被固定的基因。一種能將突變引入基因來修飾或破壞的相似方法包括重組PCR方法(PCR技術(shù)，Stockton press(1989))。
另一方面，利用化學(xué)試劑處理的方法中，含有目的基因的DNA片段直接用次亞硫酸鈉，一羥胺等處理，具有核苷酸替換、缺失、插入、加入或倒位的突變隨機(jī)引入DNA片段。
用通過引入突變來修飾或破壞得到的基因替換產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌染色體上正常基因的方法包括利用同源重組的方法(分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1972)；Matsuyama,S.和Mizushima,S.,微生物學(xué)雜志，162,1196(1985))。同源重組中，含有一段與染色體上序列同源的序列的質(zhì)粒等引入細(xì)菌細(xì)胞，在有同源性的序列部分以一定頻率發(fā)生重組，引入的整個(gè)質(zhì)粒就導(dǎo)入染色體。若后來在染色體上有同源性的序列部分進(jìn)一步發(fā)生重組，質(zhì)粒又會(huì)從染色體上分離脫落。這時(shí)，根據(jù)重組發(fā)生的位置，帶有引入突變的基因有時(shí)會(huì)固定到染色體上，而原來的正常基因隨質(zhì)粒從染色體上去掉并脫落。選擇這樣的細(xì)菌菌株，可得到細(xì)菌菌株，其中染色體上的一個(gè)正?；虮灰粋€(gè)引入了核苷酸替換、缺失、插入、加入或倒位以修飾或破壞的基因所替代。
這樣得到的α-KGDH活性缺陷的產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌特別是含有過量生物素的培養(yǎng)基中比具有部分降低的α-KGDH活性的菌株有明顯優(yōu)異的L-谷氨酸生產(chǎn)能力。
為了利用α-KGDH活性缺陷的產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)并積累L-谷氨酸，該細(xì)菌培養(yǎng)于含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子和其它養(yǎng)分的液體培養(yǎng)基中。常規(guī)地，若培養(yǎng)在含有過量生物素的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，有必要添加抑制生物素作用的物質(zhì)，即青霉素如青霉素G、F、K、O、V或X，或者富含脂肪酸的表面活性劑如蔗糖單軟脂?；蚓垩跻蚁└世嫣菃诬浿峄蚱溲苌?，到培養(yǎng)基中，以高產(chǎn)率地生產(chǎn)L-谷氨酸。
然而，用本實(shí)驗(yàn)的α-KGDH活性缺陷的產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌時(shí)，既使培養(yǎng)在含有10-100μg/l的高濃度生物素的液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行而不加任何上述抑制生物素作用的物質(zhì)，生產(chǎn)和積累的L-谷氨酸也產(chǎn)率高，積累高。
換句話說，對(duì)碳源，亦可用富含生物素的原材料如甜馬鈐薯和甜菜的糖汁或糖蜜廢料，除了(常用的)葡萄糖、果糖、糖化淀粉溶液，乙酸等。用于普通L-谷氨酸發(fā)酵的銨鹽，液氨、氨氣、脲等用作氮源。另外，視需要適當(dāng)添加無(wú)機(jī)離子如磷酸鹽和鎂鹽。視需要適當(dāng)加微量養(yǎng)分如硫胺素到培養(yǎng)基中。
優(yōu)選地在有氧條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中培養(yǎng)溫度優(yōu)選地控制在24-42℃,pH優(yōu)選地控制在5-9。無(wú)機(jī)或有機(jī)、酸性或堿性物質(zhì)，以及脲、碳酸鈣、氨氣等用來調(diào)節(jié)pH。
從培養(yǎng)液中收集L-谷氨酸的方法是適當(dāng)?shù)鼐C合已知方法如離子交換樹脂處理與結(jié)晶。
為了提高L-谷氨酸生產(chǎn)能力，增強(qiáng)谷氨酸生物合成的基因是有利的。增強(qiáng)谷氨酸生物合成系統(tǒng)基因的例子包括糖酵解途徑中的磷酸果糖激酶(PFK，日本公開專利63-102692號(hào))，回補(bǔ)途徑中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC，日本公開專利60-87788和62-55089號(hào))，TCA循環(huán)中的檸檬酸合成酶(CS，日本公開專利62-201585和63-119688號(hào))，順烏頭酸水解酶(ACO，日本公開專利62-294086號(hào))，異檸檬酸脫氫酶(ICDH，日本公開專利62-166890和63-214189號(hào))。胺化反應(yīng)的谷氨酸脫氫酶(GDH，日本公開專利61-268185號(hào))等。
為得到上述基因，可用下述方法。
(1)對(duì)于一突變株，其中一目的基因發(fā)生突變并表達(dá)特定性狀，得到一突變株，其中由于引入目的基因該性狀消失。從棒狀桿菌染色體得到與突變株性狀互補(bǔ)的基因。
(2)若目的基因已由另一生物體獲得并已闡明其核苷酸序列，利用具有高度同源性的區(qū)域的DNA作探針用雜交技術(shù)得到目的基因。
(3)若目的基因的一段核苷酸序列在細(xì)節(jié)上已相當(dāng)清楚，用PCR方法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法)利用棒狀桿菌染色體做模板得到含有目的基因的基因片段。
上述方法可用于獲得此處應(yīng)用的染色體。只要適用于上述方法應(yīng)用的棒狀桿菌，任何宿主-載體系統(tǒng)無(wú)可應(yīng)用。在本發(fā)明的實(shí)施例中利用上述方法(3)，它當(dāng)核苷酸序列已闡明時(shí)有效。
若用上述方法(2)和(3)得到基因，而目的基因原來沒有啟動(dòng)子，可以將在棒狀桿菌中具有啟動(dòng)子活性的DNA片段插入目的基因上游某一位置來表達(dá)目的基因。為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)可以將目的基因連到強(qiáng)啟動(dòng)子下游某一位置。在棒狀桿菌中起作用的強(qiáng)啟動(dòng)子包括大腸桿菌的lac啟動(dòng)子tac啟動(dòng)子，trp啟動(dòng)子等(Y.Morinaga,M.Tsuchiya,K.Miwa和K.Sano,J.Biotech.,5,305-312(1987))，此外，棒狀桿菌屬細(xì)菌的trp啟動(dòng)子也是優(yōu)選的啟動(dòng)子(日本公開專利，62-195294號(hào))。在本發(fā)明的實(shí)施例中，棒狀桿菌的trp啟動(dòng)子用于表達(dá)PEPC基因。
本發(fā)明的α-KGDH基因的擴(kuò)增有利于在具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌中提高其生產(chǎn)能力。
迄今有多種人工突變株用做產(chǎn)L-賴氨酸細(xì)菌。用它們作宿主以攜帶本發(fā)明的重組DNA可提高其L-賴氨酸生產(chǎn)能力，這樣的人工突變株包括對(duì)S(2-氨乙基)-半胱氨酸(以后縮寫為“AEC”)有抗性的突變株；生長(zhǎng)需要氨基酸如L-高絲氨酸的突變株(日本專利出版物48-28078和56-6499號(hào))；對(duì)AEC表現(xiàn)抗性并需要氨基酸如L-亮氨酸，L-高絲氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-精氨酸，L-丙氨酸和L-纈氨酸的突變株(美國(guó)專利3,708,395和3,825,472號(hào))；對(duì)DL-α-氨基-ε-(己內(nèi)酰胺，α-氨基-ω-十二碳內(nèi)酰胺，天冬氨酸類似物，磺胺藥物，醌和N-月桂酰亮氨酸表現(xiàn)抗性的產(chǎn)L-賴氨酸突變株；對(duì)草酰乙酸脫羧酶或呼吸系統(tǒng)酶的抑制劑表現(xiàn)抗性的產(chǎn)L-賴氨酸酶(日本公開專利50-53588,50-31093,52-102498,53-9394,53-86089,55-9783,55-9759,56-32995,56-39778號(hào)和日本專利出版物53-43591,53-1833號(hào))；需要肌醇或乙酸的產(chǎn)L-賴氨酸突變株(日本公開專利55-9784和56-8692號(hào))；對(duì)氟丙酮酸敏感或溫度不能低于34℃的產(chǎn)L-賴氨酸突變株(日本公開專利55-9783和53-86090號(hào))；對(duì)乙二醇表現(xiàn)抗性并生產(chǎn)L-賴氨酸的短桿菌或棒狀桿菌的突變株(見美國(guó)專利4,411,997號(hào))等。
特別地，舉下列菌株為例。
乳發(fā)酵短桿菌AJ12031(FERM-BP277，特開昭60-62994公報(bào))乳發(fā)酵短桿菌ATCC39134(特開昭60-62994公報(bào))谷氨酸棒狀桿菌AJ3463(FERM-P1987，特公昭51-34477公報(bào))乳發(fā)酵短桿菌AJ12435(FERM-BP-2294美國(guó)專利5,304,476)乳發(fā)酵短桿菌AJ12592(FERM-BP-3239美國(guó)專利5,304,476)谷氨酸棒狀桿菌AJ12596(FERM-BP-3242美國(guó)專利5,304,476)可通過與上述適當(dāng)載體連接將α-KGDH基因?qū)脒@樣的產(chǎn)L-賴氨酸細(xì)菌。
用于L-賴氨酸生產(chǎn)的培養(yǎng)基是含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子和可選的其它有機(jī)微量養(yǎng)分的普通培養(yǎng)基。糖類如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物，醇類如乙醇和肌醇，有機(jī)酸如乙酸、延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸用作碳源。無(wú)機(jī)銨鹽如硫酸銨，氯化銨和磷酸氨，有機(jī)氮如大豆水解物，氨氣，液氨等用作氮源。小量的磷酸鉀，硫酸鎂，鐵離子，錳離子等加入用作無(wú)機(jī)離子。適量的必需物質(zhì)如維生素B1。酵母提取物等如需要最好也包括在內(nèi)，用作有機(jī)微量養(yǎng)分。
優(yōu)選地在有氧條件下培養(yǎng)16-72小時(shí)，培養(yǎng)過程中培養(yǎng)溫度控制在30-45℃,pH控制在5-8.5，無(wú)機(jī)或有機(jī)、酸性或堿性物質(zhì)，以及氨氣可用來調(diào)整pH。
通?？赏ㄟ^綜合已知方法如離子交換樹脂法、沉淀法等從發(fā)酵液中收集L-賴氨酸。


圖1是含有α-KGDH基因的DNA片段的限制性內(nèi)切酶圖譜。
本發(fā)明將在下面參考實(shí)施例更清楚地說明。對(duì)限制性內(nèi)切酶，用商業(yè)產(chǎn)品(酒寶造公司制造)實(shí)施例1:α-KGDH基因的分離與結(jié)構(gòu)確定(1)制備探針選擇大腸桿菌和枯草芽孢桿菌α-KGDH的E亞基基因之間有高度同源性的區(qū)域，磷酰胺法用DNA合成儀(Model394，應(yīng)用生物系統(tǒng)制造)合成序列表中SEQ ID NOS.3和4給出的寡聚核苷酸。
寡聚核苷酸(0.25μmole)作引物，枯草芽孢桿菌NA64的染色體DNA(0.1μg)用普通方法制備(該菌株得自Bacillus Genetic StockCenter(Ohio大學(xué)，美國(guó))作模板，Taq DNA聚合酶(2.5單位)(酒寶造公司制造)加到0.1ml的10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.3)中，緩沖液含有dATP,dCTP,dGTP,dTTp各200μM,50mM氯化鉀，1.5mM氯化鎂和0.0001％明膠。用PCR方法，每輪包括94℃1分鐘，55℃分鐘2分鐘，72℃ 3分鐘，重復(fù)30次。反應(yīng)溶液走瓊脂糖凝膠電泳，目的DNA片段用玻璃粉(酒寶造公司制造)回收。用Klenow片段(Amersham制造)和[α-32dCTP](Amersham制造)以普通方法標(biāo)記DNA片段，用作探針。(2)乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869染色體DNA片段的制備乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869接種到500ml含1％細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨(Difco制造)，0.5％細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物(Difco制造)和0.5％氯化鈉的F-Y培養(yǎng)基(pH7.2)。31.5℃培養(yǎng)6小時(shí)得到培養(yǎng)物。培養(yǎng)物5000vpm離心10分鐘，得到2g濕細(xì)胞沉淀物。
用Saito和Miura的方法(Biochem.Biophvs.Acta.,72,619(1963))從細(xì)胞片狀沉淀物中提取染色體DNA。染色體DNA(2μg)和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ(200單位)分別與50mM含有10mM氯化鎂，100mM氫化鈉和1mM二硫蘇糖醇的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)混合，37℃反應(yīng)15小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用普通方法將溶液酚提取處理，并乙醇沉淀處理得到EcoRⅠ消化的乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869染色體DNA片段。(3)乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869α-KGDH基因的分離質(zhì)粒載體pUC18(酒寶造公司制造)(1μg)和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ(20單位)與50mM含有10mM氯化鎂，100mM氯化鈉和1mM二硫蘇糖醇的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)混合。用普通方法對(duì)溶液酚抽提和乙酸沉淀。然后，為防止來源于質(zhì)粒載體的DNA片段重新連接，用分子克隆，第二版(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，pl.60(1989)的方法用細(xì)菌堿性磷酸酶處理將DNA片段脫磷，接著用普通方法酚抽提和乙醇沉淀。
用EcoRⅠ消化的pUC18(0.1μg)，第(2)步得到的用EcoRⅠ消化的乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869染色體DNA片段(1μg)和74DNA(1單位)(Takara Shuzo Co.Ltd.制造)加到含有6.6mM氯化錳，10mM二硫蘇糖醇和10mM三磷酸腺苷的66mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，16℃反應(yīng)8小時(shí)連接DNA。然后DNA混合物用來用普通方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo Co.,Ltd.制造)。將細(xì)菌鋪到含100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基，得到約10,000轉(zhuǎn)化體。
用分子克隆，第二版(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，pl.90(1989)的方法與第(1)步得到的探針DNA雜交，從得到的轉(zhuǎn)化體中篩選出一個(gè)轉(zhuǎn)化體。(4)乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869α-KGDH基因核苷酸序列的確定用分子克隆，第二版(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，pl.25(1989)中堿性細(xì)菌水解方法從第(3)步得到的轉(zhuǎn)化體體制取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA含有來源于乳酸發(fā)酵短桿菌AT13869染色體DNA的約6千堿基的DNA片段。在(3)中反應(yīng)組成用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ消化質(zhì)粒，然后用普通方法瓊脂糖凝膠電泳。與(3)相同進(jìn)行Southern雜交確定與探針DNA雜交的片段。結(jié)果表明一段用EcoRⅠ和XhoⅠ消化的約3千堿基的切割片段雜交。如(3)那樣，該DNA片段與用EcoRⅠ和XhoⅠ消化的質(zhì)粒載體pHS397(Takara Shuzo Co.,Ltd.制造)連接并克隆。得到的質(zhì)粒DNA用來確定DNA片段的核苷酸序列。用Sanger的方法(J,Mol,Biol,143,161(1980)用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing試劑盒(應(yīng)用生物系統(tǒng)制造)確定核苷酸序列。
由于得到的DNA片段不含有完整的開放閱讀框架，用XhoⅠ切割乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA，將它與pHSG397連接，如(3)那樣，得到重組質(zhì)粒，用重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用(1)的方法將從(2)得到的來源于乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869染色體DNA的約3千堿基EcoRⅠ-XhoⅠ切割片段標(biāo)記，得到的探針用來篩選雜交轉(zhuǎn)化體。得到的轉(zhuǎn)化體所攜帶的質(zhì)粒含有一段約6千堿基的DNA片段。含有該DNA片段的基因的限制性圖譜由
圖1給出。用(3)的反應(yīng)組分用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和XhoⅠ消化質(zhì)粒，然后用普通方法瓊脂糖凝膠電泳，用(3)的方法確定雜交片段。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一段約4.4千堿基的片段。用如(3)那樣SalⅠ和XhoⅠ消化的質(zhì)粒載體pHSG397與DNA片段連接并克隆。該質(zhì)粒命名為pHSG-X。用與上述相同的在確定質(zhì)粒中SalⅠ-XhoⅠ切割片段從SalⅠ切割位點(diǎn)到EcoRⅠ切割位點(diǎn)約1.4千堿基的DNA片段的核苷酸序列。
得到的SalⅠ-XhoⅠ切割基因片段的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO:1給出。估計(jì)有開放閱讀框架，由該核苷酸序列得到的一種產(chǎn)品的氨基酸序列由序列表中SEQ ID NOS:1和2給出。即，編碼含有序列表中SEQ ID NO:1給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因是乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869的α-KGDH基因。蛋白質(zhì)N末端的蛋氨酸來源于作為起始密碼子的ATG，因此它與蛋白質(zhì)原來的功能常無(wú)關(guān)。眾所周知翻譯后該蛋氨酸殘基被肽酶作用去除。相應(yīng)地，上述蛋白質(zhì)也可能以蛋氨酸殘基去除形式出現(xiàn)。
該核苷酸序列和氨基酸序列就同源性分別與已知序列比較。所用數(shù)據(jù)庫(kù)為EMBL和SWISS-PROT。結(jié)果表明序列表SEQ ID NO:1給出的DNA及其編碼的蛋白質(zhì)是棒狀桿菌中的新基因和新蛋白質(zhì)。與已報(bào)導(dǎo)的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的E1亞基基因及其編碼蛋白質(zhì)有同源性。
本發(fā)明的基因編碼的蛋白質(zhì)有1,257個(gè)氨基酸N-末端有蛋氨酸殘基，與已報(bào)導(dǎo)的α-KGDH特征明顯不同。也就是說，C末端的約900個(gè)氨基酸與各種E1亞基有高度同源性。然而，N末端的300個(gè)氨基酸不見于其它種的α-KGDH，這表明本發(fā)明的蛋白質(zhì)有特殊的功能。將N-末端300個(gè)氨基酸的部分與已知序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該部分與大腸桿菌和固氮菌屬細(xì)菌的E2亞基有同源性。這說明有可能本發(fā)明的蛋白質(zhì)與其它種的α-KGDH不同，兼具E1和E2的活性。
另外，與見于大腸桿菌的普通啟動(dòng)子序列相似的序列(281-286和307-312)以及與棒狀桿菌核糖體結(jié)合序列相似的序列(422-428)在本發(fā)明的基因的開放閱讀框架上游找到。與轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)相似的基環(huán)結(jié)構(gòu)(4243-4281)在本發(fā)明的基因的開放閱讀框架下游找到。這些序列表明本發(fā)明的基因獨(dú)立地轉(zhuǎn)錄和翻譯并具有與其它種α-KGDH不同的遺傳結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2通過來源于乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869的α-KGDH基因的表達(dá)增加α-KGDH活性(1)將α-KGDH基因?qū)肴樗岚l(fā)酵短桿菌ATCC13869和AJ11060實(shí)施例(1)得到的pHSGS-X質(zhì)粒DNA(1μg)和限制性內(nèi)切酶SalⅠ和XhoⅠ(各20單位)混合于實(shí)施例(1)中(3)的緩沖液，37℃反應(yīng)3小時(shí)。另一方面，在短桿菌屬細(xì)菌中自主轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒pPK4(參考日本公開專利5-7491號(hào))DNA(1μg)和SalⅠ(20單位)混合于實(shí)施例1中(3)的緩沖液中，37℃反應(yīng)3小時(shí)。用普通方法對(duì)兩種反應(yīng)溶液進(jìn)行酚抽提與乙醇沉淀。然后，為防止來源于質(zhì)粒載體的DNA片段重新連接，用實(shí)施例1(3)的方法用細(xì)菌堿性磷酸酶處理將DNA片段去磷酸化，接著用普通方法酚抽提和乙醇沉淀。SalⅠ消化的pPK4(0.1μg)，由上述得到的SalⅠ-和XhoⅠ消化的pHSGS-X pHSGS-X質(zhì)粒DNA(0.5μg)和T4 DNA連接酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.制造)混合于實(shí)施例1(3)的緩沖液中，16℃反應(yīng)8小時(shí)以連接DNA。接下來，用普通轉(zhuǎn)化方法用電脈沖法(日本公開專利2-207791號(hào))將DNA混合物導(dǎo)入乳酸發(fā)酵短桿菌AJ11060(日本專利出版物59-10797號(hào))。得到的溶液鋪到含有1％多聚蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％氯化鈉，0.5％葡萄糖和25μg/ml卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基上得到轉(zhuǎn)化體AJ11060/pPKS-X。該轉(zhuǎn)化體命名為乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12999，于1994年6月3日貯存于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken305，日本)，貯存號(hào)FERMP-14349，并根據(jù)布達(dá)佩斯條約(協(xié)定)于1995年6月2日從原貯存處轉(zhuǎn)到國(guó)際貯存處，貯存號(hào)FERM BP-5123。
依據(jù)實(shí)施例1(4)從得到的轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒DNA，用普通方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。于是選擇到來源于乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869的SalⅠ和XhoⅠ片段與質(zhì)粒pPK4連接的重組DNA。得到的質(zhì)粒命名為pPKS-X。
用乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869用同樣方法得到轉(zhuǎn)化體ATCC13869/pPKS-X。(2)帶有擴(kuò)增α-KGDH基因的菌株的酶活性(1)中得到的乳酸發(fā)酵短桿菌AJ11060/pPKS-X和ATCC13869/pPKS-X接種到50ml含有8％葡萄糖，0.1％磷酸二氫鉀，0.004％硫酸鎂，3％硫酸銨，0.001％硫酸亞鐵，0.001％硫酸錳，0.05％大豆水解物溶液，200μg/l維生素B1,300μg/l生物素，5％碳酸鈣和25mg/l卡那霉素的培養(yǎng)基(pH8.0)，31.5℃培養(yǎng)18小時(shí)。用普通方法離心培養(yǎng)液，收集細(xì)胞沉淀物。
將細(xì)胞沉淀物懸浮于0.2％氯化鉀溶液，離心，重復(fù)操作兩次清洗細(xì)胞沉淀物。細(xì)胞沉淀物用含有30％甘油的N-Tris(羥甲基)甲基-2-氨基乙?；撬?以后稱為TES)的0.1M緩沖液(pH7.7)，超聲處理，然后15,000vpm離心30分鐘得到上清。該細(xì)胞裂解物進(jìn)行SephadexE-15(Pharmara制造)柱層析，去除低分子量物質(zhì)，制備粗酶溶液。
得到的粗酶溶液的α-KGDH活性利用Aqric.Biol.Chem.,44,1987(1980)描述的反應(yīng)溶液組分根據(jù)365nm 3-乙酰嘌呤腺嘌呤二核苷酸吸收增加來測(cè)量。使用Bio-Rad制造的試劑盒以牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量粗酶溶液的蛋白質(zhì)濃度，并計(jì)算酶的比活。作為對(duì)照，用同樣方法確定用質(zhì)粒pPK4轉(zhuǎn)化得到的AJ11060/pPK4和ATCC13869/pPK4的比活。結(jié)果由表一給出。AJ11060/pPKS-X和ATCC13869/pPKS-X的比活分別是AJ11060/pPK4和ATCC13869/pPK4的比活的兩倍或更多。結(jié)果證明得到的基因片段編碼具有α-KGDH活性的酶。
表1細(xì)菌菌株α-KGDH比活(Δ吸收/分鐘/mg蛋白)AJ11060/pPK40.029AJ11060/pPKS-X 0.055ATCC13869/pPK4 0.019ATCC13689/pPKS-X0.060
粗酶溶液的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果觀察到約135千道爾頓的帶的擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于所得基因預(yù)計(jì)的分子量為139千道爾頓的酶。這表明所得基因確實(shí)在轉(zhuǎn)化菌株內(nèi)表達(dá)。
參考例1:α-KGDH活性與L-谷氨酸生產(chǎn)能力的關(guān)系乳酸發(fā)酵短桿菌AJ11060/pPK4和AJ11060pPKS-X培養(yǎng)于產(chǎn)L-谷氨酸培養(yǎng)基，測(cè)量生產(chǎn)并積累于培養(yǎng)液中的L-谷氨酸。如下用加入表面活性劑的方法進(jìn)行培養(yǎng)。
含有8％葡萄糖，0.1％磷酸二氫鉀，0.004％硫酸鎂，3％硫酸銨，1.5％大豆水解物溶液，200μg/l鹽酸硫胺素，300μg/l生物素，25mg/l卡那霉素和5％CaCO3(分別滅菌)的生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH8.0,20ml)配好后倒入容積500ml的坂口燒瓶，加熱滅菌。先前由分別培養(yǎng)于含有1％多聚蛋白胨(日本制藥公司制造)1％細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物(Difco制造)，0.5％氯化鈉，0.5％葡萄糖和25mg/l卡那霉素的平板培養(yǎng)基(pH7.2)的AJ11060/pPK4和AJ11060/pPKS-X得到的細(xì)菌細(xì)胞接種到該培養(yǎng)基中，31.5℃振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，得到種培養(yǎng)物。
得到的種培養(yǎng)物按5％量接種到加了3g/l表面活性劑(Tween40:Sigma制造)的生產(chǎn)培養(yǎng)基和不加表面活性劑的生產(chǎn)培養(yǎng)基，用同樣方法31.5℃培養(yǎng)20小時(shí)。
培養(yǎng)完畢，用旭化成公司制造的Biotech Analyaer As-210測(cè)量培養(yǎng)液中積累的L-谷氨酸的量及剩余的葡萄糖濃度。將培養(yǎng)物用0.02N鹽酸稀釋至51倍得到的溶液測(cè)620nm吸收，確定細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)量。結(jié)果由表2給出。
表2菌株 表面生長(zhǎng)量 殘留的糖 積累量 產(chǎn)率活性劑(OD)(g/dl) (g/dl) (％)AJ11060/pPK4- 1.72 0.45 0 0+ 0.78 1.80 2.4642.4AJ11060/pPKS-X - 1.31 1.89 0 0+ 0.78 3.69 0.379.4
在未加表面活性劑的培養(yǎng)基中任何細(xì)菌菌株均未發(fā)現(xiàn)有L-谷氨酸的生產(chǎn)。只有當(dāng)加入表面活性劑后培養(yǎng)液中才生產(chǎn)并積累L-谷氨酸。本實(shí)驗(yàn)中，在導(dǎo)入了含有α-KGDH基因的pPKS-X質(zhì)粒的菌株中，比作為對(duì)照的導(dǎo)入pPK4的菌株L-谷氨酸產(chǎn)率顯著降低。該事實(shí)表明加入表面活性劑后α-KGDH活性水平強(qiáng)烈影響L-谷氨酸的生產(chǎn)。
參考例2用添加青霉素法比較L-谷氨酸生產(chǎn)能力用添加青霉素法研究α-KGDH基因擴(kuò)增對(duì)L-谷氨酸生產(chǎn)的效應(yīng)。
用與參考實(shí)施例1相同的方法制備種培養(yǎng)物，種培養(yǎng)物分別接種到加了0.4單位/ml青霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基和不加青霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基，使細(xì)胞片狀沉淀物干重約為2％,31.5℃振蕩培養(yǎng)25小時(shí)。
培養(yǎng)完畢，用跟參考實(shí)施例相同的方法測(cè)量培養(yǎng)液中積累的L-谷氨酸的量及殘留葡萄糖濃度。結(jié)果由表3給出。結(jié)果顯示加入青霉素后α-KGDH活性水平強(qiáng)烈影響L-谷氨酸的生產(chǎn)。
表3菌株 青霉素 生長(zhǎng)量 殘留的糖 積累量 產(chǎn)率(OD)(g/dl) (g/dl) (％)AJ11060/pPK4- 1.84 0.0 0 0+ 0.72 0.0 3.9049.2AJ11060/pPKS-X - 1.87 0.0 0 0+ 1.07 0.0 2.3930.1實(shí)施例3α-KGDH基因缺陷菌株的制備根據(jù)L-谷氨酸的生產(chǎn)被α-KGDH基因擴(kuò)增抑制這一事實(shí)，預(yù)期相反地，破壞α-KGDH基因應(yīng)能提高L-谷氨酸產(chǎn)率。利用日本公開專利5-7491號(hào)描述的溫度敏感型質(zhì)粒用同源重組方法得到基因破壞的菌株。特別地，該α-KGDH基因含有兩個(gè)被KpnⅠ在序列表中SEQ IDNO:1的第1340和3266位消化的位點(diǎn)。實(shí)施例(1)得到的pHSGS-X用KpnⅠ部分消化，然后自連接制備缺陷1926個(gè)堿基對(duì)的KpnⅠ片段的質(zhì)粒pHSGS-XΔK。pHSGS-X△K的α-KGDH基因結(jié)構(gòu)上缺少中間部分。下一步，將一種得自在棒狀桿菌中自主復(fù)制并具有溫度敏感型自主復(fù)制能力的質(zhì)粒的突變型復(fù)制原點(diǎn)導(dǎo)入pHSGS-XΔK的BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn)制備質(zhì)粒pBTS-XΔK。特別的，一種得自在棒狀桿菌中自主復(fù)制并具有溫度生敏感型自主復(fù)制能力的質(zhì)粒的質(zhì)粒pHSC4(日本公開專利5-7491號(hào))。用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ消化。用DNA平末端形成試劑盒(酒寶造公司制造，Blunting試劑盒)得到平末端，然后與BamHⅠ銜接物連接(酒寶造公司制造)。自連接得到一質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ消化制備含有具有溫度敏感型自主復(fù)制能力的突變型復(fù)制原點(diǎn)的基因片段。該基因片段導(dǎo)入pHSGS-XΔK的BamHⅠ位點(diǎn)制備質(zhì)粒pBTS-XΔK。
用電脈沖法(日本公開專利2-207791號(hào))將該質(zhì)粒導(dǎo)入作為產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌的野生菌株的乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869，用日本公開專利5-7491號(hào)描述的方法將染色體上α-KGDH基因由缺陷型替代。特別地，導(dǎo)入了質(zhì)粒的ATCC13869/pBTS-XΔK 25℃在CM2G液體培養(yǎng)基(1％多聚蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl,0.5％葡萄糖，pH7.2)中振蕩培養(yǎng)6小時(shí)，然后鋪到含有5μg/ml氯霉素的CM2G瓊脂培養(yǎng)基上，34℃培養(yǎng)形成菌落，得到質(zhì)粒導(dǎo)入的菌株。用復(fù)制板法從眾菌株中得到34℃對(duì)氯霉素敏感的菌株。用敏感型菌株研究染色體上α-KGDH基因的核苷酸序列，說明α-KGDH基因已替換成缺陷型。該菌株命名為ΔS菌株。用實(shí)施例2描述的方法測(cè)量ΔS菌株的α-KGDH活性未檢測(cè)到任何活性。
實(shí)施例4制備用于擴(kuò)增gdh,gltA和icd基因的質(zhì)粒(1)gdh,gltA和icd基因的克隆用PCR方法克隆乳酸發(fā)酵短桿菌的gdh,gltA和icd基因。在已報(bào)導(dǎo)的谷氨酸棒狀桿菌的gdh基因)分子微生物學(xué)，6(3),317-326(1992)),gltA基因(微生物學(xué)，140,1817-1828(1994))。和icd基因(J.Batteriol.,177,774-782(1995))的序列的基礎(chǔ)上合成用于PCR方法的引物。序列表中SEQ ID NOS:5(5′段)和6(3′段)給出的寡聚核苷酸用作擴(kuò)增gdh基因的引物，SEQ ID NOS:7(5′段)和8(3′段)給出的寡聚核苷酸用作擴(kuò)增gltA基因的引物，SEQ ID NOS:9(5′段)和10(3′段)給出的寡聚核苷酸用作擴(kuò)增icd基因的引物，上述引物分別合成并應(yīng)用。
用實(shí)施例1的方法從乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869制備染色體DNA，用作模板用前述寡聚核苷酸作引物進(jìn)行PCR。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物用商業(yè)上可購(gòu)得的DNA平末端形成試劑盒(酒寶造公司制造，Blunting試劑盒)在兩端得到平末端，然后克隆到載體質(zhì)粒pHSG399(酒寶造公司制造)的SamⅠ位點(diǎn)，分另得到質(zhì)粒pHSG-gdh,pHSG-gltA，和pHSG-icd。(2)ppc基因的克隆與表達(dá)用實(shí)施例1的方法制備乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA，用作模板利用PCR方法得到含有編碼PEPC的ppc基因的約3.4Kbp的DNA片段。在已報(bào)導(dǎo)的谷氨酸棒狀桿菌的ppc基因序列的基礎(chǔ)上(基因，77,237-251(1989)合成用于PCR方法的引物，與上述相同程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列由SEQ ID NOS:11(5′段)和12(3′段)給出。
PCR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶SalⅠ(酒寶造公司制造)消化，再插入質(zhì)粒pHSG 399的SalⅠ位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pHSG-ppc′。pHSG-ppc′的PEPC基因插入方法與pHSG399的lac啟動(dòng)子方向相反。
下一步，將一種能在乳酸發(fā)酵短桿菌中起作用的色氨酸操縱子的啟動(dòng)子(基因，53,191-200(1987)插入pHSG-ppc′上ppc基因的上游位置。已知該啟動(dòng)子具有序列表中SEQ ID NO:13給出的含有51個(gè)核苷酸的序列，并表現(xiàn)活性。合成具有SEQ ID NO:13給出的序列的核苷酸鏈和具有SEQ ID NO:14序列的核苷酸鏈作為其互補(bǔ)鏈，得到具有啟動(dòng)子活性并且其兩端對(duì)應(yīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ的切割片段的含有51個(gè)堿基對(duì)的雙鏈DNA。
兩條合成DNA混合濃度各為10pmol/μg,100℃加熱10分鐘，靜置室溫冷卻退火。pHSG-ppc′用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ(酒寶造公司制造)消化，與上述啟動(dòng)子連接。用酒寶造公司制造的連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)。于是得到質(zhì)粒pHSG-ppc，其中一拷貝的色氨酸操縱子啟動(dòng)子插入到ppc基因的上游位置。(3)通過連接三種基因gdh,gltA和icd構(gòu)建的質(zhì)粒的制備連接三種基因gdh,gltA和icd制備一質(zhì)粒。特別的，質(zhì)粒pHSG-gdh用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ消化，購(gòu)得的DNA平末端形成試劑盒(酒寶造公司制造，Blunting試劑盒)得到平末端，然后與上述兩端平末端化的gltA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接得到質(zhì)粒pHSG-gdh+gltA。接下來，質(zhì)粒pHSG-gdh+gltA用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ消化。用同樣方法得到平末端，與上述兩端平末端化的icd基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接得到質(zhì)粒pHSG-gdh+gltA+icd。(4)通過連接三種基因gdh,gltA和ppc構(gòu)建的質(zhì)粒的制備連接三種基因gdh,gltA和ppc制備一質(zhì)粒。特別的，質(zhì)粒pHSG-gdh+gltA用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ消化。質(zhì)粒pHSG-ppc用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ消化得到在上游位置具有色氨酸操縱子啟動(dòng)子的ppc基因片段。得到的片段用DNA平末端形成試劑盒(酒寶造公司制造，Blunting試劑盒)得到平末端，然后用KpnⅠ銜接物(酒寶造公司制造)將其插入質(zhì)粒pHSG-ghd+gltA的KpnⅠ位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pHSG-gdh+gltA+ppc。(5)將棒狀桿菌的復(fù)制原點(diǎn)導(dǎo)入上述質(zhì)粒為使pHSG-gdh,pHSG-gltA,pHSG-ppc,pHSG-icd,pHSG-gdh+gltA+icd和pHSG-gdh+gltA+ppc在棒狀桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制，將已得到的來源于在棒狀桿菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒pHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984)的復(fù)制起點(diǎn)(日本公開專利5-7491號(hào))導(dǎo)入pHSG-gdh,pHSG-gltA,pHSG-ppc,pHSG-icd,pHSG-gdd+gltA+icd和pHSG-gdh+gltA+ppc。特別的具有來源于pHM1519的復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒pHK4(日本公開專利5-7491號(hào))用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和KpnⅠ消化，得到含有復(fù)制起點(diǎn)的基因片段。得到的片段用DNA平末端形成試劑盒(酒寶造公司制造，Blunting試劑盒)得到平末端，然后用KpnⅠ銜接物(酒寶造公司制造)分別插入pHSG-gdh,pHSG-gltA,pHSG-ppc和pHSG-icd的KpnⅠ位點(diǎn)，得到pGDH,pGLTA,pPPC和pICD。接下來，相似地用SalⅠ銜接物(酒寶造公司制造)將來源于pHM1519的復(fù)制起點(diǎn)分別插入到pHSG-gdh+gltA+icd和pHSG-gdh+gltA+ppc的SalⅠ位點(diǎn)，得到pGDH+GLTA+ICD和pGDH+GLTA+ppc。另外，相似地用SalⅠ銜接物(酒寶造公司制造)將來源于pHM1519的復(fù)制起點(diǎn)插入不含這些基因的質(zhì)粒pHSG399的SalⅠ位點(diǎn)，制備pSAC4作為對(duì)照。
實(shí)施例7pGDH,pGLTA,pPPC,pICDpGDH+GLTA+ICD和pGDH+GLTA+PPC各基因的表達(dá)的確證pGDH,pGLTA,pPPC,pICD,pGDH+GLTA+ICD和pGDH+GLTA+PPC上各基因在乳酸發(fā)酵短桿菌細(xì)胞中是否表達(dá)，以及這些質(zhì)粒是否進(jìn)行基因擴(kuò)增得到確證。特別地用電脈沖法(日本公開專利2-207791號(hào))將各質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC13869。得到的轉(zhuǎn)化體用1升純水中含有10g多聚蛋白胨，10g酵母提取物，5g葡萄糖，5g NaCl和15g瓊脂(pH7.2)以及4μg/ml氯霉素的CM2G平板培養(yǎng)基進(jìn)行選擇。得到的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)于CM2G瓊脂培養(yǎng)基，然后接種到1升純水含有80g葡萄糖，1g KH2PO4,0.4g MgSO4、30g (NH4)2SO4,0.01g FeSO4·7H2O,0.01g MnSO4·7H2O,15ml大豆水解物溶液，200μg鹽酸硫胺素，300μg生物素和50g CaCO3的培養(yǎng)基(用KOH調(diào)pH至8.0)中，31.5℃培養(yǎng)16小時(shí)。用普通方法離心培養(yǎng)液，收集細(xì)菌細(xì)胞。
磨碎細(xì)菌細(xì)胞得到粗提取物，用來利用分子微生物學(xué)，6(3),317-326(1992)中描述的方法測(cè)量ATCC13869/pGDH,ATCC13869/GDH+GLTA+ICD和ATCC13869/pGDH+GLTA+ppc的GDH活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)化體的每一種與ATCC13869/pSAC4對(duì)照相比有13倍的GDH活性(表4)。用微生物學(xué)，140,1817-1828(1994)的方法測(cè)量ATCC13869/pGLTA,ATCC13869/pGDH+GLTA+ICD，和ATCC13869/pGDH+GLTA+ppc的CS活性。用J.Bacteriol,177,774-782(1995)的方法測(cè)量ATCC13869/pICD和ATCC13869/GDH+GLTA+ICD的ICDH活性。用基因，77,237-251(1989)的方法測(cè)量ATCC13869/pPPC和ATCC13869/pGDH+GLTA+ppc的PEPC活性。測(cè)量結(jié)果由表5-7給出。發(fā)現(xiàn)任何轉(zhuǎn)化體與ATCC13869/pSAC4對(duì)照相比均有2到20倍的目的酶活性。該事實(shí)證明pGDH,pGLTA,pPPC,pICD,pGDH+GLTA+ICD和pGDH+GLTA+PPC的各基因在乳酸發(fā)酵短桿菌中表達(dá)并執(zhí)行功能。
表4細(xì)菌菌株 GDH活性(ΔAbs/min/mg蛋白)ATCC13869/pGDH 1.36ATCC13869/pGDH+GLTA+ICD1.28ATCC13869/pGDH+GLTA+PPC1.33ATCC13869/pSAC40.11
表5細(xì)菌菌株 CS活性(μmole/min/mg蛋白)ATCC13869/pGLTA 5.5ATCC13869/pGDH+GLTA+ICD 4.8ATCC13869/pGDH+GLTA+PPC 4.8ATCC13869/pSAC4 0.7表6細(xì)菌菌株 PEPC活性(units/min/mg蛋白)ATCC13869/pPPC 1.12ATCC13869/pGDH+GLTA+PPC1.04ATCC13869/pSAC40.11表7細(xì)菌菌株 ICDH活性(units/min/mg蛋白)ATCC13869/pICD 3.5ATCC13869/pGDH+GLTA+ICD2.8ATCC13869/pSAC41.0實(shí)施例8ΔS菌株的L谷氨酸生產(chǎn)，以及具有擴(kuò)增的gdh,gltA,ppc和icd基因的ΔS菌株(1)發(fā)酵罐中ΔS菌株L-谷氨酸生產(chǎn)的評(píng)價(jià)在1升純水中含有60g葡萄糖，1g KH2SO4,0.4 MgSO4,30g(NH4)2SO4,0.01g FeSO4·7H2O,0.01g MnSO4·7H2O,15ml大豆水解物溶液，200μg鹽酸硫胺素和450μg生物素的培養(yǎng)基(300ml)加入1升容積的發(fā)酵罐，加熱滅菌。在CM2G瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到的ΔS菌株的細(xì)菌細(xì)胞接種于其中，31.5℃培養(yǎng)30小時(shí)，用氨氣調(diào)整pH至7.0，7.2或7.5。
培養(yǎng)完畢，測(cè)量培養(yǎng)基中細(xì)菌細(xì)胞濃度和積累的L-谷氨酸的量。用旭化成公司制造的Biotech Analyzer AS-210定量確定L-谷氨酸。將培養(yǎng)液用純水稀釋至51倍，用660nm處吸收(OD660)測(cè)量細(xì)菌細(xì)胞濃度。結(jié)果由表8給出。
表8pH 細(xì)菌細(xì)胞濃度L-谷氨酸(OD) (g/l)7.00.84357.20.85347.51.0732已確證盡管ΔS菌株培養(yǎng)于含過量生物素的培養(yǎng)基中，仍能高產(chǎn)率地生產(chǎn)并積累L-谷氨酸。(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)的ΔS菌株以及帶有擴(kuò)增的gdh,gltA,ppc和icd基因的ΔS菌株L-谷氨酸生產(chǎn)的評(píng)價(jià)將上述制備的pGDH,pGLTA,pPPC,pICD,pGDH+GLTA+ICD或pGDH+GLTA+PPC導(dǎo)入ΔS菌株以評(píng)價(jià)導(dǎo)入各質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體的L-谷氨酸生產(chǎn)能力，用電脈沖法(日本公開專利2-207791號(hào))將質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸發(fā)酵短桿菌的細(xì)胞中。用1升純水中含有10g多聚蛋白胨，10g酵母提取物，5g葡萄糖，5g NaCl和15g瓊脂及含有4μg/ml氯霉素的CM2G平板培養(yǎng)基(pH7.2)選擇得到的轉(zhuǎn)化體。
如上述(1)款那樣評(píng)價(jià)ΔS菌株及得到的轉(zhuǎn)化體的L-谷氨酸生產(chǎn)能力。
用與上述相同的方法測(cè)量培養(yǎng)后培養(yǎng)基中細(xì)菌細(xì)胞濃度和積累的L-谷氨酸的量。結(jié)果由表9給出。
表9菌株 細(xì)胞濃度 L-谷氨酸(OD) (g/l)ΔS 0.84 35ΔS/pGDH 1.01 35ΔS/pGLTA0.83 37ΔS/pICD 0.83 37ΔS/pPPC 0.75 37ΔS/pGDH+GLTA+ICD0.95 38ΔS/pGDH+GLTA+PPC0.85 40ΔS/pSAC40.83 35實(shí)施例9具有擴(kuò)增α-KGDH基因的產(chǎn)L-賴氨酸細(xì)菌的L-賴氨酸生產(chǎn)上述制備的pPKS-X和pPK4分別導(dǎo)入乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12435(FERM BP-2294)，該菌對(duì)S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸表現(xiàn)抗性并具有通過誘變?nèi)樗岚l(fā)酵短桿菌ATCC13869得到的L-賴氨酸生產(chǎn)能力。評(píng)價(jià)其L-賴氨酸生產(chǎn)能力，用電脈沖法(日本公開專利2-207791號(hào))導(dǎo)入質(zhì)粒。用在1升純水中含有10g多聚蛋白胨，10g酵母提取物，5g葡萄糖，5g NaCl和15g瓊脂并含有25μg/ml卡那霉素的CM2G平板培養(yǎng)基(pH7.2)選擇轉(zhuǎn)化體。
如下評(píng)價(jià)L-賴氨酸生產(chǎn)能力。一種在1升純水中含有100g葡萄糖，1g KH2PO4,0.4g MgSO4,30g (NH4)2SO4,0.01g FeSO4·7H2O,0.01g MnSO4·7H2O,15ml大豆水解物溶液，200μg鹽酸硫胺素，300μg生物素，25mg卡那霉素和50g CaCO3(用KOH調(diào)pH至7.0)的培養(yǎng)基(各20ml)配好后倒入500ml容積的燒瓶，加熱滅菌。將在含有4mg/l卡那霉素的CM2G平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到的AJ12435/pPK4和AJ12435/pPKS-X的細(xì)菌細(xì)胞接種于其中，37℃培養(yǎng)20小時(shí)，培養(yǎng)完畢，測(cè)量培養(yǎng)液中生產(chǎn)和積累的L-賴氨酸的量以及細(xì)菌細(xì)胞濃度。結(jié)果由表10給出。
表10菌株L-賴氨酸細(xì)胞濃度(g/l) (OD)AJ 12435/pPK4 261.15AJ 12435/pPKS-X310.92已表明產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌的α-KGDH活性水平影響L-谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)。因而可能通過插入抗藥相關(guān)基因等制備α-KGDH基因活性缺陷菌株，通過體外突變制備活性滲漏菌株，通過修飾啟動(dòng)子制備表達(dá)降低的菌株等有效地培育與常規(guī)產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌相比L-谷氨酸生產(chǎn)能力進(jìn)一步提高的細(xì)菌菌株。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人味之素株式會(huì)社(ⅱ)發(fā)明名稱α-酮戊二酸脫氫酶基因(ⅲ)序列數(shù)目14(ⅳ)通訊地址(A)收信人(B)街道(C)城市(E)國(guó)家(F)郵政編碼(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Fast SEQ1.5版(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)提交日(C)分類(ⅶ)律師/代理人資料(A)名稱(B)注冊(cè)號(hào)(ⅸ)通訊資料(A)電話(B)傳真(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度4394堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義非(ⅵ)來源(A)生物體乳發(fā)酵短桿菌(B)菌株ATCC13869(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置443..4213(C)識(shí)別方法E(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵-35信號(hào)(B)位置281..287(C)識(shí)別方法S(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵-10信號(hào)(B)位置307..312(C)識(shí)別方法S(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵RBS(B)位置421..428(C)識(shí)別方法S(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵終止子(B)位置4243..4281(C)識(shí)別方法S(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GTCGACAAGC AAAATCGAAG CGGCAGCACG CCGCGTCGGA GCCTTAAACG CCATCGCCGC 60CATCCCTGAT GGTTTCAATC ATCAAGTCGG TGAACGCGGG CGCAACCTGT CATCCGGACA120GCGCCAACTG ATCGCGCTGG CGCGCGCCGA ACTCATCGAG CCTTCCATCA TGCTTCTCGA180CGAAGCCACC TCCACCCTCG ACCCCGCCAC CGAAGCCGTT ATCCTCAACG CCTCCGATCG240AGTCACTAAG GGACGCACCA GCATCATCGT CGCGCACCGC TTGGCAACCG CTAAAAGGGC300CGACCGTATT CTTGTTGTTG AACAAGGACG TATCATTGAG GACGGATCTC ACGACGGGTT360GTTGTCTGCT AACGGCACCT ACGCCCGCAT GTGGCATTTA ATGGCCTGAC ACGTTATTTT420TAGGAGAACT GTCAACAAAT TA ATG CTA CAA CTG GGG CTT AGG CAT AAT CAG 472Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln1 5 10CCA ACG ACC AAC GTT ACA GTG GAT AAA ATA AAG CTC AAT AAA CCC TCA 520Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser15 20 25AGA AGC AAG GAA AAG AGG CGA GTA CCT GCC GTG AGC AGC GCT AGT ACT 568Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr30 35 40TTC GGC CAG AAT GCG TGG CTG GTA GAC GAG ATG TTC CAG CAG TTC CAG 616Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln45 50 55AAG GAC CCC AAG TCC GTG GAC AAG GAA TGG AGA GAA CTC TTT GAG GCG 664Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala60 65 70CAG GGG GGA CCA AAT GCT ACC CCC GCT ACA ACA GAA GCA CAG CCT TCA 712Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser75 80 85 90GCG CCC AAG GAG TCT GCG AAA CCA GCA CCA AAG GCT GCC CCT GCA GCC 760Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala95 100 105AAG GCA GCA CCG CGC GTA GAA ACC AAG CCG GCC GCC AAG ACC GCC CCT 808Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro110 115 120AAG GCC AAG GAG TCC TCA GTG CCA CAG CAA CCT AAG CTT CCG GAG CCA 856Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro125 130 135GGA CAA ACC CCA ATC AGG GGT ATT TTC AAG TCC ATC GCG AAG AAC ATG 904Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met140 145 150GAT ATC TCC CTG GAA ATC CCA ACC GCA ACC TCG GTT GCG GAT ATG CCA 952Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro155 160 165 170GCT CGC CTC ATG TTC GAA AAC CGC GCG ATG GTC AAC GAT CAG CTC AAG1000Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys175 180 185CGC ACC CGC GGT GGC AAG ATC TCC TTC ACC CAC ATC ATT GGC TAC GCC1048Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala190 195 200ATG GTG AAG GCA GTC ATG GCT CAC CCG GAC ATG AAC AAC TCC TAC GAC1096Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp205 210 215GTC ATC GAC GGC AAG CCA ACC CTG ATC GTG CCT GAG CAC ATC AAC CTG 1144Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu220 225 230GGC CTT GCC ATC GAC CTT CCT CAG AAG GAC GGC TCC CGC GCA CTT GTC 1192Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val235 240 245 250GTA GCA GCC ATC AAG GAA ACC GAG AAG ATG AAC TTC TCC GAG TTC CTC 1240Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu255 260 265GCA GCA TAC GAA GAC ATC GTG ACA CGC TCC CGC AAG GGC AAG CTC ACC 1288Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr270 275 280ATG GAT GAC TAC CAG GGC GTT ACC GTT TCC TTG ACC AAC CCA GGT GGC1336Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly285 290 295ATC GGT ACC CGC CAC TCT GTC CCA CGT CTG ACC AAG GGC CAG GGC ACC1384Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr300 305 310ATC ATC GGT GTC GGT TCC ATG GAT TAC CCA GCA GAG TTC CAG GGC GCT1432Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala315 320 325 330TCC GAA GAC CGC CTT GCA GAG CTC GGC GTT GGA AAG CTT GTC ACC ATC1480Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile335 340 345ACC TCC ACC TAC GAT CAC CGC GTG ATC CAG GGT GCT GTG TCC GGT GAA1528Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu350 355 360TTC CTG CGT ACC ATG TCT CGC CTG CTC ACC GAT GAT TCC TTC TGG GAT1576Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp365 370 375GAG ATC TTC GAC GCA ATG AAC GTT CCT TAC ACC CCA ATG CGT TGG GCA1624Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala380 385 390CAG GAC GTT CCA AAC ACC GGT GTT GAT AAG AAC ACC CGC GTC ATG CAG1672Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln395 400 405 410CTC ATT GAG GCA TAC CGC TCC CGT GGA CAC CTC ATC GCT GAC ACC AAC1720Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn415 420 425CCA CTT TCA TGG GTT CAG CCT GGC ATG CCA GTT CCA GAC CAC CGC GAC1768Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp430 435 440CTC GAC ATC GAG ACC CAC AGC CTG ACC ATC TGG GAT CTG GAC CGT ACC 1816Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr445 450 455TTC AGC GTC GGT GGC TTC GGC GGC AAG GAG ACC ATG ACC CTG CGC GAG 1864Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu460 465 470GTA CTG TCC CGC CTG CGC GCT GCC TAC ACC TTG AAG GTC GGC TCC GAA 1912Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu475 480 485 490TAC ACC CAC ATC CTG GAC CGC GAC GAG CGC ACC TGG CTG CAG GAC CGC 1960Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg495 500 505CTC GAA GCC GGA ATG CCA AAG CCA ACC CAG GCA GAG CAG AAG TAC ATC 2008Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile510 515 520CTG CAG AAG CTG AAC GCC GCA GAG GCT TTC GAG AAC TTC CTG CAG ACC 2056Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr525 530 525AAG TAC GTC GGC CAG AAG CGC TTC TCC CTC GAA GGT GCA GAA GCT CTC 2104Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu540 545 550ATC CCA CTG ATG GAC TCC GCC ATC GAC ACC GCC GCA GGC CAG GGC CTC 2152Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu555 560 565 570GAC GAA GTT GTC ATC GGT ATG CCA CAC CGT GGT CGC CTC AAC GTG CTG 2200Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu575 580 585TTC AAC ATC GTG GGC AAG CCA CTG GCA TCC ATC TTC AAC GAG TTT GAA 2248Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu590 595 600GGC CAA ATG GAG CAG GGC CAG ATC GGT GGC TCC GGT GAC GTG AAG TAC2296Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr605 610 615CAC CTC GGT TCC GAA GGC CAG CAC CTG CAG ATG TTC GGC GAC GGC GAG2344His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu620 625 630ATC AAG GTC TCC CTG ACT GCT AAC CCG TCC CAC CTG GAA GCT GTT AAC2392Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn635 640 645 650CCA GTG ATG GAA GGT ATC GTC CGC GCA AAG CAG GAC TAC CTG GAC AAG2440Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys655 660 665GGC GTA GAC GGC AAG ACT GTT GTG CCA CTG CTG CTC CAC GGT GAC GCT2488Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala670 675 680GCA TTC GCA GGC CTG GGC ATC GTG CCA GAA ACC ATC AAC CTG GCT AAG2536Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys685 690 695CTG CGT GGC TAC GAC GTC GGA GGC ACC ATC CAC ATC GTG GTG AAC AAC2584Leu Arg Gly Tyr Asp Val Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn700 705 710CAG ATC GGC TTC ACC ACC ACC CCA GAC TCC AGC CGC TCC ATG CAC TAC2632Gln Ile Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr715 720 725 730GCA ACC GAC TAC GCC AAG GCA TTC GGC TGC CCA GTC TTC CAC GTC AAT2680Ala Thr Asp Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn735 740 745GGT GAT GAC CCA GAG GCA GTT GTC TGG GTT GGC CAG CTG GCA ACC GAG2728Gly Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu750 755 760TAC CGT CGT CGC TTC GGC AAG GAC GTC TTC ATC GAC CTC GTT TGC TAC2776Tyr Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr765 770 775CGC CTC CGC GGC CAC AAC GAA GCT GAT GAT CCT TCC ATG ACC CAG CCA2824Arg Leu Arg Gly His Asn Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro780 785 790AAG ATG TAT GAG CTC ATC ACC GGC CGC GAG ACC GTT CGT GCT CAG TAC2872Lys Met Tyr Glu Leu Ile Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr795 800 805 810ACC GAA GAC CTG CTC GGA CGT GGA GAC CTC TCC AAC GAA GAT GCA GAA2920Thr Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu815 820 825GCA GTC GTC CGC GAC TTC CAC GAC CAG ATG GAA TCT GTG TTC AAC GAA2968Ala Val Val Arg Asp Phe His Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu830 835 840GTC AAG GAA GGC GGC AAG AAG CAG GCT GAG GCA CAG ACC GGC ATC ACC 3016Val Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr845 850 855GGC TCC CAG AAG CTT CCA CAC GGC CTT GAG ACC AAC ATC TCC CGT GAA 3064Gly Ser Gln Lys Leu Pro His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu860 865 870GAG CTC CTG GAA CTG GGA CAG GCT TTC GCC AAC ACC CCA GAA GGC TTC 3112Glu Leu Leu Glu Leu Gly Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe875 880 885 890AAC TAC CAC CCA CGT GTG GCT CCA GTT GCT AAG AAG CGC GTC TCC TCT 3160Asn Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser895 900 905GTC ACC GAA GGT GGC ATC GAC TGG GCA TGG GGC GAG CTC CTC GCC TTC 3208Val Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe910 915 920GGT TCC CTG GCT AAC TCC GGC CGC TTG GTT CGC CTT GCA GGT GAA GAT3256Gly Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp925 930 935TCC CGC CGC GGT ACC TTC ACC CAG CGC CAC GCA GTT GCC ATC GAC CCA3304Ser Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro940 945 950GCG ACC GCT GAA GAG TTC AAC CCA CTC CAC GAG CTT GCA CAG TCC AAG3352Ala Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys955 960 965 970GGC AAC AAC GGT AAG TTC CTG GTC TAC AAC TCC GCA CTG ACC GAG TAC3400Gly Asn Asn Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr975 980 985GCA GGC ATG GGC TTC GAG TAC GGC TAC TCC GTA GGA AAC GAA GAC TCC3448Ala Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser990 995 1000GTC GTT GCA TGG GAA GCA CAG TTC GGC GAC TTC GCC AAC GGC GCT CAG3496Val Val Ala Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln100510101015ACC ATC ATC GAT GAG TAC GTC TCC TCA GGC GAA GCT AAG TGG GGC CAG3544Thr Ile Ile Asp Glu Tyr Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly Gln10201025 1030ACC TCC AAG CTG ATC CTT CTG CTG CCT CAC GGC TAC GAA GGC CAG GGC3592Thr Ser Lys Leu Ile Leu Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly1035104010451050CCA GAC CAC TCT TCC GCA CGT ATC GAG CGC TTC CTG CAG CTG TGC GCT3640Pro Asp His Ser Ser Ala Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln Leu Cys Ala105510601065GAG GGT TCC ATG ACT GTT GCT CAG CCA TCC ACC CCA GCA AAC CAC TTC3688Glu Gly Ser Met Thr Val Ala Gln Pro Ser Thr Pro Ala Asn His Phe107010751080CAC CTG CTG CGT CGT CAC GCT CTG TCC GAC CTG AAG CGT CCA CTG GTT3736His Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Set Asp Leu Lys Arg Pro Leu Val108510901095ATC TTC ACC CCG AAG TCC ATG CTG CGT AAC AAG GCT GCT GCC TCC GCA3784Ile Phe Thr Pro Lys Set Met Leu Arg Asn Lys Ala Ala Ala Set Ala110011051110CCA GAA GAC TTC ACT GAG GTC ACC AAG TTC CAA TCC GTG ATC GtC GAT3832Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys Phe Gln Ser Val Ile Asp Asp1115112011251130CCA AAC GTT GCA GAT GCA GCC AAG GTG AAG AAG GTC ATG CTG GTC TCC3880Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser113511401145GGC AAG CTG TAC TAC GAA TTG GCA AAG CGC AAG GAG AAG GAC GGA CGC3928Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg115011551160GAC GAC ATC GCG ATC GTT CGT ATC GAA ATG CTC CAC CCA ATT CCG TTC3976Asp Asp Ile Ala Ile Val Arg Ile Glu Met Leu His Pro Ile Pro Phe116511701175AAC CGC ATC TCC GAG GCT CTT GCC GGC TAC CCT AAC GCT GAG GAA GTC4024Asn Arg Ile Ser Glu Ala Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val118011851190CTC TTC GTT CAG GAT GAG CCA GCA AAC CAG GGC CCA TGG CCG TTC TAC4072Leu Phe Val Gln Asp Glu Pro Ala Asn Gln Gly Pro Trp Pro Phe Tyr1195120012051210CAG GAG CAC CTC CCA GAG CTG ATC CCG AAC ATG CCA AAG ATG CGC CGC4120Gln Glu His Leu Pro Glu Leu Ile Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg121512201225GTT TCC CGC CGC GCT CAG TCC TCC ACC GCA ACT GGT GTT GCT AAG GTG4168Val Ser Arg Arg Ala Gln Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val123012351240CAC CAG CTG GAG GAG AAG CAG CTT ATC GAC GAG GCT TTC GAG GCT4213His Gln Leu Glu Glu Lys Gln Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala124512501255TAAGTCTTTA TAGTCCTGCA CTAGCCTAGA GGGCCTTATG CAGTGTGAAT CACACAGCAT 4273AAGGCCCTTT TTGCTGCCGT GGTTGCCTAA GGTGGAAGGC ATGAAACGAA TCTGTGCGGT 4333CACGATCTCT TCAGTACTTT TGCTAAGTGG CTGCTCCTCC ACTTCCACCA CGCAGCTCGA 4393G 4394(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1257氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln Pro Thr Thr Asn Val Thr1 5 10 15Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser Arg Ser Lys Glu Lys Arg20 25 30Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp35 40 45Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val50 55 60Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Ala65 70 75 80Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala85 90 95Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val100 105 110Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser
115 120125Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg130 135 140Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile145 150 155 160Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu165 170 175Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys180 185 190Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met195 200 205Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val Ile Asp Gly Lys Pro210 215 220Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu Gly Leu Ala Ile Asp Leu225 230 235 240Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu245 250 255Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile260 265 270Val Thr Arg Ser Arg Lys Gry Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly275 280 285Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly Ile Gly Thr Arg His Ser290 295 300Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser305 310 315 320Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala325 330 335Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Asp His340 345 350Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser
355360 365Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu Ile Phe Asp Ala Met370 375 380Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala Gln Asp Val Pro Asn Thr385 390 395 400Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln Leu Ile Glu Ala Tyr Arg405 410 415Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gln420 425 430Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp Ile Glu Thr His435 440 445Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr Phe Ser Val Gly Gly Phe450 455 460Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu Val Leu Ser Arg Leu Arg465 470 475 480Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu Tyr Thr His Ile Leu Asp485 490 495Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg Leu Glu Ala Gly Met Pro500 505 510Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala515 520 525Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr Lys Tyr Val Gly Gln Lys530 535 540Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu Ile Pro Leu Met Asp Ser545 550 555 560Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly565 570 575Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Ile Val Gly Lys580 585 590Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gln Met Glu Gln Gly
595 600 605Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly610 615 620Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu Ile Lys Val Ser Leu Thr625 630 635 640Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly Ile645 650 655Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr660 665 670Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gly675 680 685Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys Leu Arg Gly Tyr Asp Val690 695 700Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln Ile Gly Phe Thr Thr705 710 715 720Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys725 730 735Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala740 745 750Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly755 760 765Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn770 775 780Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys Met Tyr Glu Leu Ile785 790 795 800Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr Glu Asp Leu Leu Gly805 810 815Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala Val Val Arg Asp Phe820 825 830His Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu Val Lys Glu Gly Gly Lys
835 840 845Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly Ser Gln Lys Leu Pro850 855 860His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly865 870 875 880Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn Tyr His Pro Arg Val885 890 895Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly Ile900 905 910Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser915 920 925Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe930 935 940Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe945 950 955 960Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly Asn Asn Gly Lys Phe965 970 975Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu980 985 990Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asr Glu Asp Ser Val Val Ala Trp Glu Ala995 10001005Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Thr Ile Ile Asp Glu Tyr10101015 1020Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly Gln Thr Ser Lys Leu Ile Leu025 10301035 1040Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Asp His Ser Ser Ala104510501055Arg Ile Glu Arg Phe Leu Glr Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val106010651070Ala Gln Pro Ser Thr Pro Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His
107510801085Ala Leu Ser Asp Leu Lys Arg Pro Leu Val Ile Phe Thr Pro Lys Ser109010951100Met Leu Arg Asn Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu105 11101115 1120Val Thr Lys Phe Gln Ser Val Ile Asp Asp Pro Ast Val Ala Asp Ala112511301135Ala Lys Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu114011451150Leu Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val115511601165Arg Ile Glu Met Leu His Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu Ala117011751180Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln Asp Glu185 11901195 1200Pro Ala Asn Gln Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His Leu Pro Glu120512101215Leu Ile Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser Arg Arg Ala Gln122012251230Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val His Gln Leu Glu Glu Lys123512401245Gln Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala12501255(2)SEQ ID NO:3的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型其它核酸..合成DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義非(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:CTGTCTGAAG GATCGGTTCT 20(2)SEQ ID NO:4的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型其它核酸..合成DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GAGTGCTCAG GCCCCTGTCC CTCGTAACC 29(2)SEQ ID NO:5的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型其它核酸..合成DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義非(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:GCTAGCCTCG GGAGCTCTAG 20(2)SEQ ID NO:6的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型其它核酸..合成DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GATCTTTCCC AGACTCTGGC 20(2)SEQ ID NO:7的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型其它核酸..合成DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義非(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:TAATGCCACC GACACCCACC 20(2)SEQ ID NO:8的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型其它核酸..合成DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:TCAACGCCCA CATAGTGGAC 20(2)SEQ ID NO:9的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型其它核酸..合成DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義非(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:GAATTCGCTC CCGGTGACGC 20(2)SEQ ID NO:10的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型其它核酸..合成DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:GATGCAGAAT TCCTTGTCGG 20(2)SEQ ID NO:11的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型其它核酸..合成DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義非(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:GTCGACGGCG GACTTGTCGG 20(2)SEQ ID NO:12的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型其它核酸..合成DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:GTCGACAAAA CCCAAAAAAA 20(2)SEQ ID NO:13的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度51堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型其它核酸..合成DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義非(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:CTGCGGAAAC TACACAAGAA CCCAAAAATG ATTAATAATT GAGACAAGCT T 51(2)SEQ ID NO:14的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度59堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)漕愋途€型(ⅱ)分子類型其它核酸..合成DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:CTAGAAGCTT GTCTCAATTA TTAATCATTT TTGGGTTCTT GTGTAGTTTC CGCAGGTAC 59
權(quán)利要求
1．一種編碼來源于產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌并具有α-酮戊二酸脫氫酶活性的酶的基因。
2．權(quán)利要求1的基因，其中具有α-酮戊二酸脫氫酶活性的酶的氨基酸序列含有序列表中SEQ ID NO.1給出的氨基酸序列或是含有對(duì)該氨基酸序列的α-酮戊二酸脫氫酶活性無(wú)影響的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或插入的氨基酸序列。
3．一種重組DNA，它是通過將編碼來源于產(chǎn)L-谷氨酸棒狀桿菌的具有α-酮戊二酸脫氫酶活性的酶的基因與在棒狀桿菌中起作用的載體相連接得到的。
4．?dāng)y帶權(quán)利要求3的重組DNA的棒狀桿菌。
5．一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其包括在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶權(quán)利要求3的重組DNA并具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌，在培養(yǎng)液中生產(chǎn)并積累L-賴氨酸，然后收集。
全文摘要
公開內(nèi)容為α－酮戊二酸脫氫酶缺陷的產(chǎn)L－谷氨酸棒狀桿菌,一種用該細(xì)菌生產(chǎn)L－谷氨酸的方法,編碼來源于產(chǎn)L－谷氨酸棒狀桿菌具有α－KGDH活性的酶的基因,含有該基因的重組DNA,攜帶該重組DNA的棒狀桿菌,以及一種用攜帶該重組DNA并具有L－賴氨酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌生產(chǎn)L－賴氨酸的方法。
文檔編號(hào)C12P13/08GK1310234SQ0013097
公開日2001年8月29日 申請(qǐng)日期1995年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月14日
發(fā)明者朝倉(cāng)陽(yáng)子, 臼田佳弘, 辻本信晴, 木村英一郎, 阿部知津, 河原義雄, 中松亙, 倉(cāng)橋修 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社