專(zhuān)利名稱(chēng)：甘露糖的定量測(cè)定方法及其試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用酶學(xué)方法精確和方便地定量測(cè)定甘露糖的方法及定量測(cè)定用試劑。
甘露糖是己糖型的，微量存在于人血。作為供應(yīng)途徑，已知主要通過(guò)葡萄糖代謝系統(tǒng)供應(yīng)甘露糖，而不是通過(guò)食物的攝入。甘露糖的血濃度通常低至約0.5mg/dl。但是，已知在患者罹患糖尿病時(shí)該濃度有高的傾向，這些患者缺乏控制血糖(Clinca.Chimica Acta 251；1996 pp 91-103)或真菌感染(J.Clin.Microbiol.21(6)；1985 pp 972-979)的能力，有人提議甘露糖濃度對(duì)于這些疾病的診斷有用。
測(cè)定甘露糖的方法已知有氣相色譜法(Clin.Chem.25；1979；pp 1384-1387)、液相色譜法(Bulletin of Japan Urology Association，80；1989；pp1816-1823)酶學(xué)方法(Clin.Chem.30(2)；1984 pp 293-294)等。
例如，在酶學(xué)方法中，因?yàn)槿绻麡颖净驑悠分泻衅咸烟莿t難以進(jìn)行精確測(cè)定，所以必須消除葡萄糖。在Soyama等的方法(Clin.Chem.30；1984 pp 293-294)中，先用葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶消除樣本中的葡萄糖。然后，在三磷酸腺苷(下文稱(chēng)作ATP)存在下，將甘露糖與己糖激酶反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為甘露糖-6-磷酸，再與甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，進(jìn)一步與葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為葡糖-6-磷酸，最后，在輔酶氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(下文稱(chēng)作NAD)存在下，與葡糖-6-磷酸脫氫酶反應(yīng)，然后，用分光光度計(jì)測(cè)定所形成的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(下文稱(chēng)作NADH)的吸光度(340nm)以定量測(cè)定甘露糖。
作為上述酶學(xué)方法的改進(jìn)，Pitkanen等報(bào)告了一種定量測(cè)定甘露糖的方法(Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem 35(10)；1997 pp761-766)，其中，在A(yíng)TP和氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文稱(chēng)作NADP)存在下，將己糖激酶和葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶與同時(shí)存在葡萄糖和果糖的樣本反應(yīng)，從而將葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)化為葡糖-6-磷酸；再加入葡糖-6-磷酸脫氫酶將葡糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為葡糖酸內(nèi)酯-6-磷酸；所形成的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文稱(chēng)作NADPH)用鹽酸在酸性條件下降解以消除葡萄糖等的影響；然后以上述同樣的方法，在A(yíng)TP和NADP存在下，將甘露糖與己糖激酶、甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶、葡糖6-磷酸異構(gòu)酶和葡糖-6-磷酸脫氫酶反應(yīng)，測(cè)定所形成的NADPH的吸光度(340nm)。
但是，在上述酶學(xué)方法中，由于需要處理復(fù)雜的酶接合系統(tǒng)，其中各種酶促反應(yīng)結(jié)合在一起，因此難以使所有酶處于最適條件。而且，由于各種昂貴的酶結(jié)合在一起使用，因此在成本方面有問(wèn)題。此外，還有一個(gè)缺點(diǎn)，即這些方法對(duì)來(lái)自生物樣本或雜質(zhì)的成分的影響敏感。
另一方面，在氣相色譜法和液相色譜法中，必須進(jìn)行麻煩的操作，如衍生化或諸如熒光之類(lèi)標(biāo)記，及使用特殊儀器，因此這些方法不適合于處理大量樣本。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供定量測(cè)定甘露糖的方法及定量測(cè)定用試劑。用它們可進(jìn)行大量樣本的精確和方便的處理。
為了完成上述目的，一方面，本發(fā)明提供定量測(cè)定甘露糖的方法，包括在電子接受體存在下將樣本中的甘露糖與能通過(guò)脫氫反應(yīng)氧化甘露糖的酶進(jìn)行反應(yīng)，并定量測(cè)定所形成的電子接受體還原物。
上述方法中，當(dāng)樣本除甘露糖外還含有葡萄糖時(shí)，較佳為在與酶反應(yīng)前用葡萄糖消除劑將樣本中的葡萄糖轉(zhuǎn)化為不與酶反應(yīng)的結(jié)構(gòu)。
上述方法中，酶較佳為屬于酶編號(hào)EC類(lèi)1.1.1.119的葡萄糖脫氫酶，更佳為來(lái)自屬于葡糖桿菌屬的微生物的己醛糖脫氫酶。作為樣本，較佳為選自血液、血清、血漿、腦脊液和尿液的至少一種生物樣本，或從所述生物樣本制得的樣本。
另一方面，本發(fā)明提供定量測(cè)定用試劑，包括在電子接受體存在下能通過(guò)脫氫反應(yīng)氧化甘露糖的酶，及對(duì)酶有用的電子接受體。
該試劑較佳還包含葡萄糖消除劑。此外，酶較佳為屬于酶編號(hào)EC類(lèi)1.1.1.119的葡萄糖脫氫酶，更佳為來(lái)自屬于葡糖桿菌屬的微生物的己醛糖脫氫酶。此外，葡萄糖消除劑較佳為包含葡萄糖6-位磷酸化酶和腺苷三磷酸。且電子接受體為輔酶NADP。
按照本發(fā)明，由于酶直接與甘露糖反應(yīng)，并能通過(guò)脫氫反應(yīng)氧化甘露糖，無(wú)需通過(guò)復(fù)雜的酶接合系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定，因此能方便地定量測(cè)定葡萄糖及進(jìn)行大量樣本的處理。而且，使用葡萄糖消除劑時(shí)，測(cè)定幾乎不受樣本中葡萄糖的影響，因此能精確地定量測(cè)定甘露糖。


圖1顯示用含電子接受體的第一試劑和含己醛糖脫氫酶的第二試劑測(cè)定各種濃度甘露糖的結(jié)果。
圖2顯示用含電子接受體和葡萄糖消除劑的第一試劑和含己醛糖脫氫酶的第二試劑測(cè)定各種濃度甘露糖的結(jié)果。
圖3顯示用含電子接受體和葡萄糖消除劑的第一試劑和含己醛糖脫氫酶的第二試劑對(duì)含恒定濃度甘露糖和各種濃度葡萄糖的溶液進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。
本發(fā)明中，作為樣本(試樣)，并無(wú)特別限制，只要意欲測(cè)定其甘露糖濃度。但是，較佳為使用生物樣本，如血液、血清、血漿、腦脊液和尿液，或從所述生物樣本制得的樣本，例如經(jīng)各種方法預(yù)處理的樣本，從而可容易地測(cè)定甘露糖等。這樣的預(yù)處理，例如從有葡萄糖共存的樣本中初步除去或消除葡萄糖的處理。
本發(fā)明中使用的酶無(wú)特別限制，只要它能在電子接受體存在下通過(guò)脫氫反應(yīng)氧化甘露糖(下文稱(chēng)作“甘露糖脫氫酶”)。但是，較佳可提到屬于酶編號(hào)EC類(lèi)1.1.1.119的酶。具體地可提到，例如，得自O(shè)KAMOTO的文獻(xiàn)(J.Biochem.53(5)1963 pp348-353)中所述弱氧化醋菌的NADP依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶、得自AVIGAD等文獻(xiàn)(J.biol.Chem.243(8)1968 pp1936-1941)所述Gluconobacter cerinus的NADP依賴(lài)性己醛糖脫氫酶、DAHMS等文獻(xiàn)(J.biol.Chem.247(7)1972pp2222-2227)所述NAD依賴(lài)性己醛糖脫氫酶及很多此類(lèi)酶。
所述酶特別是得自屬于葡糖桿菌屬的微生物的己醛糖脫氫酶。屬于葡糖桿菌屬的微生物可提到例如gluconobacter asaii(G.assai) IFO 3276，Gluconobacter cerinus(G.cerinus)IFO 3267，Gluconobacter frateurii(G.frateurii) IFO 3264，Gluconobacter oxydans(G.oxydans) IFO 14819等。將這些微生物進(jìn)行培養(yǎng)，回收細(xì)胞，然后用超聲波處理或其它方法破壞細(xì)胞，如果需要，合用柱層析如硫酸銨分級(jí)、離子交換層析、疏水層析、羥基磷灰石凝膠和凝膠過(guò)濾，可得到酶。
所用的甘露糖脫氫酶的濃度無(wú)特別限制，但較佳為0.1-100單位/升，更佳為1-10單位/升。
本發(fā)明中，可適當(dāng)選用一種或幾種輔酶作為電子接受體，如NAD和NADP、氧、吩嗪硫酸甲酯、二氯酚靛酚、鐵氰化物、四唑鎓鹽等。特別可取的是輔酶NADP。所用電子接受體的濃度較佳為0.1-10毫摩爾/升，特佳為0.5-2毫摩爾/升。
為了進(jìn)一步定量測(cè)定電子接受體還原物，采用通過(guò)電子接受體的還原顯色的生色劑。生色劑可根據(jù)所用電子接受體加以適當(dāng)選擇。例如，為了測(cè)定作為輔酶NADP還原物的NADPH，可有如下方法使四唑鎓鹽與吩嗪硫酸甲酯或心肌黃酶共存，將形成的甲染料作比色定量測(cè)定。
此外，由于本發(fā)明中所用的甘露糖脫氫酶不但對(duì)甘露糖而且對(duì)葡萄糖起作用，看來(lái)受到葡萄糖的影響，特別在待測(cè)甘露糖存在于生物樣本如血清或血漿中時(shí)。因此，為了提供對(duì)生物樣本檢測(cè)的精確性，較佳為同時(shí)使用葡萄糖消除劑。作為葡萄糖消除劑，較佳為使用含ATP和葡萄糖6-位磷酸化的酶。
作為葡萄糖6-位磷酸化酶，可有葡糖激酶、己糖激酶等。無(wú)特別限制，只要它屬于EC 2.7.1.2或EC 2，7.1.1，和能從市售而得之一即可使用。但是，對(duì)葡萄糖有高度選擇性的葡糖激酶可優(yōu)先使用。其用量根據(jù)樣本中的葡萄糖量而定，但一般為0.1-50u/ml。葡萄糖磷酸化需用的ATP的量根據(jù)樣本中葡萄糖的量而定，但一般為1-20mM。此外，作為葡萄糖磷酸化的促進(jìn)劑，一般含約5-50mM的鎂離子，如無(wú)機(jī)或有機(jī)鹽。為了消除葡萄糖而進(jìn)行的葡萄糖磷酸化在加入pH 6-10的緩沖液后立即在20-50℃溫度進(jìn)行，較佳為25-37℃，約10分鐘。
作為本發(fā)明有用的緩沖液，一般可用pH 6-10的溶液，如磷酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、Good’s緩沖液和硼酸緩沖液。
作為本發(fā)明的定量測(cè)定甘露糖的試劑，可將葡萄糖消除劑和定量測(cè)定試劑分開(kāi)制備、合并使用。更具體地，較佳地可包括兩種試劑，即含電子接受體和葡萄糖消除劑的第一試劑和含甘露糖脫氫酶的第二試劑。
將甘露糖定量測(cè)定試劑加到用于反應(yīng)的生物樣本中，然后測(cè)定反應(yīng)液中還原的電子接受體，例如在對(duì)電子接受體還原物特異的吸收波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，或測(cè)定生色劑的顯色強(qiáng)度，該生色劑通過(guò)電子接受體的還原而顯色。
下面將參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體描述。但是，應(yīng)當(dāng)提到本發(fā)明并不限制于此。
酶的制備實(shí)施例(得自Gluconobacter asaii的己醛糖脫氫酶的制備)將Gluconobacterasaii(IFO 3276)接種在含0.5％酵母提取物和1％果糖的培養(yǎng)基上，28℃振搖培養(yǎng)24小時(shí)，然后離心分離，得到細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)中，在冰冷卻下用超聲振蕩器處理，將粉碎后的溶液離心分離，除去細(xì)胞殘?jiān)玫酱种泼敢骸?br> 在此粗制酶液中加入硫酸銨粉，溶于其中，從而硫酸銨的量為飽和度的30％。離心分離除去沉淀的蛋白質(zhì)。將所得上清液通過(guò)Butyl toyopearl柱使酶吸收于其上，然后用含其量為飽和度的30％-0％的硫酸銨的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)以線(xiàn)性梯度洗脫此酶。
測(cè)定各洗脫部分的酶活性，回收活性部分。用20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)將活性部分透析除鹽，然后使其通過(guò)DEAE Toyopearl柱將酶吸收于其上，并用含0-0.25M Nacl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)以線(xiàn)性梯度洗脫此酶。
測(cè)定各洗脫部分的酶活性，回收活性部分。用20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)將活性部分透析除鹽，然后使其通過(guò)羥基磷灰石柱將酶吸收于其上，并用20-150mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)以線(xiàn)性梯度洗脫此酶。測(cè)定各洗脫部分的酶活性，回收活性部分，此即純化的酶液。
實(shí)施例1用上述酶制備實(shí)施例中所得的己醛糖脫氫酶和作為電子接受體的輔酶NADP，制備如下所示的包含第一試劑和第二試劑的甘露糖定量測(cè)定試劑。
第一試劑(pH 8.5)125mM Tris-HCl緩沖液；1.25mM NADP0.75mM WST-1(K.K.Dojin科學(xué)研究所制造的tradenade)；1.25％Tween 20(聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯)；6.25 u/ml心肌黃酶。
第二試劑(pH 7.0)20mM磷酸鹽緩沖液；23 u/ml己醛糖脫氫酶。
用此試劑，如下所示測(cè)定各種濃度(0-50μg/ml)甘露糖溶液。
向各種濃度甘露糖溶液8μl中各加入第一試劑256μl，于37℃進(jìn)行5分鐘反應(yīng)，然后加入第二試劑56μl，同樣于37℃進(jìn)行5分鐘反應(yīng)。最后，用兩點(diǎn)法進(jìn)行吸光度測(cè)定，主波長(zhǎng)為450nm，次波長(zhǎng)為700m。用日立7150型自動(dòng)分析儀進(jìn)行這些操作。結(jié)果見(jiàn)
圖1。
從
圖1可見(jiàn)，用甘露糖濃度0-50μg/ml得到線(xiàn)性光吸收，可在低濃度范圍內(nèi)進(jìn)行甘露糖的精確定量測(cè)定。
實(shí)施例2(用同時(shí)含葡萄糖消除劑的試劑系統(tǒng)定量測(cè)定甘露糖)用上述酶制備實(shí)施例中所得的己醛糖脫氫酶、作為電子接受體的輔酶NADP和作為葡萄糖消除劑的葡糖激酶和ATP，制備如下所示的包含第一試劑和第二試劑的甘露糖定量測(cè)定試劑。
第一試劑(pH 8.5)125mM Tris-HCl緩沖液；1.25mM NADP0.75mM WST-1(K.K.Dojin科學(xué)研究所制造的tradenade)；1.25％Tween 20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯)；6.25 u/ml心肌黃酶；12.5 u/ml葡糖激酶；10mM ATP；2mM乙酸鎂。
第二試劑(pH 7.0)20mM磷酸鹽緩沖液；23 u/ml己醛糖脫氫酶。
首先，如實(shí)施例所述，將此試劑與各種濃度(0-50μg/ml)甘露糖溶液反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液的吸光度。結(jié)果見(jiàn)圖2。
然后，將上述試劑與含恒定濃度(約10μg/ml)甘露糖和各種濃度(0-1，000mg/dl)葡萄糖的各溶液反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液的吸光度。結(jié)果見(jiàn)圖3。
從圖2可見(jiàn)，用0-50μg/ml甘露糖濃度得到線(xiàn)性吸光度，即使在合用葡萄糖消除劑的試劑系統(tǒng)均能進(jìn)行精確的甘露糖定量測(cè)定。
而且，從圖3可見(jiàn)，即使樣本中的葡萄糖濃度從0-1，000mg/dl不等，仍可得到基于甘露糖濃度的恒定吸光度。從此結(jié)果顯然可見(jiàn)，即使在含高濃度葡萄糖的樣本中，也可精確地定量測(cè)定樣本中的甘露糖。
實(shí)施例3用實(shí)施例2的試劑測(cè)定甘露糖，關(guān)于樣本的制備，系按1體積份與9體積份五種血清(血清No.1-5)中的一種之比，加入100μg/ml甘露糖水溶液，以加入純水代替甘露糖水溶液的樣本作為對(duì)照。用測(cè)得值和實(shí)施例2中所得校正曲線(xiàn)對(duì)甘露糖的量作定量測(cè)定，回收所加入甘露糖的化學(xué)計(jì)量量。結(jié)果如表1所示。
表1 從
圖1的結(jié)果可見(jiàn)，回收率極佳，達(dá)到所加甘露糖的化學(xué)計(jì)量，可進(jìn)行血清中甘露糖的精確定量測(cè)定。
如上所述，按照本發(fā)明，在含甘露糖的樣本中加入電子接受體，用甘露糖脫氫酶與其反應(yīng)，藉此甘露糖脫氫酶直接與甘露糖反應(yīng)，將甘露糖氧化，同時(shí)直接還原電子接受體，通過(guò)測(cè)定所形成的電子接受體還原物，可高靈敏度地精確定量測(cè)定甘露糖。而且，由于反應(yīng)系統(tǒng)簡(jiǎn)單，本發(fā)明可用于各種自動(dòng)分析儀，并適合于大量樣本的處理。
此外，合用葡萄糖消除劑以降低樣本中共存的葡萄糖，使樣本達(dá)到葡萄糖的影響基本上可忽略不計(jì)的水平，從而甚至在諸如血清或血漿等生物樣本中也可用簡(jiǎn)單的操作達(dá)到高精密度的測(cè)定。
權(quán)利要求
1．定量測(cè)定甘露糖的方法，其特征在于包括在電子接受體存在下將樣本中的甘露糖與能通過(guò)脫氫反應(yīng)氧化甘露糖的酶進(jìn)行反應(yīng)，并定量測(cè)定所形成的電子接受體還原物。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其中樣本除甘露糖外還含有葡萄糖，在與酶反應(yīng)前用葡萄糖消除劑將樣本中的葡萄糖轉(zhuǎn)化為不與酶反應(yīng)的結(jié)構(gòu)。
3．如權(quán)利要求1和2之一所述的方法，其中酶為屬于酶編號(hào)EC類(lèi)1.1.1.119的葡萄糖脫氫酶。
4．如權(quán)利要求1-3之一所述的方法，其中酶為來(lái)自屬于葡糖桿菌屬的微生物的己醛糖脫氫酶。
5．如權(quán)利要求2所述的方法，其中葡萄糖消除劑包含葡萄糖6-位磷酸化酶和腺苷三磷酸。
6．如權(quán)利要求1-5之一所述的方法，其中電子接受體是氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸輔酶。
7．如權(quán)利要求1-6之一所述的方法，其中樣本為選自血液、血清、血漿、腦脊液和尿液的至少一種生物樣本，或從所述生物樣本制得的樣本。
8．定量測(cè)定甘露糖的試劑，所述試劑包括在電子接受體存在下能通過(guò)脫氫反應(yīng)氧化甘露糖的酶，及對(duì)酶有用的電子接受體。
9．如權(quán)利要求8所述的試劑，其中還包括葡萄糖消除劑。
10．如權(quán)利要求8和9之一所述的試劑，其中酶是屬于酶編號(hào)EC類(lèi)1.1.1.119的葡萄糖脫氫酶。
11．如權(quán)利要求8-10之一所述的試劑，其中酶是來(lái)自屬于葡糖桿菌屬的微生物的己醛糖脫氫酶。
12．如權(quán)利要求9所述的試劑，其中，其中葡萄糖消除劑包含葡萄糖6-位磷酸化酶和腺苷三磷酸。
13．如權(quán)利要求8-12之一所述的試劑，其中電子接受體是氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸輔酶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種定量測(cè)定甘露糖的方法,包括在電子接受體存在下將樣本中的甘露糖與能通過(guò)脫氫反應(yīng)氧化甘露糖的酶進(jìn)行反應(yīng),并定量測(cè)定所形成的電子接受體還原物;以及定量測(cè)定甘露糖的試劑。
文檔編號(hào)C12Q1/54GK1296172SQ0013394
公開(kāi)日2001年5月23日 申請(qǐng)日期2000年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月10日
發(fā)明者海老沼宏幸, 牛澤幸司 申請(qǐng)人:第一化學(xué)藥品株式會(huì)社