專利名稱：幽門螺桿菌vacA－B基因表達(dá)工程菌的構(gòu)建及其產(chǎn)物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于幽門螺桿菌(Hp)細(xì)胞空泡毒素A基因片段(vacA-B)表達(dá)工程菌的構(gòu)建及其產(chǎn)物的制備方法，具體內(nèi)容為采用PCR方法獲取vacA基因的片段B，構(gòu)建vacA-B基因的表達(dá)工程菌，并選擇合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法得到表達(dá)活力高、表達(dá)水平高及純度高的目的蛋白。
幽門螺桿菌細(xì)胞空泡毒素A(VacA)具有較高的抗原性；傳統(tǒng)的幽門螺桿菌(Hp)培養(yǎng)方法一般需5-7天，浪費(fèi)時(shí)間，且從菌體中提取該蛋白的工藝煩瑣，回收率低，故采用基因重組技術(shù)制備該蛋白是獲得抗原的重要途徑。
本發(fā)明的目的是構(gòu)建幽門螺桿菌vacA-B基因表達(dá)的工程菌及其產(chǎn)物的制備方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為一種幽門螺桿菌vacA-B基因表達(dá)工程菌的構(gòu)建，其特殊之處在于選取幽門螺桿菌DNA中vacA基因5’-端909bp的片段B，其核苷酸序列如下ATGGCCTTTTTCACAACCGTGATCATTCCAGCCATTGTTGGGGGTATCGCTACAGGCACCGCTGTAGGAACGGTCTCAGGGCTTCTTAGCTGGGGGCTCAAACAAGCCGAAGAAGCCAATAAAACCCCAGATAAACCCGATAAAGTTTGGCGCATTCAAGCAGGAAAAGGCTTTAATGAATTCCCTAACAAGGAATACGACTTATACAGATCCCTTTTATCCAGTAAGATTGATGGAGGTTGGGATTGGGGGAATGCCGCTAGGCATTATTGGGTCAAAGGCGGGCAACAGAATAAGCTTGAAGTGGATATGAAAGACGCTGTAGGGACTTATACCTTATCAGGGCTTAGAAACTTTACTGGTGGGGATTTAGATGTCAATATGCAAAAAGCCACTTTACGCTTGGGCCAATTCAATGGCAATTCTTTTACAAGCTATAAGGATAGTGCTGATCGCACCACGAGAGTGGATTTCAACGCTAAAAATATCTCAATTGATAATTTTGTAGAAATCAACAATCGTGTGGGTTCTGGAGCCGGGAGGAAAGCCAGCTCTACGGTTTTGACTTTGCAAGCTTCAGAAGGGATCACTAGCGATAAAAACGCTGAAATTTCTCTTTATGATGGTGCCACGCTCAATTTGGCTTCAAGCAGCGTTAAATTAATGGGTAATGTGTGGATGGGCCGTTTGCAATACGTGGGAGCGTATTTGGCCCCTTCATACAGCACGATAAACACTTCAAAAGTAACAGGGGAAGTGAATTTTAACCACCTCACTGTTGGCGATAAAAACGCCGCTCAAGCGGGCATTATCGCTAATAAAAAGACTAATATTGGCACACTGGATTTGTGGCAAAGCGCCGGGTTAAACATTATCGCTCCTCCAGAAGGTGGCTATAAGGATAAATAA上述幽門螺桿菌vacA-B基因表達(dá)工程菌構(gòu)建的步驟如下1)從幽門螺桿菌中提取總DNA；2)用PCR方法從基因組DNA中擴(kuò)增vacA基因的片段B；3)將vacA基因的片段B連接在表達(dá)載體pRSETA上；4)將重組載體vacA-B-pRSETA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21DE3中得到工程菌。
上述用PCR方法從基因組DNA獲取vacA基因的片段B，其PCR引物序列設(shè)計(jì)如下上游引物5’GC GGA TCC ATG GCC TTT TTC ACA ACC GTG AT 3’下游引物5’GC CTG CAG TTA TTT ATC CTT ATA GCC ACC TTC 3’上述vacA-B基因與表達(dá)載體pRSETA的連接如下1)PCR所采用兩個(gè)引物是根據(jù)vacA的基因序列設(shè)計(jì)的；2)vacA基因片段B的5′端連在表達(dá)載體pRSETA的BamH I位點(diǎn)上，3′端連在表達(dá)載體pRSETA的Pst I位點(diǎn)上，從而構(gòu)成重組表達(dá)載體vacA-B-pRSETA；一種幽門螺桿菌vacA-B基因表達(dá)工程菌的表達(dá)產(chǎn)物的制備方法如下1)VacA-B抗原的化學(xué)誘導(dǎo)及表達(dá)；2)VacA-B的分離及純化；3)VacA-B活性鑒定。
下面結(jié)合具體實(shí)施例；詳細(xì)描述如下一、制備模板在Hp培養(yǎng)平板上挑取生長(zhǎng)良好的菌落，提取Hp總DNA，溶于100μL無菌水中，稀釋5倍作為模板。
二、目的片段的擴(kuò)增PCR反應(yīng)的總體積為25μL，其中含模板2μL，每種引物各10pmol，2.5mmol/L dNTP混合物2μL，10×PCR Reaction Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl22.5μL，耐熱DNA聚合酶0.75U，加H2O到25μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸3min，共循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后在10g/L瓊脂糖凝膠上檢查擴(kuò)增結(jié)果，電泳緩沖液為0.5XTAE，溴化乙錠染色，并在紫外燈下切下目的條帶。
三、PCR產(chǎn)物克隆回收PCR產(chǎn)物，溶于40μL的NE溶液中。取0.5ml的EP管2支，其中一支加入目的片段DNA 20μL，另一支加入含有1μg pGEM-3Zf(-)溶，然后各加入10xBuffer 2.5μL，BamH I 1μL(12U)，Pst I 1μL(15U)30℃溫育2h之后37℃溫育2h。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳，同前切下目的條帶。將含雙酶切目的片段的瓊脂糖凝膠與含雙酶切pGEM-3Zf(-)的凝膠按3∶1的比例放在同一1.5ml的EP管中，回收DNA溶于30μL NE溶液中，向回收產(chǎn)物中加入4μL T4 DNA Ligase Buffer，1μL T4 DNA Ligase，于12℃保溫16h。將連接產(chǎn)物5μL轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)以水作空白對(duì)照，pGEM-3Zf(-)作陰性對(duì)照，在含有Amp(100mg/mL)的LB平板上加入20μL 0.1mol/L IPTG和16μL 5％X-Gal做藍(lán)白篩選，挑取白色克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，同前雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。
四、序列測(cè)定選擇經(jīng)雙酶切鑒定陽性的含重組vacA-B-pGEM-3Zf(-)的菌株，測(cè)定vacA-B的序列。
五、表達(dá)載體的構(gòu)建將含重組質(zhì)粒的細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，用BamH I和Pst I雙酶切后，獲得909 bp大小的目的片段。將其與同樣雙酶切處理的載體pRSETA連接，轉(zhuǎn)入BL21DE3菌，獲得重組表達(dá)載體vacA-B-pRSETA，并對(duì)其進(jìn)行雙酶切鑒定。
六、目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)挑取含有vacA-B-pRSETA的單個(gè)菌落，接種子LB(含Amp 100mg/L)培養(yǎng)液中，在37℃振搖至A600＝0.4。加入IPTG使終濃度達(dá)0.5mmol/L，37℃振搖4h，離心收菌。
七、目的蛋白的表達(dá)形式和溶解性分析經(jīng)分級(jí)分離及12％SDS-PAGE分析，表達(dá)產(chǎn)物主要以包含體及可溶性蛋白兩種形式存在。表達(dá)量占菌體蛋白40％，包含體占菌體蛋白30％，可溶性蛋白占菌體蛋白10％。
八、Western blot分析將誘導(dǎo)菌的全菌做SDS-PAGE，使凝膠靠近陰極一側(cè)，硝酸纖維素膜(NC膜)靠近陽極一側(cè)，轉(zhuǎn)移緩沖液為25mmol/L Tris-192mmol/LGlycine-200ml/L甲醇，在100V條件下轉(zhuǎn)移45min，使蛋白從凝膠電轉(zhuǎn)移至NC膜上。電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC膜，依次進(jìn)行亮綠(1g/L亮綠-100ml/L冰乙酸-500ml/L甲醇)染色和三蒸水沖洗終止染色，并用鉛筆在目的條帶兩端作標(biāo)記。加封閉液(含100g/L脫脂奶粉和0.5mL/L Tween 20的pH7.5 TBS)室溫2h封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，用TBS洗滌液室溫洗膜4次，每次15min。然后依次加兔抗Vac A多抗(37℃作用1--1.5h，用TBS洗滌液室溫同上洗膜)和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(37℃作用1--2h，用TBS洗滌液室溫洗膜6次)。最后，將NC膜浸入DAB顯色液中染色，以蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。
九、目的蛋白純化用Ni-NTA親和層析純化誘導(dǎo)菌的上清和包含體，獲得的目的蛋白純度高。
(1)樣品制備離心收集誘導(dǎo)菌，超聲碎菌，離心收集沉淀和上清(2)上清的純化將上清與Ni-NTA充分混勻裝柱，用含咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白(3)包含體的純化將沉淀用含8mol/L脲的緩沖液變性，離心收集上清，將上清與Ni-NTA充分混勻裝柱，用pH梯度洗脫目的蛋白。
權(quán)利要求
1.一種幽門螺桿菌vacA-B基因表達(dá)工程菌的構(gòu)建，其特征在于選取幽門螺桿菌DNA中vacA基因的片段B，其核苷酸序列如下ATGGCCTTTTTCACAACCGTGATCATTCCAGCCATTGTTGGGGGTATCGCTACAGGCACCGCTGTAGGAACGGTCTCAGGGCTTCTTAGCTGGGGGCTCAAACAAGCCGAAGAAGCCAATAAAACCCCAGATAAACCCGATAAAGTTTGGCGCATTCAAGCAGGAAAAGGCTTTAATGAATTCCCTAACAAGGAATACGACTTATACAGATCCCTTTTATCCAGTAAGATTGATGGAGGTTGGGATTGGGGGAATGCCGCTAGGCATTATTGGGTCAAAGGCGGGCAACAGAATAAGCTTGAAGTGGATATGAAAGACGCTGTAGGGACTTATACCTTATCAGGGCTTAGAAACTTTACTGGTGGGGATTTAGATGTCAATATGCAAAAAGCCACTTTACGCTTGGGCCAATTCAATGGCAATTCTTTTACAAGCTATAAGGATAGTGCTGATCGCACCACGAGAGTGGATTTCAACGCTAAAAATATCTCAATTGATAATTTTGTAGAAATCAACAATCGTGTGGGTTCTGGAGCCGGGAGGAAAGCCAGCTCTACGGTTTTGACTTTGCAAGCTTCAGAAGGGATCACTAGCGATAAAAACGCTGAAATTTCTCTTTATGATGGTGCCACGCTCAATTTGGCTTCAAGCAGCGTTAAATTAATGGGTAATGTGTGGATGGGCCGTTTGCAATACGTGGGAGCGTATTTGGCCCCTTCATACAGCACGATAAACACTTCAAAAGTAACAGGGGAAGTGAATTTTAACCACCTCACTGTTGGCGATAAAAACGCCGCTCAAGCGGGCATTATCGCTAATAAAAAGACTAATATTGGCACACTGGATTTGTGGCAAAGCGCCGGGTTAAACATTATCGCTCCTCCAGAAGGTGGCTATAAGGATAAATAA
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌vacA-B基因表達(dá)工程菌的構(gòu)建，其特征在于1)從幽門螺桿菌中提取總DNA；2)用PCR方法分別從基因組DNA中獲取vacA基因的片段B；3)將vacA基因的片段B連接在表達(dá)載體pRSETA上；4)將重組載體vacA-B-pRSETA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21DE3中得工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的幽門螺桿菌vacA-B基因表達(dá)工程菌的構(gòu)建，其特征于上述用PCR方法從基因組DNA中獲取vacA基因的片段B，其設(shè)計(jì)PCR引物，序列如下上游引物5’GC GGA TCC ATG GCC TTT TTC ACA ACC GTG AT 3’下游引物5’GC CTG CAG TTA TTT ATC CTT ATA GCC ACC TTC 3’
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的幽門螺桿菌vacA-B基因表達(dá)工程菌的構(gòu)建，其特征在于上述vacA-B基因與表達(dá)載體pRSETA的連接如下1)PCR所采用兩個(gè)引物是根據(jù)vacA的基因序列設(shè)計(jì)的；2)vacA基因片段B的5′端連在表達(dá)載體pRSETA的BamH I位點(diǎn)上，3′端連在表達(dá)載體pRSETA的Pst I位點(diǎn)上，從而構(gòu)成重組表達(dá)載體vacA-B-pRSETA；
5.一種幽門螺桿菌vacA-B基因表達(dá)工程菌的表達(dá)產(chǎn)物的制備方法1)VacA-B抗原的化學(xué)誘導(dǎo)及表達(dá)；2)VacA-B的分離及純化；3)VacA-B活性鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開一種幽門螺桿菌vacA－B基因表達(dá)工程菌的構(gòu)建及其產(chǎn)物的制備方法。該構(gòu)建方法包括:從幽門螺桿菌中提取總DNA;用PCR方法從基因組DNA中獲取vacA基因的片段B;將vacA－B連接在載體pRSETA上;將載體pRSETA轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21DE3中,經(jīng)培養(yǎng)獲得工程菌。將工程菌發(fā)酵培養(yǎng),經(jīng)誘導(dǎo)、表達(dá)獲得重組蛋白。該方法獲得的重組蛋白—細(xì)胞空泡毒素A的B片段(VacA－B),有高度的抗原性,可為免疫學(xué)檢測(cè)VacA陽性Hp感染的方法提供抗原,還可制成疫苗用于VacA陽性Hp感染的預(yù)防及治療。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1358862SQ0013546
公開日2002年7月17日 申請(qǐng)日期2000年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月15日
發(fā)明者江紅, 韓鋒產(chǎn), 閻小君 申請(qǐng)人:西安高科實(shí)業(yè)股份有限公司基因生命科技分公司