專利名稱：快速檢測大腸桿菌和大腸菌群試劑盒及其底物的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測方法，尤其是一種大腸桿菌和大腸菌群的快速檢測方法。
大腸桿菌和大腸菌群是國際上公認(rèn)的藥品，食品、臨床檢驗、環(huán)境監(jiān)測、衛(wèi)生防疫等領(lǐng)域中通用的指標(biāo)。其檢測方法多采用傳統(tǒng)的發(fā)酵、分離生化檢驗及多管發(fā)酵和膜過濾法。這些方法的主要缺點是操作繁瑣、耗時長、成本高，一般需3～5天時間，有可能導(dǎo)致病情的延誤，以及物品、食品遲銷造成經(jīng)濟(jì)損失。
本發(fā)明所述試劑盒的底物本發(fā)明的目的在于提供一種能夠準(zhǔn)確、簡便、快速、低成本的檢測大腸桿菌及大腸菌群試劑盒，并提供該試劑盒所用底物PNP-β-D-葡糖苷酸鈉鹽技術(shù)路線合理、工藝穩(wěn)定、收率高、成本低的合成方法。
本發(fā)明PNP-葡糖苷酸(鹽)快速檢測大腸桿菌及大腸菌群試劑盒屬酶學(xué)檢測大腸桿菌及大腸菌群。其原理是根據(jù)大腸桿菌及大腸菌群中特異性含有β-葡糖苷酸酶(B-G)，在適宜的環(huán)境下，與底物PNP-葡糖苷酸(鹽)反應(yīng)，將底物分解成色團(tuán)(PNP)形成黃色，反應(yīng)式如下 依據(jù)以上原理，以底物PNP-β-D葡糖苷酸鈉鹽制成底物片，以膽鹽乳糖增菌液制成培養(yǎng)基片，以磷酸鹽配制0.2mol/L pH＝7.5緩沖液。將分別裝有底物片、培養(yǎng)基片及緩沖液的3個瓶子裝入一個盒內(nèi)，組裝成兩片一水的試劑盒。
本發(fā)明所述的試劑盒是以如下方法制成的1、底物、培養(yǎng)基均以紙片為載體，選用0.48mm厚濾紙，三種規(guī)格分別為直徑6mm圓片，6.25mm×25mm條形，62.5mm×12.5mm條形。
2、底物片的制備稱取計算量的PNP-Glucu Na溶解，在無菌操作下浸吸備好的紙片，脫水后于40℃烘干，裝入滅菌的棕色小瓶中，2-8℃避光密封保存。含底物分別約為100μg/片，1mg/片，5mg/片。
3、培養(yǎng)基片的制備參考95年版藥典培養(yǎng)基濃度半量計算，稱取膽鹽乳糖增菌液溶，高壓滅菌，浸吸備好的紙片，脫水后60℃烘干，裝入包裝瓶內(nèi)2-8℃密封保存。培養(yǎng)基約為4mg/片，20mg/片，200mg/片。
4、緩沖液的配制按有關(guān)生化書籍，取一定量的磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉，制成0.2mol/L，pH＝7.5的(PBS)緩沖液，高壓滅菌后封口2-8℃保存。
5、組盒裝分別裝有底物片、培養(yǎng)基片及緩沖液的3個瓶子裝入一個盒內(nèi)，就組成了試劑盒。
根據(jù)被測樣品不同，試劑盒分為兩種規(guī)格。
(1)適合醫(yī)院臨床、藥檢、水檢增菌后濃集后等微量取樣的試劑盒，見表1。
表1 I型試劑盒(適合100μl取樣)
(2)適合環(huán)保檢測的試劑盒，見表2。
表2 II型試劑盒
該試劑盒中關(guān)鍵的底物是以如下路線合成的。
其具體操作方法步驟如下(1)四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖醛酸甲酯的制備取葡糖醛酸內(nèi)酯87.5g(0.5mol)，加入1mol/L甲醇鈉15ml和無水甲醇485ml混合物，攪拌2h。減壓蒸去甲醇，得糖漿。加入醋酸酐330ml，冰浴下滴加吡啶110ml，滴加溫度在20℃以下，放冷，過濾粗品，用95％乙醇洗滌，再用95％乙醇重結(jié)晶脫色，得針狀結(jié)晶四-O-乙?；?β-D吡喃葡糖醛酸甲酯63.8g，產(chǎn)率35％，mp178-179℃。
(2)三-O-乙?；?α-D-溴代吡喃葡糖醛酸甲酯的制備取紅磷9g，加90mL冰醋酸，冰浴攪拌下滴加54g(18ml)溴，維持20℃滴加，靜止30min，過濾得橙黃色溴試劑，冰箱密封備用。
取四-O-乙?；?D-葡糖醛酸甲酯20g，加入溴試劑80ml，室溫攪拌溶解，冰箱過夜，次日在15毫米汞柱下，減壓濃縮殘留物用80ml氯仿溶解，先用水洗，再用飽和的碳酸氫鈉溶液洗，分離氯仿層，用無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸去氯仿，得糖漿。加少量無水甲醇溶解，放入冰箱凍室過夜，次日析出塊狀結(jié)晶三-O-乙?；?α-D-溴代葡糖醛酸甲酯12.8g，產(chǎn)率62％，mp104-106℃(文獻(xiàn)106-107℃)(冰箱密封保存)。
(3)對-硝基苯-三-O-乙?；?β-D-葡糖苷酸甲酯的合成取三-O-乙?；?α-D-溴代吡喃葡糖醛酸甲酯11.4g對-硝基苯8g，乙腈50ml，攪拌下緩緩加入新鮮的氧化銀7.2g，攪拌2-3小時，過濾銀鹽，并用乙腈洗滌，合并濾液。減壓蒸去乙腈，得糖漿，加無水乙醇，活性碳脫色，過濾，于冰箱內(nèi)過夜，析晶，得閃亮結(jié)晶對-硝基苯-三-O-乙?；?β-D-葡糖苷酸甲酯6g，產(chǎn)率46.3％，mp154-155℃(文獻(xiàn)154℃)。
(4)對硝基苯-β-D-葡糖苷酸鈉鹽的制備取對-硝基苯-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖苷酸甲酯6g，加入0.2mol/L氫氧化鈉20倍量(v/w)，4倍量95％乙醇，攪拌反應(yīng)，不斷補加氫氧化鈉溶液，反應(yīng)物溶解，共8小時，減壓濃縮，得到對-硝基苯-β-D-葡糖苷酸鈉鹽固體。水-乙醇精制后得3.7g，收率81％，220℃(分解)(文獻(xiàn)220℃分解)。
分子式C12H12NO9Na·H2O，分子量355.2元素分析理論值C 40.50％，H 3.38％，N 3.94％實測值C 40.16％，H 3.68％，N 3.93％IRKBrmax(cm-1)3200，3368(-OH)，1618(-COOH)，1239(C-O)1537，1394(C-NO2)HNMR(200MC，TMS內(nèi)標(biāo)，P2O溶劑)δ3.62(m，3H)，3.91(m，1H)，5.25(d，1H)，7.22(d，2H)，8.23(d，2H)本發(fā)明所述的試劑盒的檢測方法如下將試劑盒中的內(nèi)容物緩沖液、培養(yǎng)基片、底物片，加入到水樣或各領(lǐng)域經(jīng)預(yù)處理的樣品中，37℃恒溫箱孵育2-16小時，分解顯現(xiàn)黃色的為陽性，以無菌樣作空白。通過查MPN表也可定量地檢測樣品中大腸桿菌及菌群。
表3 檢測大腸桿菌步驟
根據(jù)需要加空白對照。
應(yīng)用本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行了如下檢測實例。
1、檢測醫(yī)院臨床標(biāo)本的尿液，分泌物膿汁等的大腸桿菌，取感染尿液4-5ml，置小管中，離心30分鐘(300轉(zhuǎn)/分)，傾去上清尿，使用I型盒，加入100μl緩沖液與尿沉淀物混均，加入培養(yǎng)基片一片，再加底物1片，37℃，恒溫水浴2-4小時，出現(xiàn)黃色為陽性(以空白菌樣對照)，表示大腸桿菌存在數(shù)量大于104/ml，可直接診斷為大腸桿菌感染。
2、檢測藥品中的大腸桿菌按常規(guī)進(jìn)行予處理，取供試品10g，加入滅菌生理鹽水，使之成為1∶1均勻供試液，取10ml供試液，加入100ml膽鹽乳糖增菌液中置36±1℃培養(yǎng)18-24h，取此增菌培養(yǎng)物5ml，于滅菌的離心管中以3500r/min離心30min，棄去上清液，保留管底殘液，加I型試劑盒內(nèi)容物緩沖液100μl，培養(yǎng)基片及底物片各一片，36±1℃培養(yǎng)2-4小時，觀察結(jié)果，離心管內(nèi)與空白管相比形成明顯黃色，則為陽性，否則為陰性。本法同時與藥典方法比較，40個樣品，符合率為100％，可省時44小時。
3、檢測地表水總大腸菌群數(shù)普通地表水按環(huán)保監(jiān)測法分四管取樣即10ml、lml、0.1ml、0.01ml(后三管均稀釋至1mL)，加入II型檢測盒內(nèi)容物，分別在各管內(nèi)加入緩沖液2ml、0.2ml、0.2ml、0.2ml，再分別加入底物片及培養(yǎng)基片大條、小條、小條、小條。37℃溫育8-10h，含菌管與空白管相比呈明顯黃色，經(jīng)MPN表得到每升水中的大腸菌群數(shù)目，同時與環(huán)保常規(guī)法對照，符合率100％，只需10小時。
4、檢定食品、飲料中的大腸菌群數(shù)取食品樣品19個，經(jīng)GB 4789初發(fā)酵的陽性樣品2ml，離心、棄上清液后加入緩沖液0.1mL分別加入底物片及培養(yǎng)片(I型盒)各一片，37℃保溫2-16小時，與空白比產(chǎn)生黃色為陽性，查表MPN得出原始被檢樣品大腸菌群數(shù)。同時用GB 4789方法與之對照，此法符合率為92.8％，操作簡便，可省時24-46小時。
5、檢測生活飲用水及合成水樣的大腸菌群取經(jīng)預(yù)處理的水樣100μl于試管內(nèi)，加入I型試劑盒內(nèi)容物，100μl緩沖液，培養(yǎng)基片及底物片各一片，37℃溫育2h，與空白對照比較呈明顯黃色，經(jīng)查MPN表計算菌數(shù)。本法與國標(biāo)GB5750-85和國際標(biāo)準(zhǔn)IS 09308-2進(jìn)行比較，符合率為100％，對于接種菌水樣1.5-2h出現(xiàn)陽性，省時達(dá)24倍。
本發(fā)明所述的試劑盒測定的性能實驗。
1、靈敏度及最小檢出度取標(biāo)準(zhǔn)菌株濁液以10-1遞減，各管取1ml，共10管。按前述步驟加入緩沖液，底物片及培養(yǎng)基片37℃孵育，觀察各數(shù)量級的菌液顯色時間和強度(表4)。結(jié)果表明，當(dāng)菌濃4×107時只需0.5小時即呈色，4×100時需12小時，優(yōu)于文獻(xiàn)報道的其它底物法(菌濃108需3小時，100時需16小時)。
表4各菌液的顯色時間與強度
注±弱陽性+陽性++弱強陽性+++強陽性-陰性2、特異性取生長菌落142株，用園型底物片及培養(yǎng)基片，如前述步驟操作，37℃溫育10-30分鐘，出現(xiàn)黃色為陽性。菌總數(shù)為142株，已知大腸埃希菌陽性為60株，本法檢出陽性58株，其敏感性為96.7％，其它陰性菌為82株，共有5株不符，特異性為96.4％，見表5。
表5本法檢測大腸埃希菌的特異性試驗
3、底物片含量的穩(wěn)定性考查冰箱2-8℃避光干燥保存的底物片，存放一年，在一年內(nèi)定期取樣，測定其含量，每次取10份樣品，每份10片，定溶測定，求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并與對照組(0時)比較，做t檢驗，見表6。
表6存放一年內(nèi)的底物片含量
2-8℃、避光、干燥條件下保存底物片，存放一年，其底物含量無明顯變化。
4、對比實驗用本法與環(huán)保常規(guī)法進(jìn)行對比實驗，見表7。結(jié)果本法檢測6小時全部顯出鮮明黃色(++)，而常規(guī)法6小時只見兩管(10ml管、1ml管)顯色(+)，直至18小時才全部顯色。本法與常規(guī)法相比，符合率100％，而且顯色速度快，操作簡便，價格便宜。
表7本法與常規(guī)法比較實驗
注±弱陽性+陽性++弱強陽性+++強陽性-陰性本發(fā)明底物PNP-β-D-葡糖苷酸鈉鹽的合成方法，簡化了操作，縮短了時間，三步分別提高收率15％、10％和16％。本發(fā)明的合成技術(shù)路線合理，工藝穩(wěn)定，合成的底物收率高，成本低廉，并在溶解性方面、純度方面、穩(wěn)定性方面、價格方面均優(yōu)于美國Sigma公司的PNP-β-D-葡糖苷酸。本發(fā)明為該底物的國產(chǎn)化、商品化奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明所述的試劑盒用來檢測大腸桿菌，當(dāng)菌濃4×107時，只需0.5小時；當(dāng)菌濃4×100時，需12小時，較常規(guī)法可省時2-3天，其檢測速度優(yōu)于文獻(xiàn)報道的底物4-mu-β-D-半乳糖苷酸(當(dāng)菌濃108時需要3小時，100時需17小時)；檢查60株陽性菌和82析其它菌；其敏感性96.7％，特異性96.4％；由于本試劑盒對腸出血性腸類O157顯示陰性，則有利于對腸出血性大腸桿菌(EHEC)的鑒別；本發(fā)明所述的試劑盒操作簡便，不需特殊儀器和設(shè)備，而且成本特別低廉，如取微量100μl菌樣，完成一個樣品的檢驗，需成本費(除人工、水電)還不足一分錢；穩(wěn)定性考查顯示，底物片2-8℃密封避光保存數(shù)月至一年，穩(wěn)定性良好。綜上所述本發(fā)明所述的試劑盒的研究成功表示一種能快速、準(zhǔn)確、方便、特異性強、成本低廉的檢測大腸桿菌的新物質(zhì)的出現(xiàn)，為大腸桿菌及大腸菌群檢測提供了一個新手段。
本發(fā)明所述的試劑盒用于醫(yī)院臨床、藥品檢驗、食品檢驗、環(huán)保及衛(wèi)生防病等五個領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用實驗。醫(yī)院系統(tǒng)有天津一中心檢驗學(xué)部、天津中醫(yī)學(xué)院一附院檢驗科、天津胸科醫(yī)院，用于檢驗從尿液、分泌物中分出的大腸桿菌及非大腸菌，2-4小時內(nèi)均得到了100％的符合率。藥品檢驗所用此試劑盒對染菌及非染菌樣品進(jìn)行檢測符合率100％，省時44小時，節(jié)約了費用。食品檢驗所用此試劑盒檢測初發(fā)酵樣品，69支陽性管符合率為92.8％，操作簡單，省時24-26小時。天津環(huán)境監(jiān)測中心應(yīng)用本發(fā)明所述的試劑盒檢測地面水與環(huán)保常規(guī)法對照，結(jié)果完全一致，在8-10小時內(nèi)便可確認(rèn)，且操作簡便。天津衛(wèi)生防病中心用此盒檢測生活飲用水及合成水樣與國標(biāo)GB 5750-85和國際標(biāo)準(zhǔn)IS 09308-2進(jìn)行比較，三種方法所測結(jié)果一致，說明本試劑盒對定性濾膜法測定大腸菌群十分可靠，定性耗時1.5-2h，比傳統(tǒng)法節(jié)約時間24小時，特異性強，技術(shù)指標(biāo)達(dá)到了國際標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種用于快速檢測大腸桿菌和菌群的試劑盒，包括以底物PNP-β-D-葡糖苷酸鈉鹽制成底物片，以膽鹽乳糖增菌液制成培養(yǎng)基片，以磷酸鹽配制0.2mol/L pH＝7.5緩沖液，將分別裝有底物片、培養(yǎng)基片及緩沖液的3個瓶子裝入一個盒內(nèi)，組裝成兩片一水的試劑盒。
2.權(quán)利要求1所述快速檢測大腸桿菌和大腸菌群的試劑盒，其特征在于制造方法a.底物、培養(yǎng)基均以紙片為載體，選用0.48mm厚濾紙，三種規(guī)格分別為直徑6mm圓片，6.25mm×25mm條形，62.5mm×12.5mm條形；b.底物片的制備稱取計算量的PNP-Glucu Na溶解，在無菌操作下浸吸備好的紙片，脫水后于40℃烘干，裝入滅菌的棕色小瓶中，2-8℃避光密封保存。含底物分別約為100μg/片，1mg/片，5mg/片；c.培養(yǎng)基片的制備參考95年版藥典培養(yǎng)基濃度半量計算，稱取膽鹽乳糖增菌溶液，高壓滅菌，浸吸備好的紙片，脫水后60℃烘干，裝入包裝瓶內(nèi)2-8℃密封保存。培養(yǎng)基約為4mg/片，20mg/片，200mg/片；d.緩沖液的配制按有關(guān)生化書籍，取一定量的磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉，制成0.2mol/L，pH＝7.5(PBS)緩沖液，高壓滅菌后封口2-8℃保存。e.組盒將分別裝有底物片、培養(yǎng)基片及緩沖液的3個瓶子裝入一個盒內(nèi)，就組成了試劑盒。
3.權(quán)利要求1所述的用于快速檢測大腸桿菌和大腸菌群的試劑盒，其特征是檢測方法為將試劑盒中的內(nèi)容物緩沖液、底物片加入到被測的水樣中，或各領(lǐng)域中經(jīng)予處理的樣品中，經(jīng)37℃恒溫箱孵育12-16小時，分解顯現(xiàn)黃色為陽性，以無菌樣作空白。
4.權(quán)利要求1所述的用于快速檢測大腸桿菌和大腸菌群的試劑盒，其特征是底物PNP-β-D-葡糖苷酸鈉鹽的合成法如下a.四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖醛酸甲酯的制備取葡糖醛酸內(nèi)酯87.5g(0.5mol)，加入1mol/L甲醇鈉15ml和無水甲醇485ml混合物，攪拌2h。減壓蒸去甲醇，得糖漿。加入醋酸酐330ml，冰浴下滴加吡啶110ml，滴加溫度在20℃以下，放冷，過濾粗品，用95％乙醇洗滌，再用95％乙醇重結(jié)晶脫色，得針狀結(jié)晶四-O-乙?；?β-D-吡喃葡糖醛酸甲酯63.8g，產(chǎn)率35％，mp178-179℃。b.三-O-乙?；?α-D-溴代吡喃葡糖醛酸甲酯的制備取紅磷9g，加90ml冰醋酸，冰浴攪拌下滴加54g(18ml)溴，維持20℃滴加，靜止30min，過濾得橙黃色溴試劑，冰箱密封備用。取四-O-乙?；?D-葡糖醛酸甲酯20g，加入溴試劑80ml，室溫攪拌溶解，冰箱過夜，次日在15毫米汞柱下，減壓濃縮殘留物用80ml氯仿溶解，先用水洗，再用飽和的碳酸氫鈉溶液洗，分離氯仿層，用無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸去氯仿，得糖漿。加少量無水甲醇溶解，放入冰箱凍室過夜，次日析出結(jié)晶三-O-乙酰基-α-D-溴代葡糖醛酸甲酯12.8g，產(chǎn)率62％，mp104-106℃(文獻(xiàn)106-107℃)(冰箱密封保存)。c.對-硝基苯-三-O-乙?；?β-D-葡糖苷酸甲酯的合成取三-O-乙?；?α-D-溴代吡喃葡糖醛酸甲酯11.4g對-硝基苯8g，乙腈50ml，攪拌下緩緩加入新鮮的氧化銀7.2g，攪拌2-3小時，過濾銀鹽，并用乙腈洗滌，合并濾液。減壓蒸去乙腈，得糖漿，加無水乙醇，活性碳脫色，過濾，于冰箱內(nèi)過夜，析晶，得閃亮結(jié)晶對-硝基苯-三-O-乙?；?β-D-葡糖苷酸甲酯6g，產(chǎn)率46.3％，mp154-155℃(文獻(xiàn)154℃)。d.對硝基苯-β-D-葡糖苷酸鈉鹽的制備取對-硝基苯-三-O-乙?；?β-D-葡糖苷酸甲酯6g，加入0.2mol/L氫氧化鈉20倍量(v/w)，4倍量95％乙醇，攪拌反應(yīng)，不斷補加氫氧化鈉溶液，反應(yīng)物溶解，共8小時，減壓濃縮，得到對-硝基苯-β-D-葡糖苷酸鈉鹽固體。水-乙醇精制后得3.7g，收率81％，220℃(分解)(文獻(xiàn)220℃分解)。分子式C2H12NO9Na·H2O，分子量355.2元素分析理論值C 40.50％，H 3.38％，N 3.94％實測值C 40.16％，H 3.68％，N 3.93％IRKBrmax(cm-1)3200，3368(-OH)，1618(-COOH)，1239(C-O)1537，1394(C-NO2)HNMR(200MC，TMS內(nèi)標(biāo)，P20溶劑)δ3.62(m，3H)，3.91(m，1H)，5.25(d，1H)，7.22(d，2H)，8.23(d，2H)
全文摘要
本發(fā)明是一種大腸桿菌和大腸菌群試劑盒及底物的合成方法。它是以底物PNP－β－D－葡糖苷酸鈉制成底物片,以膽鹽乳糖增菌液制成培養(yǎng)基片,以磷酸鹽配制成0.2mol/L pH緩沖液。組成兩片一水的試劑盒。為快速、準(zhǔn)確、方便地檢測提供了一個新的手段。
文檔編號C12Q1/10GK1361288SQ0013677
公開日2002年7月31日 申請日期2000年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月29日
發(fā)明者孫家莉, 米沙, 王金良 申請人:天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所, 天津市公安醫(yī)院