專利名稱：一種生產(chǎn)克隆牛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的
背景技術(shù)：
30年來(lái)，已知只可能在兩棲動(dòng)物中克隆受精卵，但目前已成功地在小鼠中通過(guò)置換單細(xì)胞受精卵的前核生產(chǎn)出克隆的子代(見(jiàn)McGrath和Solter，科學(xué)，220:1300-1302,1983)。雖然在克隆動(dòng)物上有了這個(gè)首例成功，畜牧業(yè)上的同樣成功(見(jiàn)Wakayama等，自然，394:369-374,1998)卻報(bào)告得相當(dāng)晚，因?yàn)橛?-細(xì)胞期后的成熟卵母細(xì)胞和受精卵裂球生產(chǎn)克隆小鼠有幾個(gè)問(wèn)題，例如重編程序的減少等。
有關(guān)通過(guò)核轉(zhuǎn)移生產(chǎn)克隆牲畜，首例報(bào)告是通過(guò)用8-到16-細(xì)胞受精卵的裂球作供體細(xì)胞生產(chǎn)綿羊的子代(見(jiàn)Wiladsen，自然，320:63-65,1986)。此后，據(jù)認(rèn)為通過(guò)核轉(zhuǎn)移只能克隆具有全能性的受精卵，籍此細(xì)胞可分化成每一個(gè)單細(xì)胞。然而，經(jīng)過(guò)持續(xù)的研究工作，首例克隆綿羊是通過(guò)導(dǎo)入體細(xì)胞核生產(chǎn)的(見(jiàn)wilmut等，自然，385:810-813,1997)，從而糾正了在先的發(fā)育理論，并使得在生產(chǎn)克隆牛(見(jiàn)Welk，等，Reprod.Fertil.And Develop.,10:369-378,1998)和豬方面出現(xiàn)了成功例的報(bào)告。
但是現(xiàn)有技術(shù)的方法被證實(shí)通過(guò)核轉(zhuǎn)移生產(chǎn)胚胎的產(chǎn)出量低下，在這個(gè)意義上是不太令人滿意的，其結(jié)果是克隆動(dòng)物的生產(chǎn)率低下。
在此情況下，有強(qiáng)烈的理由探索和開(kāi)發(fā)一種改進(jìn)的方法，按照通過(guò)核轉(zhuǎn)移生產(chǎn)胚胎的思想生產(chǎn)體細(xì)胞衍生的胚胎。
因此本發(fā)明的首要目的是提供一種通過(guò)體細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移生產(chǎn)克隆牛的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過(guò)所述方法生產(chǎn)的克隆牛胚胎。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供通過(guò)所述方法生產(chǎn)的體細(xì)胞衍生的克隆牛。
圖2是一張照片，表示用一根持定(細(xì)玻璃)管和一根切割(細(xì)玻璃)管切割受體卵母細(xì)胞由透明帶的過(guò)程。
圖3是一張照片，表示通過(guò)從受體卵母細(xì)胞取走第一極體和胞核進(jìn)行去核的過(guò)程。
圖4是一張照片，表示用一根持定管和一根注射管把體細(xì)胞移入去核的卵母細(xì)胞的過(guò)程。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明生產(chǎn)克隆牛的方法包含以下步驟制備從牛身上采集的供體體細(xì)胞系；在體外將從卵巢采集到的卵母細(xì)胞培育成熟；去掉卵母細(xì)胞周圍的丘(cumulus)細(xì)胞，切割成熟的卵母細(xì)胞透明帶的一部分并且擠出部分包括第一極體的胞質(zhì)，以得到去核受體卵母細(xì)胞；通過(guò)把供體細(xì)胞注射進(jìn)去核卵母細(xì)胞把核移入受體的卵母細(xì)胞，然后通過(guò)隨后的電融合和激活電融合后的細(xì)胞得到胚胎；后激活并且在體外培養(yǎng)胚胎；然后把培養(yǎng)的胚胎移入代孕母牛以生產(chǎn)克隆牛犢。
本發(fā)明的生產(chǎn)克隆牛的方法進(jìn)一步說(shuō)明如下。步驟1制備供體細(xì)胞把從牛身上采集的體細(xì)胞系制備成供體細(xì)胞。盡管沒(méi)有限制供體細(xì)胞的牛的品種，但優(yōu)選用韓國(guó)牡牛(Bos taurus coreane)和荷蘭牛(Bostaurus)制備供體細(xì)胞。從牛身上采集的細(xì)胞系包括從子宮沖洗液、子宮內(nèi)膜、輸卵管、耳或者肌肉、丘細(xì)胞或者胎兒成纖維細(xì)胞采集的細(xì)胞，可使用常規(guī)的公知方法稍加改動(dòng)后，制備這些細(xì)胞系(Mather&Barnes，細(xì)胞生物學(xué)方法，第57卷，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法，Academic Press,1998)。
例如，通過(guò)在子宮沖洗液中加入含1％青霉素-鏈霉素(Gibco；每毫升10000單位青霉素，每毫升10毫克鏈霉素)磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)然后離心采集細(xì)胞。從子宮沖洗液中采集的細(xì)胞在補(bǔ)充了非必需氨基酸、10％的胎牛血清(FBS)和1％青霉素-鏈霉素的Dulbecco改進(jìn)的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中，在39℃、5％的CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。
從子宮內(nèi)膜或者輸卵管采集的子宮上皮細(xì)胞用所述的PBS清洗、胰蛋白酶處理、然后在與上述相同的條件下培養(yǎng)。
對(duì)于丘細(xì)胞，用透明質(zhì)酸酶溶液處理丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體以分離卵母細(xì)胞周圍的丘細(xì)胞。在39℃、5％的CO2的環(huán)境下用胰蛋白酶處理丘細(xì)胞30到60分鐘以后再以與上述相似的方式培養(yǎng)。
有關(guān)耳成纖維細(xì)胞和胎牛成纖維細(xì)胞，它們分別從包在軟骨組織上的皮層的內(nèi)側(cè)和胎牛肢和體收集的組織得到在無(wú)菌條件下清洗和破碎這些組織，然后用胰蛋白酶及Ⅱ型膠原蛋白酶在39℃、5％的CO2的環(huán)境下處理。這些細(xì)胞也以類似于上述的供體體細(xì)胞系的方式培養(yǎng)。
體細(xì)胞系由傳代培養(yǎng)、血清饑餓培養(yǎng)或者冷凍方法儲(chǔ)存。供體細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)定期地通過(guò)在胰蛋白酶處理后用新的培養(yǎng)基代替舊的培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行。血清饑餓培養(yǎng)通過(guò)施用補(bǔ)充0.5％FBS的DMEM以Wilmut等的方法進(jìn)行(見(jiàn)Wilmut等，自然385:810-813.1997)。這樣儲(chǔ)存的細(xì)胞系在后面的步驟中用作供體細(xì)胞。步驟2制備受體卵母細(xì)胞在體外將從卵巢采集的不成熟的卵母細(xì)胞培育成熟從含有10mM N-羥乙基哌嗪-N｀-［2-乙基磺酸](HEPES)的TCM199清洗介質(zhì)中的卵巢中選擇不成熟的卵母細(xì)胞，然后在補(bǔ)充了雌二醇、FSH(促卵泡激素)和FBS的TCM199培養(yǎng)基(含丙酮酸鈉青霉素-鏈霉素)中在39℃、5％的CO2的環(huán)境下培養(yǎng)16至22小時(shí)使上述卵母細(xì)胞成熟。步驟3受體卵母細(xì)胞的去核去掉成熟的受體卵母細(xì)胞周圍的丘細(xì)胞并且切除卵母細(xì)胞的部分透明帶之后，從卵母細(xì)胞中去掉部分包括第一極體的胞質(zhì)，以得到去核的卵母細(xì)胞首先用一個(gè)剝脫管從含有透明質(zhì)酸酶的TCM199清洗介質(zhì)中物理去除成熟的卵母細(xì)胞周圍的丘細(xì)胞。然后用TCM199清洗介質(zhì)清洗剝脫了的卵母細(xì)胞，并且把它們移入細(xì)胞松馳素B溶液。為了對(duì)剝脫的細(xì)胞去核，用一根切割管穿刺剝脫了的卵母細(xì)胞的透明帶的一部分，以得到一個(gè)裂隙，從此裂隙可以把包括第一極體的10％到15％胞質(zhì)從卵母細(xì)胞擠出。清洗去核的卵母細(xì)胞，并且在TCM199培養(yǎng)基介質(zhì)中培養(yǎng)。所述細(xì)胞松馳素B溶液是通過(guò)用TCM199培養(yǎng)基介質(zhì)稀釋溶解在DMSO(二甲基亞砜)溶液中的細(xì)胞松馳素B溶液制備的。步驟4電融合供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞并且激活電融合的細(xì)胞將供體細(xì)胞移入到受體卵母細(xì)胞中，接著進(jìn)行電融合并且激活電融合的細(xì)胞在把供體細(xì)胞注射進(jìn)受體卵母細(xì)胞前，用TCM199培養(yǎng)基介質(zhì)清洗去核的卵母細(xì)胞并且把它們移到PHA-P(植物血凝素)溶液中。然后通過(guò)把供體細(xì)胞注射到PHA-P溶液中的去核的卵母細(xì)胞的透明帶上造成的裂口中，把供體細(xì)胞移到去核的卵母細(xì)胞中。
使用電細(xì)胞操作器(BTX ECM2001)進(jìn)行電融合。把放在補(bǔ)充以TCM199清洗液的甘露醇溶液中的重建的胚胎放在有兩個(gè)電極的室中，這兩個(gè)電極在此室的每側(cè)各有一個(gè)。在將胚胎放在所述室中以其供體細(xì)胞對(duì)著陰極之前，在所述室充以甘露醇溶液。用間隔1秒每次15微秒的0.75到2.00千伏/厘米的兩次直流脈沖對(duì)胚胎進(jìn)行電融合后，用甘露醇溶液和TCM199清洗液清洗電融合的胚胎，在細(xì)胞松馳素B溶液中保溫，并且激活。如果電融合在含鈣離子的甘露醇介質(zhì)中進(jìn)行，電融合和激活同時(shí)發(fā)生。不然，激活在電融合后進(jìn)行。當(dāng)電融合在不含鈣離子的甘露醇介質(zhì)中進(jìn)行時(shí)，激活步驟通過(guò)在離子霉素溶液中黑暗中保溫胚胎進(jìn)行。然后通過(guò)用含有FBS或者BSA的TCM199清洗介質(zhì)清洗胚胎去除其中的離子霉素。所述離子霉素溶液通過(guò)用含有BSA的TCM199清洗介質(zhì)稀釋溶解在DMSO中的離子霉來(lái)制備。步驟5胚胎的后激活和體外培養(yǎng)胚胎后激活和體外培養(yǎng)通過(guò)在放線菌酮溶液或者4-二甲氨基嘌呤(DAMP)溶液中保溫后激活在含有FBS或者BSA的TCM199清洗介質(zhì)中保溫的激活的胚胎，并且在5％的CO2或在5％CO2、7％O2和88％N2的混合氣體環(huán)境下進(jìn)行體外培養(yǎng)。所述的放線菌酮溶液或者DAMP溶液通過(guò)在體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加溶解在乙醇中的放線菌酮或者DAMP制備。體外培養(yǎng)的介質(zhì)包括mTALP(見(jiàn)表1)、mSOF(見(jiàn)表2)和mCR2aa(見(jiàn)表3)介質(zhì)，它們都含有NaCl、KCl、NaHCO3、NaH2PO4、CaCl2、乳酸鈉、葡萄糖、酚紅、BSA、卡那霉素、必需氨基酸、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺。
可選擇地，冷凍保存體外培養(yǎng)的胚胎備以后使用，并且在打算使用時(shí)解凍。為了冷凍胚胎，用含有FBS的PBS清洗之，放入含有青霉素-鏈霉素、CaCl2、葡萄糖、MgCl2、丙酮酸鈉和PBS的冷凍培養(yǎng)基中。然后將冷凍培養(yǎng)基中的胚胎緩慢冷凍，接著在液氮中快速冷凍。當(dāng)冷凍的胚胎從液氮中取出并且解凍時(shí)，將它們?cè)诳諝庵蟹胖眉s5秒鐘然后在溫水中解凍。為了從解凍的胚胎中去掉冷凍介質(zhì)，將它們依次地放進(jìn)從含有高濃度甘油到含有低濃度的甘油的系列介質(zhì)中。
表1mTALP介質(zhì)


表2mSOF介質(zhì)

見(jiàn)表3mCR2aa介質(zhì)

步驟6生產(chǎn)克隆牛將體外培養(yǎng)的胚胎移入代孕母牛將在含有FBS的PBS中的胚胎植入代孕母牛的子宮。
基于上述的方法，本發(fā)明通過(guò)分別用韓國(guó)牡牛和荷蘭牛的耳細(xì)胞作為胞核供體，制備了胚胎，即韓國(guó)牡牛胚胎/TcEar和SNU2(牛NT胚胎)。這兩種胚胎分別于1999年12月31日和2000年3月10日在國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，韓國(guó)KRIBB#52,OUNDONG,YUSONG-KU,TAEJON,305-33)保藏，保藏號(hào)分別為KCTC0719BP和KCTC0753BP。本發(fā)明還涉及通過(guò)把這些胚胎移入代孕母牛得到正常的克隆子代。
現(xiàn)在以以下各實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例并不用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1制備供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞為了制備供體細(xì)胞，從韓國(guó)牡牛的耳朵皮膚內(nèi)側(cè)的采集組織，用PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水，Gibco氏BRL，美國(guó)Life Technology)洗滌，然后粉碎到100目。然后在39℃、5％CO2的環(huán)境下在含有0.25％的胰蛋白酶、1mM的EDTA和1毫克/毫升的Ⅱ型膠原蛋白酶的PBS中將組織保溫1小時(shí)，在組織被酶消化后，以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心兩分鐘，然后懸浮在補(bǔ)充了10％FBS、1％NEAA(非必要氨基酸)、和1％青霉素-鏈霉素的DMEM(Dulbecco氏改進(jìn)的Eagle氏培養(yǎng)基，Gibco氏BRL，美國(guó)Life Technology)中。懸浮液移入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在39℃、5％CO2環(huán)境下保溫以得到體細(xì)胞系。此后細(xì)胞在含有0.25％的胰蛋白酶和1mM的EDTA的溶液中進(jìn)行胰蛋白酶處理，然后把細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)到2×104個(gè)細(xì)胞/毫升以在Eppendorf管中等分細(xì)胞。


圖1表示分離為單個(gè)細(xì)胞以用作胞核供體的體細(xì)胞。
另一方面，為得到受體卵母細(xì)胞，用帶有18G針頭的10毫升注射器從韓國(guó)牡牛的卵巢吸取直徑約2到6毫米左右的卵泡。然后，把卵泡液移入底部畫有格條的(線間寬度為1厘米)的100毫米平皿中，然后篩選有均勻胞質(zhì)并且周圍有足夠數(shù)量的丘細(xì)胞層的卵母細(xì)胞。選出的卵母細(xì)胞在35毫米平皿中用2毫升TCM199清洗培養(yǎng)基(表4)清洗三次，接著用TCM199培養(yǎng)基(表5)清洗一次。最后在含有0.1％雌二醇溶液(表6)、2.5％促卵泡激素溶液(表7)和10％FBS的TCM199培養(yǎng)基中培養(yǎng)卵母細(xì)胞，以得到受體卵母細(xì)胞。
表4TCM199清洗介質(zhì)

表5TCM199介質(zhì)

表6雌二醇溶液

表7促卵泡激素溶液

實(shí)施例2體細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移實(shí)施例1中制備的受體卵母細(xì)胞用TCM199清洗介質(zhì)清洗，然后移入通過(guò)1毫升的TCM199清洗介質(zhì)與111微升的透明質(zhì)酸酶原液(在TCM199清洗介質(zhì)中每毫升10毫克)混合制備的0.1％透明質(zhì)酸酶(美國(guó)Sigma Chemical Co.)溶液。在0.1％透明質(zhì)酸酶環(huán)境下從卵母細(xì)胞去掉丘細(xì)胞之后，把剝脫后的卵母細(xì)胞清洗三次并且在TCM199清洗介質(zhì)中培養(yǎng)。然后把移入通過(guò)含有10％FBS的1毫升TCM199清洗介質(zhì)與1微升的細(xì)胞松馳素B(在DMSO每毫升7.5毫克)混合制備的細(xì)胞松馳素B(美國(guó)Sigma Chemical Co.)溶液，用一根切割管刺開(kāi)每個(gè)卵母細(xì)胞的透明帶的一部分，以得到一個(gè)裂隙，從此裂隙可以把胞質(zhì)的10％到15％從卵母細(xì)胞擠出，以得到去核的卵母細(xì)胞。制備去核的卵母細(xì)胞的步驟更具體地說(shuō)明如下把工作盤放在微型操作器上，在微操作器的左臂上裝備有一根持定管，在其右臂上裝備有一根切割管。然后分別把持定管和切割管沿9點(diǎn)鐘和3點(diǎn)鐘的方向放置，并且通過(guò)在中間放置一個(gè)微管控制器把它們調(diào)節(jié)得可以沿各方向自由運(yùn)動(dòng)。進(jìn)一步把兩個(gè)微管調(diào)節(jié)得不能接觸到工作盤，并且通過(guò)在微滴管上方上下移動(dòng)使它們的尖端放在微滴管的中間。然后用一個(gè)洗口管(內(nèi)徑大于200微米)把卵母細(xì)胞移入細(xì)胞松馳素B溶液。首先用其粗調(diào)鈕和細(xì)調(diào)鈕把微操作器聚焦在卵母細(xì)胞上。卵母細(xì)胞放置得以其第一極體沿卵母細(xì)胞的12點(diǎn)鐘方向，然后把持定管沿卵母細(xì)胞的9點(diǎn)鐘方向放置得緊靠卵母細(xì)胞以通過(guò)加液壓固定卵母細(xì)胞。圖2表示用持定管和切割管切割卵母細(xì)胞的透明帶。如圖2所示，卵母細(xì)胞用切割管(2)從1點(diǎn)鐘的方向向11點(diǎn)鐘的方向切割，特別小心不要損傷卵母細(xì)胞的胞質(zhì)。此后向持定管(1)施加液壓以分開(kāi)卵母細(xì)胞(3)，然后將持定管與靠著第一極體上部刺穿透明帶的切割管接觸，以通過(guò)磨擦兩個(gè)管切割部分透明帶。上述在卵母細(xì)胞上造的裂口既用于去核也用于供體注射。圖3表示從卵母細(xì)胞去掉第一極體和胞核的過(guò)程。如圖3所示，使卵母細(xì)胞(3)以其裂口豎直取向放置，用持定管(1)持定其下部以防止移動(dòng)，然后用切割管(2)輕擠其上部以得到去核的卵母細(xì)胞。去核的卵母細(xì)胞用TCM199清洗介質(zhì)清洗三次，然后在TCM199培養(yǎng)基介質(zhì)中保溫。
此后，用微操作器把事先制備好的供體細(xì)胞移入去核的卵母細(xì)胞。首先用400微升TCM199清洗液和100微升PHA-P(植物血凝素)原液(在TCM199清洗液中0.5毫克/毫升)混合制備的PHA-P溶液在大工作盤的中間做一個(gè)4微升的注射微滴。然后，用含有1％FBS的PBS做兩個(gè)供體細(xì)胞的微滴，一個(gè)在同一工作盤上的注射微滴之上，一個(gè)在其下。在這些微滴上涂復(fù)礦物油之后，把工作盤放在微操作器臺(tái)上。
用一個(gè)注射管代替安裝在微操作器上的切割管。去核的卵母細(xì)胞用TCM199清洗介質(zhì)清洗三次，然后移入注射微滴。把供體細(xì)胞吸入注射管然后移入注射微滴。圖4表示把一個(gè)體細(xì)胞移入去核的卵母細(xì)胞的過(guò)程。如圖4所示，去核的卵母細(xì)胞以其裂口取向?yàn)?點(diǎn)鐘放置，用持定管持定，然后用注射管和液壓經(jīng)此裂口注射進(jìn)供體細(xì)胞，以得到重建的胚胎。把胚胎用TCM199清洗介質(zhì)清洗三次，然后在TCM199清洗介質(zhì)中保溫。實(shí)施例3電融合和激活電融合和激活重建的胚胎使用電細(xì)胞操作器(美國(guó)，BTX,ECM2001)進(jìn)行電融合，然后再激活。用一個(gè)洗口管在含有重建的胚胎的TCM199培養(yǎng)基介質(zhì)中加入15微升含有0.28M甘露醇、0.5Mmhepes(pH7.2)、0.1mMMgSO4和0.05％BSA的甘露醇溶液。在所述介質(zhì)中保溫1分鐘之后，將胚胎放在補(bǔ)充以TCM199清洗液的甘露醇溶液中培養(yǎng)1分鐘，最后用洗口管將胚胎移入甘露醇溶液。ElectroCeil Manipulator的室(3.2毫米的453號(hào)室)中充灌補(bǔ)充以TCM199清洗液的甘露醇溶液，然后將所述胚胎放在所述室中以使其供體細(xì)胞對(duì)著陰極。用間隔1秒每次15微秒的0.75到2.00千伏/厘米的兩次直流脈沖對(duì)胚胎進(jìn)行電融合后，借助于甘露醇溶液將胚胎移入TCM199清洗液，并且用TCM199清洗液清洗三次。
為進(jìn)行激活，把胚胎在離子霉素(美國(guó)Sigma Chemical Co.)溶液中黑暗中培養(yǎng)4分鐘，這是一種含有5μM離子霉素和1％的BSA的TCM199清洗液。所述離子霉素原液通過(guò)在1.34毫升的DMSO溶解1毫克的離子霉素制備。激活的胚胎在含補(bǔ)充以10％FBS的TCM199清洗介質(zhì)的35毫米平皿中保溫5分鐘以從胚胎洗去離子霉素。實(shí)施例4后激活和體外培養(yǎng)電融合的胚胎激活的胚胎在25微升的放線菌酮(美國(guó)Sigma Chemical Co.)溶液中后激活4個(gè)小時(shí)，所述的放線菌酮溶液是通過(guò)在體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基介質(zhì)mTALP中添加放線菌酮原液(10毫克/毫升在乙醇中)中，稀釋到10微克/毫升來(lái)制備。然后篩選胚胎，將選出的胚胎在39℃溫度，5％的CO2環(huán)境下培養(yǎng)7天。
在應(yīng)用實(shí)施例1至4所述的方法時(shí)，本發(fā)明人通過(guò)使用韓國(guó)牡牛的耳朵的細(xì)胞作為核供體，生產(chǎn)一種韓國(guó)牡牛胚胎，并且于1999年12月31日在國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，韓國(guó)KRIBB#52,OUNDONG,YUSONG-KU,TAEJON,305-333)保藏，保藏號(hào)為KCTC0719BP。實(shí)施例5利用荷蘭牛的耳細(xì)胞生產(chǎn)胚胎本發(fā)明人用實(shí)施例1至4所述的同樣方法生產(chǎn)另一種胚胎SNU2(牛NT胚胎)，不同是的分別用荷蘭牛的耳細(xì)胞和卵母細(xì)胞作為胞核供體和受體卵母細(xì)胞。并且于2000年3月10日在國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，韓國(guó)KRIBB#52,OUNDONG,YUSONG-KU,TAEJON,305-333)保藏，保藏號(hào)為KCTC0753BP。實(shí)施例6胚胎的冷凍和解凍及植入冷凍胚胎以長(zhǎng)期保存。首先在35毫米平皿中分布一種冷凍介質(zhì)(見(jiàn)表8和9)，調(diào)節(jié)冰箱維持到-5℃。選作冷凍的胚胎用含有10％FBS的PBS清洗，放入冷凍介質(zhì)中保溫20分鐘。然后，把胚胎吸入到0.25毫升的法式吸管中使含有胚胎的冷凍介質(zhì)處在吸管的中間，而吸管的兩側(cè)是空氣。在用一個(gè)加熱了的鉗子密封了吸管的兩端后，把它放進(jìn)冰箱，在-5℃保持5分鐘。然后用一把預(yù)冷鉗子種入液氮中速凍。在種入后，以-0.3℃/分鐘的速度冷凍到-30℃，在溫度達(dá)到-30℃時(shí)保持10分鐘。最后把胚胎儲(chǔ)存在液氮罐中。
表8冷凍PBS

表9冷凍介質(zhì)

為使冷凍的胚胎解凍，在35毫米平皿中制備含有補(bǔ)充以20％的FBS的PBS解凍介質(zhì)，并且加上甘油以得到各有0％、3％和6％甘油的解凍介質(zhì)(見(jiàn)表8和10)。然后從液氮中取出冷凍的吸管，在空氣中保持5秒鐘，然后在含有溫水(30℃)的容器(直徑大于20厘米)中解凍。在解凍后，把吸管在其兩端的空氣層處切割開(kāi)，然后收集含有胚胎的介質(zhì)。在顯微鏡下檢查胚胎。為了從胚胎去掉冷凍介質(zhì)，把它們相繼地在含有6％甘油、3％甘油和0％甘油的解凍介質(zhì)中各保溫5分鐘。
表10解凍介質(zhì)

把解凍的胚胎放入含有20％的FBS的PBS中，然后吸入0.25ml吸管。然后把它移入代孕母牛的子宮。實(shí)施例7比較應(yīng)用不同胞核供體的胚胎為了比較應(yīng)用不同胞核供體制造的胚胎的區(qū)別，將分別在實(shí)施例4和實(shí)施例5中產(chǎn)生的韓國(guó)牡牛胚胎/TcEar(KCTC0719BP)和SNU2(KCTC0753BP)移入代孕母牛的子宮，然后就以下各項(xiàng)進(jìn)行比較電融合的卵母細(xì)胞數(shù)、電融合率(％)、分裂率(％)、桑椹胚/胚泡發(fā)育數(shù)(％)、轉(zhuǎn)移胚胎數(shù)和子代率(％)(見(jiàn)表11)。桑椹/胚泡發(fā)育數(shù)(％)代表剛好在植入前階段的由核轉(zhuǎn)移生產(chǎn)的總胚胎數(shù)中由體外培養(yǎng)發(fā)育的胚胎數(shù)的比率。
表11胚胎的比較

如表11所示就兩個(gè)方面在胚胎的生產(chǎn)和培養(yǎng)方面的比較而言，在用作核供體的韓國(guó)牡牛和荷蘭牛牛的耳細(xì)胞之間沒(méi)有顯著的區(qū)別。這個(gè)結(jié)果表明，本發(fā)明的生產(chǎn)克隆牛的方法可以沒(méi)有任何特殊性地用于其它的牛種。除了可以廣泛地應(yīng)用核供體之外，本發(fā)明的方法可以顯著地提高重建胚胎的產(chǎn)量，因?yàn)樯ｉ┡?胚泡發(fā)育數(shù)(％)和本發(fā)明的傳遞率遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)(見(jiàn)Goto等，Anim.Sci.Journal,70:243-245,1999；Zakhartchenko等，J.Reprod.Fertil.,115:325-331,1999；Hill等，Biol.Reprod.,62:1135-1140,2000；Kubota等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,94:990-995,2000)。實(shí)施例8用韓國(guó)牡牛的子宮細(xì)胞作胞核供體以生產(chǎn)胚胎用與實(shí)施例1至4所述的過(guò)程生產(chǎn)胚胎，不同的是供體細(xì)胞從韓國(guó)牡牛的子宮分離。實(shí)施例9比較采用不同的供體組織的胚胎為了比較采用不同的供體組織的胚胎，分別地把實(shí)施例4和8中生產(chǎn)的胚胎植入代孕母牛，如實(shí)施例6所述，并且以與實(shí)施例7相同的方法檢查(見(jiàn)表12)。
表12取決于胞核供體來(lái)源的胚胎發(fā)育率

如表12所示就兩個(gè)方面在胚胎的生產(chǎn)和培養(yǎng)方面的比較而言，在用作供體細(xì)胞之間不同的組織沒(méi)有顯著的區(qū)別。這個(gè)結(jié)果表明，本發(fā)明的生產(chǎn)克隆牛的方法可以用于許多細(xì)胞類型而不是只用于特定的體細(xì)胞。
如以上清楚地表示和說(shuō)明，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)克隆牛的方法，其包含以下步驟在體外將供體卵母細(xì)胞培育成熟；制備供體體細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞；核轉(zhuǎn)移；電融合和續(xù)后激活；后激活并且在體外培養(yǎng)胚胎；然后把培養(yǎng)的胚胎移入代孕母牛。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)克隆牛的方法，可以通過(guò)應(yīng)用經(jīng)高度改進(jìn)的胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)得到的重建胚胎生產(chǎn)由體細(xì)胞衍生克隆牛，使之可能大批量生產(chǎn)醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)的藥品和器官，并且方便其在許多其它相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
閱讀以上說(shuō)明后，本領(lǐng)域內(nèi)的一般技術(shù)人員可以對(duì)本文所示和所述進(jìn)行種種修改。這樣的修改也落入本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。有關(guān)微生物及其它生物材料的保藏證明(PCT細(xì)則13之二)


PCT/RO/134表有關(guān)微生物及其它生物材料的保藏證明(PCT細(xì)則13之二)


PCT/RO/134表
權(quán)利要求
1．一種生產(chǎn)克隆牛的方法，該方法包括以下步驟(Ⅰ)制備從牛身上采集的供體體細(xì)胞系；(Ⅱ)在體外將從卵巢采集的卵母細(xì)胞培育成熟；(Ⅲ)去掉卵母細(xì)胞周圍的丘細(xì)胞，切割成熟的卵母細(xì)胞透明帶的一部分以產(chǎn)生裂口并且通過(guò)該裂口擠出部分包括第一極體的胞質(zhì)，以得到去核受體卵母細(xì)胞；(Ⅳ)通過(guò)把供體細(xì)胞注射進(jìn)去核受體卵母細(xì)胞而將一個(gè)核移入受體的卵母細(xì)胞，并通過(guò)隨后的電融合和激活電融合后的細(xì)胞得到胚胎；(Ⅴ)后激活并且在體外培養(yǎng)胚胎；(Ⅵ)然后把培養(yǎng)的胚胎移入代孕母牛以生產(chǎn)克隆牛犢。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆牛的方法，其中所述制備體細(xì)胞系的步驟(Ⅰ)包括從子宮沖洗液、子宮內(nèi)膜、輸卵管、耳或者肌肉、丘細(xì)胞或者胎兒成纖維細(xì)胞采集的細(xì)胞。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆牛的方法，其中所述體細(xì)胞系通過(guò)傳代培養(yǎng)、血清饑餓培養(yǎng)或者冷凍來(lái)保存。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆牛的方法，其中所述步驟(Ⅲ)中，在透明質(zhì)酸酶處理后用剝脫管物理去掉卵母細(xì)胞周圍的丘細(xì)胞。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆牛的方法，其中所述步驟(Ⅲ)中，卵母細(xì)胞去核是通過(guò)用微操作器切割卵母細(xì)胞以在卵母細(xì)胞上造成一個(gè)裂口；將卵母細(xì)胞以其裂口豎直取向并且用一根持定管持定卵母細(xì)胞的下部以防止它移動(dòng)；用一根切割管經(jīng)此裂口把包括第一極體的10％到15％胞質(zhì)從卵母細(xì)胞中擠出。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆牛的方法，其中所述步驟(Ⅳ)中的胞核轉(zhuǎn)移是通過(guò)經(jīng)在卵母細(xì)胞的透明帶上造成的裂口，將供體細(xì)胞注射進(jìn)入去核的受體卵母細(xì)胞進(jìn)行的。
7．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆牛的方法，其中所述步驟(Ⅳ)中電融合是通過(guò)間隔1秒每次15微秒施加的0.75到2.00千伏/厘米的兩次直流脈沖進(jìn)行的。
8．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆牛的方法，其中所述步驟(Ⅳ)中，如果電融合在含鈣離子的介質(zhì)中進(jìn)行，激活步驟和電融合同時(shí)發(fā)生。
9．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆牛的方法，其中所述步驟(Ⅳ)中，如果電融合在不含鈣離子的介質(zhì)中進(jìn)行，激活步驟在離子霉素溶液中在黑暗中進(jìn)行。
10．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆牛的方法，其中所述步驟(Ⅴ)中的后激活通過(guò)在放線菌酮溶液或者DAMP(4-二甲氨基嘌呤)溶液中培養(yǎng)胚胎而進(jìn)行。
11．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆牛的方法，其中所述步驟(Ⅴ)中的體外培養(yǎng)是通過(guò)在mTALP、mSOF或者mCR2aa介質(zhì)中培養(yǎng)后激活的胚胎進(jìn)行的。
12．根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)克隆牛的方法，其進(jìn)一步包括儲(chǔ)存在步驟(Ｖ)中經(jīng)體外培養(yǎng)的胚胎以備后用的步驟，此步驟是在含有青霉素-鏈霉素、CaCl2、葡萄糖、MgCl2、丙酮酸鈉和磷酸鹽緩沖的鹽水的冷凍介質(zhì)中冷凍后進(jìn)行的。
13．一種胚胎，韓國(guó)牡牛胚胎/TcEar(KCTC 0719BP)，它是通過(guò)權(quán)利要求1的步驟(Ⅰ)到(Ⅴ)，分別用韓國(guó)牡牛的耳細(xì)胞和卵母細(xì)胞作為胞核供體和受體卵母細(xì)胞生產(chǎn)的。
14．一種胚胎，SNU2(牛NT胚胎，KCTC 07531BP)，它是通過(guò)權(quán)利要求1的步驟(Ⅰ)到(Ⅴ)，分別用荷蘭牛的耳細(xì)胞和卵母細(xì)胞作為胞核供體和受體卵母細(xì)胞生產(chǎn)的。
15．一種克隆牛，它是通過(guò)用權(quán)利要求13所述的韓國(guó)牡牛胚胎/TcEar(KCTC 0719BP)作為胚胎，經(jīng)權(quán)利要求1的步驟(Ⅵ)生產(chǎn)的。
16．一種克隆牛，它是通過(guò)用權(quán)利要求14所述的SNU2(牛NT胚胎，KCTC 07531BP)作為胚胎，經(jīng)權(quán)利要求1的步驟(Ⅵ)生產(chǎn)的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種應(yīng)用體外培育成熟卵母細(xì)胞和胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)生產(chǎn)克隆牛的方法。本發(fā)明的生產(chǎn)克隆牛的方法包含以下步驟:制備從牛身上采集的供體體細(xì)胞系;在體外將從卵巢采集的卵母細(xì)胞培育成熟;去掉卵母細(xì)胞周圍的丘細(xì)胞,切割成熟的卵母細(xì)胞透明帶的一部分并且擠出部分包括第一極體的胞質(zhì),以得到去核受體卵母細(xì)胞,通過(guò)把供體細(xì)胞注射進(jìn)去核卵母細(xì)胞而把核移入受體的卵母細(xì)胞,然后通過(guò)隨后的電融合和激活電融合后的細(xì)胞得到胚胎;后激活并且體外培養(yǎng)胚胎;然后把培養(yǎng)的胚胎移入代孕母牛以生產(chǎn)克隆牛犢。所述克隆牛可用于大批量生產(chǎn)醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)的藥品和器官,并且方便其在醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè),以及科學(xué)研究等方面的普遍應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1304443SQ00800602
公開(kāi)日2001年7月18日 申請(qǐng)日期2000年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月30日
發(fā)明者李炳千, 申泰英, 盧湘鎬, 林正默, 樸鐘任, 趙鐘基, 金琪淵, 李殷松, 申秀晶, 金晟基, 宋吉永, 黃禹錫 申請(qǐng)人:黃禹錫