專利名稱：通過在半導(dǎo)體微芯片上進(jìn)行電斑點(diǎn)印跡檢測法分辯單核苷酸多態(tài)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)。具體來說，發(fā)明涉及利用電尋址微芯片檢測SNP。
背景以下給出了與本發(fā)明有關(guān)的大概信息。這不表示文中提供的任何信息是這里要求保護(hù)的發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)，也不表示任何明確或隱含提及的參考文獻(xiàn)對于本發(fā)明是現(xiàn)有技術(shù)。
單核苷酸多態(tài)性(SNP)是構(gòu)成最常見的一類遺傳變異的點(diǎn)突變，在人類基因組中的發(fā)生頻率為0.5-10/1000堿基對。SNP是能引發(fā)人類疾病的穩(wěn)定突變，并可以作為遺傳標(biāo)記。多基因與環(huán)境之間的復(fù)雜關(guān)系使得有必要探尋一個(gè)較大群體中的SNP以便弄清它們對于疾病發(fā)生和進(jìn)展的影響。目前的工作致力于利用高密度陣列、質(zhì)譜、分子信號、肽核酸以及5’核酸酶檢測法通過大規(guī)模圖譜繪制項(xiàng)目來鑒定人類SNP。但這類技術(shù)還未廣泛用于研究和臨床。
SNP基因分型的常規(guī)方法依賴于(1)對PCR擴(kuò)增的材料進(jìn)行基于凝膠的測序，比如Komman等描述過的(臨床雜志24:72-77(1997))，或者(2)限制酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)，比如A.J.Jeffreys等描述過的(細(xì)胞18:1-10(1979))，或者(3)與等位基因特異性寡核苷酸探針(ASO)進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交，比如Malmgren等描述過的(臨床遺傳學(xué)50:202-205(1996))，或者(4)如Schafer等描述的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)(自然生物技術(shù)15:33-39(1995))。其中測序方法雖然有效，但是非常費(fèi)時(shí)，并且可能遇到由二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的假結(jié)果。RFLP通常只包含一部分SNP多態(tài)性。ASO可能需要將熱變性步驟延長時(shí)間，而SSCP不容易實(shí)現(xiàn)自動化。用高密度寡核苷酸陣列作被動雜交已經(jīng)完成了大規(guī)模的SNP基因分型。但是，常規(guī)DNA陣列上的位點(diǎn)無法單個(gè)地控制，必須在整個(gè)陣列上進(jìn)行相同的處理步驟。
我們提供了一種改善SNP檢測技術(shù)的方法，該方法結(jié)合了微電子學(xué)與分子生物學(xué)工藝，其中調(diào)節(jié)微芯片上的電場就能在指定的測試位點(diǎn)對DNA分子進(jìn)行濃縮、雜交和檢測。這個(gè)新方法還利用測試位點(diǎn)的極性反轉(zhuǎn)使單堿基對錯(cuò)配的寡核苷酸和大量測試位點(diǎn)構(gòu)象發(fā)生變性，從而能靈活地設(shè)計(jì)快速高通量地篩選目的基因。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括對含有目的核酸序列的患者樣品中的SNP進(jìn)行多重檢測，比如根據(jù)臨時(shí)需要能對大量樣品進(jìn)行快速SNP基因分型以確定基因亞型。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明包括同時(shí)篩選來自一個(gè)患者樣品的不同基因的多個(gè)SNP。
在此外的一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明包括利用等位基因特異性探針，在此，無論多態(tài)性核苷酸位于等位基因特異性探針的5’、中部、或者3’，都能同樣好地分辨多態(tài)性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法采用將擴(kuò)增靶核酸的一個(gè)鏈標(biāo)記，其中在用于擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增引物上引入標(biāo)記(包括，但不限于，含有生物素的標(biāo)記)來擴(kuò)增所述靶核酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使標(biāo)記的靶擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合到電尋址微芯片上的指定測試位點(diǎn)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括實(shí)時(shí)監(jiān)測電雜交和電嚴(yán)緊的各個(gè)階段從而保證檢測過程中的有效控制。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法使用了基于每秒平均熒光強(qiáng)度(MFI/s)值的熒光雜交模式評判法，包括以下基準(zhǔn)比較陽性和陰性樣品之間信號差異的大小，將任何計(jì)為負(fù)或正的信號分別清楚地統(tǒng)計(jì)為分別在陽性或陰性中觀察到的MFI強(qiáng)度之下或之上。也可以執(zhí)行不同的評分基準(zhǔn)，如比較將陰性、陽性報(bào)告探針給予單個(gè)樣品時(shí)，由兩種探針的相對結(jié)合力產(chǎn)生的信號獲得的MFI/s。在這種情況下，用至少兩個(gè)不同的為與樣品中的特定靶物質(zhì)進(jìn)行雜交而設(shè)計(jì)的報(bào)告探針對樣品進(jìn)行測試。由評判得到的結(jié)果還取決于滲透層的特性和功能性成分的密度，比如抗生物素蛋白或其它結(jié)合基元，或者滲透層成分(比如瓊脂糖或水凝膠)的濃度。
此外，本發(fā)明的方法還有尋址微芯片相對被動陣列技術(shù)的優(yōu)勢，包括a．單個(gè)控制測試位點(diǎn)，從而能在即將檢測前定制測試陣列的構(gòu)象的能力；b．在數(shù)秒內(nèi)對核酸分子進(jìn)行電尋址(即轉(zhuǎn)運(yùn))、濃縮和雜交的能力；c．控制特定測試位點(diǎn)的電嚴(yán)緊，從而能同時(shí)使用同一開放陣列微芯片上的不相干分子的能力；d．將此處公開的方法用于含有數(shù)百個(gè)測試位點(diǎn)的陣列的自動加樣器的能力；以及e．將此處公開的方法用于分析有限數(shù)量細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的RNA表達(dá)的能力。
圖2是電斑點(diǎn)印跡檢測法示意圖。
圖3顯示野生型人甘露糖結(jié)合蛋白(MBP)的有義鏈中從1001到1158位核苷酸(標(biāo)為等位基因A)的DNA序列(SEQ ID NO:1)。圖中標(biāo)出了等位基因B、C和D的SNP堿基和位置。該圖還顯示了正向(MBLF)和反向(R-1120)擴(kuò)增引物(箭頭)的位置。每個(gè)合成的報(bào)告探針帶有cy3或cy5標(biāo)記。
圖4A、4B、4C和4D是微芯片上的SNP檢測結(jié)果的顯微照片，其中每行的4個(gè)捕獲位點(diǎn)加入了4種未知的擴(kuò)增MBP樣品(NC47、NC48、NC49或NC50)之一。中間第5行裝有非特異性(NS)硫代嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(TPMT)擴(kuò)增子。這些圖顯示標(biāo)記著cy3或cy5的等位基因特異性報(bào)告探針在電嚴(yán)緊之前(圖4A和4B)或之后(圖4C和4D)的雜交情況。圖4A和4C檢測cy3熒光而圖4B和4D檢測cy5熒光。
圖5A和5B的圖表顯示樣品NC49發(fā)射的熒光，在圖4中cy3圖像(圖5A)和cy5圖像(圖5B)中的量。樣品NC49鑒定為A/A純合子。
圖6A和6B的圖表顯樣品NC50發(fā)射的熒光，在圖4中cy3圖像(圖6A)和cy5圖像(圖6B)中的量。樣品NC50鑒定為A/B雜合子。
圖7A和7B的圖表顯示樣品NC47發(fā)射的熒光，在cy3圖像(圖7A)和cy5圖像(圖7B)中的量。樣品NC47鑒定為B/B純合子。
圖8A和8B的顯微照片顯示在微芯片上檢測含有A和D MBP等位基因的樣品的cy5結(jié)果。樣品LM18是一個(gè)D/D純合子。樣品LM27是一個(gè)A/D雜合子。其余展示樣品為A/A純合子。
圖9A的曲線圖顯示通過檢測與等位基因C、等位基因T以及錯(cuò)配報(bào)告分子組雜交的IL-1βT/T擴(kuò)增子的cy3標(biāo)記，相對電嚴(yán)緊安培數(shù)增加得到的定量結(jié)果。
圖9B的顯微照片顯示圖9A中的最終嚴(yán)緊條件下的檢測結(jié)果。


圖10A的曲線圖顯示通過檢測與等位基因C、等位基因T雜交的IL-1βT/T擴(kuò)增子的cy5標(biāo)記，相對電嚴(yán)緊安培數(shù)增加得到的定量結(jié)果。
圖10B的顯微照片顯示
圖10A中的最終嚴(yán)緊條件下的檢測結(jié)果。
圖11A和B的條形圖顯示探針分別與淋巴毒素基因A/A和G/G純合子的陽性和陰性信號。
圖12A和B的條形圖顯示探針與腫瘤壞死因子α基因中的靶標(biāo)的陽性、陰性和對照信號。
圖13A到L展示了一系列微陣列照片，其中說明了發(fā)明所述的多重分析。
發(fā)明詳述定義文中使用的“平均熒光強(qiáng)度”(MFI)是在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)，將攝象機(jī)集成時(shí)間歸一為1秒時(shí)，像素?cái)?shù)值的平均值。數(shù)值范圍將隨滲透層組成而變化。
文中使用的“熒光雜交評分”是確定嚴(yán)緊后的雜交特征，其中評判依據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)可以隨滲透層的特性和功能成分變化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(1)錯(cuò)配的探針要小于10MFI/秒；(2)所有小于25MFI/秒的等位基因特異性報(bào)告分子評為陰性；以及(3)所有大于30MFI/秒的報(bào)告分子評為陽性。這個(gè)評分標(biāo)準(zhǔn)代表了一個(gè)如何借助電斑點(diǎn)印跡方法，利用信號參數(shù)來鑒定單核苷酸多態(tài)性的例子，而非任何意義上對本發(fā)明的限制。根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)，可以將規(guī)定為陽性或陰性分值的MFI/s大小設(shè)置在適合于不同檢測靈敏度的合適水平上。
此外，設(shè)計(jì)利用多重報(bào)告分子雜交(或者內(nèi)部冗余)來確定每個(gè)樣品的基因型不需與重復(fù)樣品或?qū)φ諛悠愤M(jìn)行比較。詳細(xì)的實(shí)施方案本發(fā)明眾多方面之一提供了這樣一種方法，它利用電尋址生物電微芯片對多等位基因復(fù)合體和其它含有單核苷酸多態(tài)性(SNP)的核酸中的SNP進(jìn)行高通量檢測，包括，但不限于在同一核酸內(nèi)是否存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，甘露糖結(jié)合蛋白中的復(fù)雜四等位基因SNP,Fc-γ受體、主要組織相容性復(fù)合體以及白介素1 β的SNP分型。正如文中解釋的，微電子學(xué)與核酸雜交的結(jié)合能快速并準(zhǔn)確地在SNP序列之間作出分辨。事實(shí)上，就在22個(gè)未知MBP四等位基因樣品和13個(gè)D等位基因增強(qiáng)的未知樣品中進(jìn)行的SNP檢測而言，已證明本發(fā)明所述雙色熒光電斑點(diǎn)印跡法100％準(zhǔn)確。這樣的準(zhǔn)確性來源于一個(gè)新用法錯(cuò)配寡核苷酸能驗(yàn)證電子微環(huán)境從而確切地分辨雜合子序列，還有cy3和cy5標(biāo)記報(bào)告分子所揭示的內(nèi)部冗余，證實(shí)了單個(gè)樣品中的SNP。這種基于隨選對大量基因子集樣品進(jìn)行快速SNP基因分型的能力相對已有方法有顯著的優(yōu)勢。
此外，利用半導(dǎo)體微電子學(xué)來轉(zhuǎn)移和濃縮核酸比被動的陣列技術(shù)有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括，但不限于，(1)靈活性，其中的開放結(jié)構(gòu)和各個(gè)控制測試位點(diǎn)的能力使得能在即將作測試前自定義每個(gè)陣列的配置；(2)速度，該方法中的電尋址和電雜交保證在數(shù)秒而非數(shù)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行DNA分子的轉(zhuǎn)移、濃縮和雜交；(3)多路性，其中控制各個(gè)測試位點(diǎn)電嚴(yán)緊度的能力使得可以在相同微芯片上同時(shí)使用各不相干的分子；(4)高效性，實(shí)時(shí)監(jiān)測電雜交和電嚴(yán)緊度不同階段的能力提供了檢測過程中的更有效控制；(5)是一種“芯片上的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)”，其中電子學(xué)的運(yùn)用提供了一種自動化手段，而消除了費(fèi)時(shí)的預(yù)處理步驟，即直接在微芯片上采用介電電泳進(jìn)行細(xì)胞濃縮、破裂和核酸濃縮/擴(kuò)增；(6)自動化，其中可以利用用于100-pad和400-pad半導(dǎo)體芯片的自動加樣器以獲得高通量參數(shù)；以及(7)基因表達(dá)，此處描述的技術(shù)可以用于分析少數(shù)細(xì)胞中的RNA表達(dá)情況。
實(shí)施例1-MBP等位基因檢測人甘露糖結(jié)合蛋白(MBP或MBL2)是先天免疫系統(tǒng)的重要成分，它能使病原微生物易被吞噬細(xì)胞吞噬。MBP對于對多種病原還未建立起免疫力的兒童尤其重要。繼承了幾種常見MBP變異體中的任何一種都會導(dǎo)致免疫缺陷，這種情況在免疫抑制時(shí)會加劇。已經(jīng)鑒定到MBP基因的四種不同等位基因。MBP的潛在臨床實(shí)用性及其基因復(fù)雜性使這個(gè)序列成為用本發(fā)明所述方法進(jìn)行分析的良好靶標(biāo)。
本發(fā)明的方法使用Nanogen,Inc.(San Diego,CA)制造的電尋址微芯片。這種微芯片是利用常規(guī)加工技術(shù)在氧化硅片上制作的。利用無線電頻率排射方法將硅片涂上20nm鈦和100nm鉑金屬層。采用常規(guī)光刻印刷技術(shù)，完成金屬層的圖案并進(jìn)行蝕刻從而形成電極陣列。然后通過等離子體強(qiáng)化的化學(xué)蒸發(fā)沉積法給整個(gè)硅片沉積上氧化硅絕緣層。露出的電極直徑為80μm，電極中心間的距離是200μm。給硅片涂上光阻物質(zhì)，切成1cm2芯片。在本實(shí)施例中，1cm2芯片含有排列成5×5陣列的25個(gè)微電極(
圖1)。每個(gè)電極或測試位點(diǎn)可以獨(dú)立地帶正電、負(fù)電或是電中性以便分子移動和濃縮到或離開測試位點(diǎn)。
用含有鏈霉親合素的瓊脂糖滲透層涂覆包含電極的芯片表面，從而在電極附近將樣品中的生物材料與苛刻的電化學(xué)環(huán)境隔開，并進(jìn)而使樣品中生物素化的核酸結(jié)合到芯片表面的電極上。所述滲透層的制備是將乙二醛瓊脂糖(FMC Bioproducts,Rockland ME)與鏈霉親合素(5mg/ml,Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)混合形成2％瓊脂糖和1mg/ml鏈霉親合素的混合物。將芯片旋涂上鏈霉親合素-瓊脂糖溶液并用0.2M的氰氫硼化鈉/0.3M硼酸鈉(pH9.0)還原schiff堿鍵60分鐘。
所述MBP基因中的多重SNP發(fā)生在基因中的一個(gè)17堿基對區(qū)域。將MBP基因的野生型序列定義為等位基因A，而SNP等位基因型命名為等位基因B、C和D。如圖3所示，可以由患者的基因組核酸樣品擴(kuò)增包含這個(gè)多態(tài)性區(qū)域的123堿基片段并用于發(fā)明所述方法。圖2顯示了所述方法檢測步驟的一個(gè)實(shí)施方案。
設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增MBP基因(Genbank HSMBPIA-X15954)的引物使有義鏈引物包含核苷酸序列5’-TGATTGCCTGTAGCTCTCCAGGCAT-3’(SEQ ID NO:2)，而反鏈引物包含核苷酸序列生物素-5’-GGTAAAGAATTGCAGAGAGACGAACAGC-3’(SEQ ID NO:3)(即反鏈引物的5’末端是生物素化的)。
經(jīng)PCR由患者基因組DNA擴(kuò)增本實(shí)施例所述方法中的123堿基片段，其中反應(yīng)體系100μl中含有2-4μl DNA、1×PCR緩沖液Ⅱ(Perkin-Elmer,Branchburg,NJ)、1.5mM MgCl2、200μM dNTPs、200μM各種引物、2.0U的AmpliTaq Gold(Perkin-Elmer)和280nM Taq StartAntibody(Clontech,Palo Alto,CA)。反應(yīng)體系循環(huán)是在9700熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer)中95℃10分鐘(1個(gè)循環(huán))，95℃30秒、58℃60秒、72℃120秒作35個(gè)循環(huán)，然后在72℃溫育12分鐘。每份DNA樣品經(jīng)Qiagen柱子(Valencia,CA)純化，重懸于水中并利用DNA分子量梯度對照(GibcoBRL,Gathersburg,MD)經(jīng)凝膠電泳定量。將DNA樣品以2.5-10nM的濃度重懸于100mM的組氨酸(Sigma,St.,Louis,MO)中。
將樣品(大約40到400μl體積)于95℃熱變性2-10分鐘，并在冰上迅速冷卻。將35μl樣品加到微芯片上，利用正偏壓直流電以400nA/測試位點(diǎn)電轉(zhuǎn)移(尋址)到一列帶4個(gè)正電荷的測試位點(diǎn)120秒。用組氨酸緩沖液清洗以除去未結(jié)合的DNA。對每個(gè)樣品重復(fù)該步驟。一個(gè)任選步驟是將完全尋址的陣列用0.5×SSC(pH11.5)處理5分鐘，然后用水和組氨酸徹底沖洗以便產(chǎn)生更強(qiáng)的雜交信號。完成尋址的擴(kuò)增子借助與預(yù)先包埋在滲透層中的鏈霉親合素的相互作用仍然結(jié)合在它們各自的測試位點(diǎn)上。
然后使每個(gè)測試位點(diǎn)上的核酸與熒光標(biāo)記的等位基因特異性報(bào)告寡核苷酸探針通過電雜交進(jìn)行雜交。合成的報(bào)告探針(見表1)在5’末端連接了cy3或cy5熒光基團(tuán)(BioServe Biotechnologies,Laurel,MD)。電雜交的進(jìn)行要保證野生型以及SNP cy3和cy5報(bào)告基團(tuán)各以75到125nM的濃度重懸于100mM組氨酸緩沖液中。將每個(gè)等位基因組中兩種cy3標(biāo)記的錯(cuò)配報(bào)告分子以37.5nM等量混合使緩沖液中的合并濃度為75nM。將每組報(bào)告分子(20-35μl)加樣到微芯片上，并與一行被捕獲的擴(kuò)增子在475nA/測試位點(diǎn)的條件下雜交15秒。用100mM組氨酸沖洗以除去過量的報(bào)告分子。第二、三和四組的報(bào)告分子以相同的行-方式加樣。雜交后，在20mM二價(jià)堿NaH2PO4、20mM Trisbase(pH9.5)(20/20緩沖液)中洗20分鐘進(jìn)行電嚴(yán)緊。
然后優(yōu)選通過將各個(gè)測試位點(diǎn)的電荷極性倒轉(zhuǎn)并增加安培數(shù)(電嚴(yán)緊)使單堿基對錯(cuò)配的報(bào)告探針變性。給每個(gè)測試位點(diǎn)施加0.5μA/測試位點(diǎn)的脈沖電流，通0.1秒，斷0.2秒，作150個(gè)循環(huán)(或者通0.1秒，斷0.1秒，50個(gè)循環(huán))。芯片在20/20緩沖液中清洗以除去變性的報(bào)告分子并用IPLab軟件獲取圖象。當(dāng)安培數(shù)斜線上升結(jié)束時(shí)，將圖象和熒光定量。具體來說，使用0.6μA/測試位點(diǎn)、0.7μA/測試位點(diǎn)、0.8μA/測試位點(diǎn)、0.9μA/測試位點(diǎn)和1.0μA/測試位點(diǎn)。跨越TPMT密碼子460多態(tài)性的生物素化擴(kuò)增子作為非特異性本底對照。將每個(gè)圖象歸一化為MFI/s，提取每個(gè)MBP測試位點(diǎn)的非特異性計(jì)數(shù)以便進(jìn)行最終定量。相對錯(cuò)配對照，陽性測試位點(diǎn)得到明顯的信號。
本實(shí)施例的方法使用了這樣一種裝置，其中與微芯片的電連接是通過設(shè)置在顯微操作器6000(Micromanipulator Company,Carson City,NV)上的環(huán)氧化環(huán)形探針卡套(Cerprobe,Phoenix,AZ)實(shí)現(xiàn)的。動力(Keithley236,Keithley Instruments,Cleveland,OH)源自一列繼電器(National Instruments,Austin,TX)的接線端之間的固定電勢差或固定電流。計(jì)算機(jī)硬件(Macintosh Power PC,Apple Computer,Cupertino,CA)和IPLab Spectrum3.1.1版軟件(Signal Analytics Corporation,Vienna,VA)使圖形用戶能通過菜單控制各個(gè)陣列位置。激發(fā)激光使用HeNe 633nm激光器(8mW輸出功率；Research Electro-Optics,Boulder,CO)和頻率倍增二極管驅(qū)動的固態(tài)激光器(5mW輸出功率；Laser Compact,Moscow)532nm。通過一個(gè)帶有575nm(用于cy3)或670nm(用于cy5)(Chroma Tech,Brattleboro,VT)濾光片的8x物鏡觀察熒光。用電荷耦合器攝像頭(Princeton Instruments,Trenton,NJ)掃描并收集熒光信號。通過IPLabSpectrum軟件對掃描得到的圖象進(jìn)行定量。
如表1所示，合成野生型、特定SNP等位基因序列或者野生型和SNP錯(cuò)配的特異性報(bào)告探針。用cy3(1,1’-雙(ε-羧戊基)-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羧氰-5,5’-二磺酸鉀鹽二-N-羥基琥珀酸酯)和cy5(1,1’-雙(ε-羧戊基)-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二羧氰-5,5’-二磺酸鉀鹽二-N-羥基琥珀酸酯)標(biāo)記野生型和SNP報(bào)告分子。標(biāo)記cy3的野生型探針與標(biāo)記cy5的野生型探針要隔離開。同樣處理SNP探針。但要將野生型的和SNP標(biāo)記報(bào)告分子合并成兩類探針混合物。具體來說，這些混合物或組是(1)野生型-cy3/SNP-cy5和(2)野生型-cy5/SNP-cy3。將差異標(biāo)記的探針混合在一起就能使它們與各個(gè)測試位點(diǎn)上擴(kuò)增好的患者DNA樣品同時(shí)進(jìn)行雜交，每種雜交情況得以重復(fù)記錄。對于每個(gè)SNP等位基因，要另外制備兩個(gè)含有野生型和SNP錯(cuò)配的報(bào)告寡核苷酸探針。這些探針只標(biāo)記cy3。在本實(shí)驗(yàn)中任意選擇cy3是為了方便實(shí)驗(yàn)。但是，為了分辨等位基因可以結(jié)合上任何標(biāo)記。錯(cuò)配的探針同樣以相同的摩爾濃度合并為兩組，真實(shí)的野生型或SNP探針均用cy5標(biāo)記((1)野生型-cy5/錯(cuò)配-cy3和(2)SNP-cy5/錯(cuò)配cy3)。這些附加的報(bào)告分子對使得在同一樣品中存在野生型和SNP序列(雜合子)時(shí)，能對它們與配對和錯(cuò)配探針序列之間的相互作用進(jìn)行比較。
表1
利用這些檢測條件，對預(yù)先通過常規(guī)測序技術(shù)確定的MBP序列已知的基因組DNA樣品作盲測。所檢測的樣品中有一組已經(jīng)鑒定出是這四個(gè)等位基因的純合或雜合形式，將其作為對照。其余樣品(22個(gè)樣品)的基因型未知。用本發(fā)明的方法對這22個(gè)樣品作盲測。另外，檢測第二組13個(gè)未知樣品中是否存在D等位基因位點(diǎn)。
使每個(gè)未知擴(kuò)增子電尋址到一列4個(gè)測試位點(diǎn)上。這樣，一個(gè)25位點(diǎn)的微芯片陣列可以容納4個(gè)不同的患者樣品和一個(gè)非特異性對照擴(kuò)增子。每行樣品與四種探針混合物(即報(bào)告分子組(1)Acy3/Bcy5,(2)錯(cuò)配-cy3/Acy5,(3)錯(cuò)配-cy3/Bcy5，和(4)Bcy3/Acy5)之一進(jìn)行雜交。每個(gè)報(bào)告分子組含有一個(gè)cy3標(biāo)記的和一個(gè)cy5標(biāo)記的SNP等位基因特異性寡核苷酸對，它們僅有一個(gè)核苷酸錯(cuò)配不同。圖4A-D顯示了一個(gè)代表性微芯片與四個(gè)cy3/cy5標(biāo)記的報(bào)告分子組雜交后的圖象，該芯片含有4個(gè)未知樣品(NC47、NC48、NC49和NC50)，報(bào)告分子組對上文提及的MBP的A或B等位基因是特異性的。施加電嚴(yán)緊直至錯(cuò)配對照(錯(cuò)配-cy3)被去除到本底水平(圖4C)。
圖4A-D展示了代表3種可能的基因型(A/A、A/B、B/B)的不同熒光圖案。對樣品NC47(第1列)所作的分析顯示，在cy3圖象(圖4C)中與第四個(gè)報(bào)告分子組(第4行)有明顯信號，在cy5圖象(圖4D)中與第一(第1行)和第三(第3行)個(gè)報(bào)告分子組有信號。總起來說，這樣的信號和與含有B等位基因特異探針(代表真實(shí)的配對情況)的報(bào)告分子組發(fā)生的雜交情況是一致的。電嚴(yán)緊將A等位基因特異探針?biāo)a(chǎn)生的信號降至本底水平。
未知樣品NC48(圖4C，第2列)與第一個(gè)報(bào)告分子組(第1行)呈現(xiàn)出一個(gè)cy3信號，與第二和第四報(bào)告分子組(第2和4行)是一個(gè)cy5信號。每個(gè)信號和與A等位基因特異報(bào)告分子發(fā)生的雜交情況相符。類似地，含有樣品NC49(第4列)的一列在cy3圖象中(圖4C，第1行)和cy5圖象中(圖4D，第2和4行)與A等位基因特異報(bào)告分子有信號。注意圖4C中第2和3行中的每個(gè)測試位點(diǎn)發(fā)射的熒光已降至本底強(qiáng)度。這些測試位點(diǎn)已用錯(cuò)配cy3標(biāo)記的報(bào)告分子進(jìn)行了雜交，并且知道它們與A和B等位基因序列均錯(cuò)配。錯(cuò)配信號的消失證明用于分辨SNP的電嚴(yán)緊達(dá)到了一個(gè)合適的水平，任何其余報(bào)告分子信號都構(gòu)成完全配對。
對每板上的未知樣品NC50(第5列)進(jìn)行評估顯示，cy3圖象(圖4C，第1和4行)和cy5圖象(圖4D，第1-4行)中均有A和B等位基因特異性結(jié)合。在與錯(cuò)配cy3報(bào)告分子(圖4C，第2-3行)作雜交的測試位點(diǎn)沒有信號證明電嚴(yán)緊完善，并且明確了NC50擴(kuò)增子中含有A和B兩種等位基因序列。
進(jìn)一步分辮以上圖象以便對每個(gè)樣品發(fā)射的熒光進(jìn)行定量。MBP報(bào)告分子與非特異性擴(kuò)增子(NS)的結(jié)合是電雜交后的總cy5熒光強(qiáng)度的大約4％，比嚴(yán)緊前cy3標(biāo)記的報(bào)告分子高2到4倍。NC49顯示，A等位基因報(bào)告分子和錯(cuò)配報(bào)告分子之間的平均強(qiáng)度與B等位基因和錯(cuò)配報(bào)告分子之間的平均強(qiáng)度的區(qū)別在10倍以上(圖5A和5B)。因此，就B位點(diǎn)而言，將NC49評為A/A純合子。類似地，樣品NC48定為A/A純合子(數(shù)據(jù)未顯示)。
對評為A/B的未知樣品NC50進(jìn)行的定量顯示，結(jié)合到被捕獲的擴(kuò)增子上的A和B等位基因特異性cy3報(bào)告分子和cy5標(biāo)記報(bào)告分子均有明顯的信號(大約70MFI/s)。因此，就B位點(diǎn)來說，NC50擴(kuò)增子判為A/B雜合子。
將NC47樣品的熒光定量(圖7A和7B)，顯示錯(cuò)配和A等位基因報(bào)告分子被降至本底強(qiáng)度。然而，B等位基因報(bào)告分子仍有高于100MFI/s的信號。類似地，分析cy5圖象(圖7B)表明A等位基因信號下降(即低于25MFI/s)，而B等位基因信號保持強(qiáng)勁(即大于100MFI/s)。因此，NC47判為B/B純合子。
分析來自判為A/A(就SNP等位基因而言)的患者的不同未知樣品(樣品總數(shù)=18)表明，較之錯(cuò)配cy3報(bào)告分子，A-cy3報(bào)告分子與A/A樣品的結(jié)合高100倍，它比B或C等位基因cy3標(biāo)記的SNP報(bào)告分子與A/A樣品的結(jié)合高26倍(探針均值±均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)；A-cy3:200±36.2 MFI/s,SNP-cy3:7.6±1.8MFI/s，錯(cuò)配-cy3:1.9±0.3MFI/s)。相反地，分析七個(gè)判為雜合子的不同未知樣品表明，cy3標(biāo)記的A等位基因和SNP探針與樣品的結(jié)合強(qiáng)度幾乎相等，而錯(cuò)配探針與樣品的結(jié)合強(qiáng)度低20倍(探針均值±SEM；A-cy3:188.3±44.4MFI/s；SNP-cy3:150.1±42.3MFI/s；錯(cuò)配-cy3:7±2.2MFI/s)。對于cy5標(biāo)記探針，記錄的配對與錯(cuò)配堿基的比率相等(數(shù)據(jù)未顯示)。
評判22個(gè)未知樣品的B和C等位基因位點(diǎn)。將每個(gè)位置的核苷酸序列以及A、B和C基因型與標(biāo)準(zhǔn)測序結(jié)果進(jìn)行比較(見表2)。如圖所示，B和C位點(diǎn)的所有44個(gè)SNP評判(22個(gè)A/B和22個(gè)A/C)的微芯片檢測和測序結(jié)果是吻合的。至此還沒有描述同一單倍型內(nèi)B和C等位基因序列的發(fā)生率。對于B/B基因型，只有完全配對的B和C等位基因探針在嚴(yán)緊后仍保持結(jié)合狀態(tài)。因此，在判定它們是化合物雜合子之前必須對B和C報(bào)告分子均作評判。雖然跨越多個(gè)變異位點(diǎn)的探針有可能準(zhǔn)確地區(qū)分開各種基因型，相同單倍型內(nèi)的多態(tài)性位點(diǎn)可能會對以這種方式進(jìn)行的分辨造成混淆。在此情況下，給每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)置不同探針是有利的。如文中所論證的，無論多態(tài)性核苷酸位于等位基因特異性探針的5’、中央或3’，都可以同樣良好地加以分辨。
然后再將這22個(gè)樣品進(jìn)行盲測并評判是否有D等位基因(表2)。本發(fā)明的電子學(xué)方法正確地從22個(gè)樣品中鑒定出唯一的D等位基因樣品(NC52-A/D)。因?yàn)镈等位基因的發(fā)生率很低，而任何SNP分辨方法的效率就在于其鑒定低頻等位基因的能力，因此用D等位基因報(bào)告探針通過電子學(xué)方法檢測了第二組13個(gè)未知樣品(將其對D等位基因系統(tǒng)有效性加權(quán)，樣品LM1、LM10、LM11、LM18、LM20、LM27、LM29、LM30、LM31和LM32)。用電子檢測法得到的每組樣品的D等位基因評分與測序結(jié)果100％吻合。圖8A和8B顯示了13個(gè)未知樣品中的10個(gè)的微芯片圖象。
表2．用未知樣品的常規(guī)DNA測序(NIH)驗(yàn)證經(jīng)電斑點(diǎn)印跡(NGEN)所作的SNP分型
實(shí)施例2-白介素1β檢測本發(fā)明在檢測SNP方面的用途進(jìn)一步通過檢測雙等位基因白介素1β(1L-1β)多態(tài)性來說明。1L-1β序列提取自Genbank(XO4500)，它的5888位點(diǎn)含有C到T的SNP轉(zhuǎn)換。用于PCR擴(kuò)增的引物序列包括有義鏈核苷酸序列，5’-AAATTTTGCCACCTCGCCTCACG-3’(SEQ IDNO:16)和反鏈核苷酸序列，生物素-5’-AGTCCCGGAGCGTGCAGTTCAGT-3’(SEQ ID NO:17)(即反鏈?zhǔn)巧锼鼗?。
在本實(shí)施例中，如上所述，設(shè)計(jì)cy3和cy5標(biāo)記的報(bào)告分子(由Bioserve,Laurel,MD合成)組來鑒定野生型(C)和SNP變異(T)等位基因。(見表3)熒光隨著電嚴(yán)緊度的上升而消失表明含有已知純合子T/T生物素化擴(kuò)增子的測試位點(diǎn)上的非C/非T錯(cuò)配的報(bào)告分子發(fā)生變性(圖9-10)。類似地，cy3和cy5等位基因報(bào)告分子沒有表現(xiàn)出與T/T擴(kuò)增子的嚴(yán)謹(jǐn)雜交。相反，與cy3標(biāo)記的T等位基因報(bào)告分子(圖9A)和cy5標(biāo)記的報(bào)告分子(
圖10A)發(fā)生的雜交發(fā)射出一個(gè)超過100MFI/s的明顯信號。因此，由測序技術(shù)確定為T/T純合子的擴(kuò)增子，通過電子學(xué)方法同樣判為T/T純合子。總之，在電嚴(yán)緊過程中cy3和cy5報(bào)告分子均可見總信號強(qiáng)度的逐漸下降(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例5中的實(shí)驗(yàn)顯示，對MBP、1L-1β和TNFα復(fù)合樣品進(jìn)行了SNP分辨，其中的微芯片作了電剝離，并重新確定重復(fù)樣品中第二個(gè)基因的基因型。
表3
實(shí)施例3-淋巴毒素基因檢測另一個(gè)體現(xiàn)本發(fā)明在檢測SNP中的用途的是用淋巴毒素觀察到的。所述淋巴毒素序列提取自Genbank(M16441)，它的1069位點(diǎn)含有一個(gè)A到G的SNP轉(zhuǎn)換。用于PCR擴(kuò)增的引物序列包括有義鏈核苷酸序列，5’-CTTCTCTGTCTCTGACTCTCCATC-3’(SEQ ID NO:22)和反鏈核苷酸序列，生物素-5’-CAAGGTGAGCAGAGGGAGAC-3’(SEQ ID NO:23)(即反鏈?zhǔn)巧锼鼗?。
在本實(shí)施例中，設(shè)計(jì)cy3和cy5報(bào)告分子組來鑒定淋巴毒素基因中含有的1069位點(diǎn)A或G單核苷酸多態(tài)性的基因變異體(報(bào)告分子寡核苷酸由Bioserve,Laurel,MD合成)。(見表4)熒光隨著電嚴(yán)緊的上升而消失表明，對于樣品NC50，含有已知純合子A/A之生物素化擴(kuò)增子的測試位點(diǎn)上的非A/非G錯(cuò)配(mis-cy3)報(bào)告分子發(fā)生變性；對于NC43，含有已知純合子G/G之生物素化擴(kuò)增子的測試位點(diǎn)上的非A/非G錯(cuò)配(mis-cy3)報(bào)告分子發(fā)生變性(
圖11A和B)。因此，樣品NC50和NC43的擴(kuò)增子由測序技術(shù)分別確定為A/A和G/G純合子，通過電子學(xué)方法同樣分別判為A/A和G/G純合子。
表4
實(shí)施例4-腫瘤壞死因子α檢測此外，在腫瘤壞死因子基因的啟動子中觀察到另一個(gè)顯示應(yīng)用本發(fā)明檢測SNP的例子。所述腫瘤壞死因子基因組DNA序列提取自Genbank(X02910)，它的308位點(diǎn)含有一個(gè)G到A的SNP轉(zhuǎn)換。用于PCR擴(kuò)增的引物序列包括有義鏈核苷酸序列，5’-GTTAGAAGGAAACAGACCACAGACC-3’(SEQ ID NO:28)和反鏈核苷酸序列，生物素-5’-TCCTCCCTGCTCCGATTCC-3’(SEQ ID NO:29)(即反鏈?zhǔn)巧锼鼗?。
在本實(shí)施例中，設(shè)計(jì)cy3和cy5報(bào)告分子組來鑒定腫瘤壞死因子基因的啟動子中含有的G或A單核苷酸多態(tài)性的基因變異體(報(bào)告分子寡核苷酸由Bioserve,Laurel,MD合成)。(見表5)在本發(fā)明的一個(gè)改進(jìn)方法中，僅用兩個(gè)報(bào)告分子組來檢測G或A等位基因。給含有來自樣品NC39和NC40的擴(kuò)增子以及非特異性擴(kuò)增子TPMT的測試位點(diǎn)上施加電嚴(yán)緊條件。電嚴(yán)緊顯示由DNA測序確定為A/G雜合子的樣品NC39是A/G雜合子。并且，鑒定出由DNA測序確定為G/G純合子的樣品NC40是G/G純合子(
圖12A)。為了作評判，將其余電雜交報(bào)告分子信號歸一為最大MFI/sec，并將結(jié)果與非特異性對照TPMT的結(jié)果進(jìn)行比較。本實(shí)施例顯示了本發(fā)明在鑒定SNP中的應(yīng)用，以及可用于篩選那些鑒定特定接合型時(shí)需要的報(bào)告分子信號數(shù)量減少的方法。
表5
實(shí)施例5-多重分析實(shí)驗(yàn)還顯示了分辨TNFα、MBP和1L-1β復(fù)合樣品中的SNP，其中將微芯片作了電剝離，再檢測這個(gè)三組分樣品中下一個(gè)基因的基因型。分別將三個(gè)擴(kuò)增子MBPA/A純合子(M)、1L-1βT/T純合子(Ⅰ)和TNTα G/G純合子(T)加入并以1∶1∶1的三組分混合物(T+M+I)捕獲在25pad的溶液處理芯片上(
圖13A)。芯片與TNFα特異性cy3/cy5標(biāo)記的報(bào)告分子組雜交，作雙份(
圖13B)。通過逐漸增加電嚴(yán)緊得到了等位基因特異性多態(tài)性(
圖13C和D)。獲知混合樣品中的TNFα的基因型后，通過在更高溫度(42℃)下施加電嚴(yán)緊，并隨后在0.5×SSC(pH11.5)中沖洗2分鐘將芯片上的標(biāo)記報(bào)告分子剝離。然后在組氨酸中徹底清洗剝離芯片，得到基線圖象(13E)。然后用MBP等位基因特異性cy3/cy5報(bào)告分子組(13F)重新與芯片雜交，并通過施加電嚴(yán)緊條件(13G和H)獲取基因型。將確定了基因型的芯片(再次)電剝離，獲得基線圖象(13I)，并用1L-1β等位基因報(bào)告分子組與復(fù)合樣品雜交(13J)。通過電嚴(yán)緊條件獲得其基因型(13K和L)。這些結(jié)果表明，只需一次捕獲加樣就將板上多個(gè)基因分型的能力可以增加電斑點(diǎn)印跡的通量參數(shù)。
如上所示，有多種方式可以得到復(fù)合樣品。在一個(gè)方案中可以在單個(gè)開放陣列微芯片上檢測來自一個(gè)患者樣品的多個(gè)靶分子。此外，可以將每個(gè)靶分子捕獲到微芯片上的不同位置或同一個(gè)捕獲塊。復(fù)合還可以指一個(gè)微芯片陣列上容納有多個(gè)患者樣品。在這種情況中，可以將每個(gè)患者的各個(gè)靶分子捕獲在單獨(dú)的捕獲位點(diǎn)或位點(diǎn)簇或者每個(gè)患者一個(gè)位點(diǎn)來進(jìn)行分析。
以上是用于闡述本發(fā)明的實(shí)施方案，而非對發(fā)明任何意義上的限制。雖然描述發(fā)明時(shí)顧及了特定改進(jìn)，但其細(xì)節(jié)不應(yīng)解釋為對發(fā)明的限制，因?yàn)楹茱@然可以在不脫離發(fā)明的精神和范圍的情況下采取各種等同、變化和修飾方案，而這類等同方案應(yīng)理解為包括在本文中。所有出版物和專利申請均同等程度地全文引入本文作為參考文獻(xiàn)，并視作每篇出版物和專利申請均是逐一并個(gè)別地引入作為參考文獻(xiàn)的。
權(quán)利要求
1．一種利用有多個(gè)測試位點(diǎn)的電尋址微芯片來檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，包括?。峁┲辽僖粋€(gè)含有至少一種目標(biāo)靶核酸的樣品，所述靶核酸含有至少一個(gè)SNP；ⅱ．任選將所述靶核酸作擴(kuò)增反應(yīng)從而形成擴(kuò)增產(chǎn)物；ⅲ．使所述靶核酸或所述擴(kuò)增產(chǎn)物電尋址到微芯片的特定測試位點(diǎn)；ⅳ．將所述靶核酸或所述擴(kuò)增產(chǎn)物捕獲到所述測試位點(diǎn)；ⅴ．提供SNP特異性探針并使該探針與所述靶核酸或所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電雜交以形成雜交復(fù)合物；ⅵ．對所述雜交復(fù)合物實(shí)行電嚴(yán)緊條件從而使雜交復(fù)合物去穩(wěn)定，其中雜交復(fù)合物含有至少一個(gè)在所述靶核酸或擴(kuò)增產(chǎn)物與探針之間形成的錯(cuò)配；以及ⅶ．在(ⅵ)的電嚴(yán)緊之后檢測保持穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品含有的目標(biāo)靶核酸選自編碼下列物質(zhì)的核酸(1)甘露糖結(jié)合蛋白(2)Fc-γ受體(3)主要組織相容性復(fù)合體(4)白介素1β(5)淋巴毒素以及(6)腫瘤壞死因子α。
3．權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測單核苷酸多態(tài)性是通過對含有目的核酸序列的多個(gè)患者樣品進(jìn)行多次SNP檢測。
4．權(quán)利要求3的方法，其中所述患者樣品是連續(xù)地提供的。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測單核苷酸多態(tài)性包括同時(shí)篩選一個(gè)患者樣品中不同基因的多種SNP的能力。
6．權(quán)利要求1的方法，其中所述電尋址和/或電嚴(yán)緊包括實(shí)時(shí)監(jiān)測電雜交和電嚴(yán)緊各階段的能力，從而保證檢測過程中的有效控制。
7．權(quán)利要求1的方法，其中所述SNP來自目標(biāo)靶核酸的多等位基因構(gòu)成的基因復(fù)合物。
8．一種檢測來自至少一個(gè)患者樣品的目標(biāo)靶核酸中的多種單核苷酸多態(tài)性的方法，所述方法對每個(gè)患者樣品使用具有多測試位點(diǎn)的電尋址微芯片中的單個(gè)捕獲位點(diǎn)，方法包括?。峁┲辽僖粋€(gè)含有至少一種目標(biāo)靶核酸的樣品，所述靶核酸含有至少一個(gè)SNP；ⅱ．任選將所述靶核酸作擴(kuò)增反應(yīng)從而形成擴(kuò)增產(chǎn)物；ⅲ．使所述靶核酸或所述擴(kuò)增產(chǎn)物電尋址到微芯片的特定測試位點(diǎn)；ⅳ．將所述靶核酸或所述擴(kuò)增產(chǎn)物捕獲到至少一個(gè)測試位點(diǎn)；ⅴ．提供SNP特異性探針并使該探針與所述靶核酸或所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電雜交以形成雜交復(fù)合物；ⅵ．對所述雜交復(fù)合物實(shí)行電嚴(yán)緊條件從而使雜交復(fù)合物去穩(wěn)定，其中雜交復(fù)合物含有至少一個(gè)在所述靶核酸或擴(kuò)增產(chǎn)物與探針之間形成的錯(cuò)配；以及ⅶ．在(ⅵ)的電嚴(yán)緊之后檢測保持穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。
9．一種檢測來自多個(gè)患者樣品的目標(biāo)靶核酸中的單核苷酸多態(tài)性的方法，所述方法對每個(gè)患者樣品使用具有多測試位點(diǎn)的電尋址微芯片中的至少一個(gè)捕獲位點(diǎn)，方法包括?。峁┖心繕?biāo)靶核酸的樣品，所述靶核酸含有至少一個(gè)SNP；ⅱ．任選將所述靶核酸作擴(kuò)增反應(yīng)從而形成擴(kuò)增產(chǎn)物；ⅲ．使所述靶核酸或所述擴(kuò)增產(chǎn)物電尋址到微芯片的特定測試位點(diǎn)；ⅳ．將所述靶核酸或所述擴(kuò)增產(chǎn)物捕獲到至少一個(gè)測試位點(diǎn)；ⅴ．提供SNP特異性探針并使該探針與所述靶核酸或所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電雜交以形成雜交復(fù)合物；ⅵ．對所述雜交復(fù)合物實(shí)行電嚴(yán)緊條件從而使雜交復(fù)合物去穩(wěn)定，其中雜交復(fù)合物含有至少一個(gè)在所述靶核酸或擴(kuò)增產(chǎn)物與探針之間形成的錯(cuò)配；以及ⅶ．在(ⅵ)的電嚴(yán)緊之后檢測保持穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用硅微芯片上的電路快速檢測單核苷酸多態(tài)性的方法。該方法能在將DNA電協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)、濃縮和結(jié)合到所選電極(測試位點(diǎn))后,準(zhǔn)確地辨別擴(kuò)增好的DNA樣品。所述測試位點(diǎn)構(gòu)成規(guī)則的樣品陣列,后者可利用包含野生型序列和錯(cuò)配序列這兩種標(biāo)記報(bào)告分子的內(nèi)部控制來加以分辨。利用該方法分辨了甘露糖結(jié)合蛋白的復(fù)雜四等位基因SNP。
文檔編號C12N15/09GK1313906SQ00800968
公開日2001年9月19日 申請日期2000年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月30日
發(fā)明者帕特里克·N·吉勒斯, 帕特里克·J·狄龍, 戴維·J·吳, 查爾斯·B·福斯特, 斯蒂芬·J·差諾克 申請人:內(nèi)諾金有限公司