專利名稱：純合成載體、質(zhì)粒、包含它們的轉(zhuǎn)基因植物和植物部分,以及獲得它們的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及純的合成載體，特別是準(zhǔn)備將其用于植物生物技術(shù)領(lǐng)域中的遺傳轉(zhuǎn)化。
一般而言，生物技術(shù)和遺傳操作領(lǐng)域的載體是已知的。然而，目前最常用于遺傳轉(zhuǎn)化(尤其是在植物生物技術(shù)領(lǐng)域的遺傳轉(zhuǎn)化)的載體，在其應(yīng)用上存在幾個(gè)缺點(diǎn)。實(shí)際上，通常使用的特別用于植物轉(zhuǎn)基因發(fā)生(transgenesis)的載體叫做pBin19(Frisch等，1995)。該雙元質(zhì)粒pBin19的核苷酸序列完全已知。然而，問題在于該質(zhì)粒大小較大(11.8kbp)并含有無用元件(超過pBin19的一半)，所述無用元件從調(diào)控觀點(diǎn)來看是無法接受的，甚至對(duì)良性復(fù)制有害。而且，該質(zhì)粒的選擇性表達(dá)盒位于T-DNA的右邊界附近。因此，當(dāng)所述T-DNA在所述選擇性表達(dá)盒后斷裂時(shí)，它將不可能產(chǎn)生任何選擇性，所述選擇性是為了僅保留具有目的基因表達(dá)盒的植物。
用于本說明書和權(quán)利要求書的表述具有以下含義-“載體”是指一種表達(dá)系統(tǒng)，例如包被DNA的發(fā)射物、核酸基轉(zhuǎn)運(yùn)載體、適于運(yùn)送核酸的核酸分子和自主自我復(fù)制的環(huán)狀DNA，例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒等。如果將微生物或重組細(xì)胞培養(yǎng)物稱為“表達(dá)載體”的宿主，則所述載體還可以包括染色體外環(huán)狀DNA(例如線粒體或葉綠體DNA)、已經(jīng)整合到宿主染色體中的DNA，在所述宿主中所述載體或者作為自主結(jié)構(gòu)復(fù)制以有絲分裂細(xì)胞的穩(wěn)定方式復(fù)制、或者整合到所述宿主的基因組中、或者保持在所述宿主的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。
-通常用于遺傳轉(zhuǎn)化的載體以質(zhì)粒形式存在。在此情況下，“質(zhì)粒”是能夠在細(xì)胞中自主復(fù)制的環(huán)狀DNA分子。如果將微生物或重組細(xì)胞培養(yǎng)物稱為“表達(dá)”質(zhì)粒的宿主，則所述質(zhì)粒既包含染色體外環(huán)狀DNA分子，也包含已經(jīng)整合到宿主染色體中的DNA。如果所述質(zhì)粒由宿主細(xì)胞保持，則所述質(zhì)粒或者作為自主結(jié)構(gòu)復(fù)制以有絲分裂細(xì)胞穩(wěn)定的方式復(fù)制，或者整合到所述宿主的基因組中；-“純的”是指所述載體僅含有其功能性必需的序列，并攜有僅包含所述宿主細(xì)胞表達(dá)必需的元件的核酸序列；-“核酸”是指DNA或RNA；-“核酸序列”是指由5′末端至3′末端閱讀的單鏈或雙鏈核苷酸堿基寡聚體或多聚體，包括自我復(fù)制的質(zhì)粒、基因、可以為感染性或非感染性的DNA或RNA聚合體，以及或者功能性或者非功能性的DNA或RNA。在用于本申請(qǐng)的核苷酸符號(hào)中，除非另有說明，否則單鏈核苷酸序列的左端為5′末端；-“衍生的核酸序列”是指例如通過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的置換、缺失、添加、突變、斷裂和/或合成，直接或間接衍生自所指序列的序列；-“啟動(dòng)子”是指轉(zhuǎn)錄起始密碼子上游的核酸區(qū)，該區(qū)涉及RNA聚合酶和其它轉(zhuǎn)錄蛋白的識(shí)別和結(jié)合；-“植物啟動(dòng)子”是能夠在植物細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；-“組成型啟動(dòng)子”是指能夠在宿主生物的整個(gè)發(fā)育過程中，在所述生物的全部或幾乎全部組織中表達(dá)核酸序列的啟動(dòng)子，所述核酸序列操作性地結(jié)合至所述啟動(dòng)子；-“組織特異性啟動(dòng)子”是指能夠在所述宿主生物的某些特定組織中選擇性表達(dá)核酸序列的啟動(dòng)子，所述核酸序列操作性地結(jié)合至所述啟動(dòng)子；-“操作性結(jié)合”是指功能或調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)與要表達(dá)的核酸序列或基因結(jié)合，其結(jié)合方式使得該元件影響所結(jié)合的核酸序列的轉(zhuǎn)錄，所述核酸序列或基因編碼需要產(chǎn)生的蛋白；-“表達(dá)盒”是指能夠控制核酸序列或基因表達(dá)的核苷酸序列，所述核酸序列或基因編碼需要在與所述核苷酸序列匹配的宿主生物體中產(chǎn)生的多肽。這種表達(dá)盒包含至少一個(gè)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，以及任選地包含對(duì)表達(dá)必需或有用的其它因子；-“異源序列”或“異源核酸序列”是指其環(huán)境以外的來源或物種的序列，或者在源自同一環(huán)境的情況下，其已經(jīng)相對(duì)于其原來形式被修飾的序列?？梢酝ㄟ^例如用限制酶處理所述核酸，以產(chǎn)生能夠操作性結(jié)合至啟動(dòng)子的核酸片段，對(duì)所述核酸序列進(jìn)行修飾。還可以利用例如定向誘變的技術(shù)進(jìn)行所述修飾；-“盒”是指負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)功能的核酸序列；-“類似”是指此術(shù)語涉及的所述盒和/或核酸序列，與稱為參比序列的盒和/或已知核酸序列具有一定序列同一性或共有區(qū)，優(yōu)選與所述參比序列具有至少50％的序列同一性，更優(yōu)選具有至少75％的序列同一性，更特別具有至少90％的序列同一性。序列同一性的百分比以至少6個(gè)核苷酸堿基的參比窗為基礎(chǔ)進(jìn)行計(jì)算?？梢允褂脺y定與參比序列同源性的序列對(duì)比算法確定參比窗，所述算法例如局部同源性算法、同源性對(duì)比算法和相似性檢索算法，這些算法還以計(jì)算機(jī)化形式存在，稱為GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。通過比較參比序列和所述盒和/或所述核酸序列獲得序列同一性的百分比；-“位于”是指在已鑒定元件(例如“盒”、限制位點(diǎn)或具有特別功能的密碼子)的核酸序列中的位置。圖中給出的位置是指在核苷酸序列的閱讀方向，即5′→3′方向，在所述核酸序列中的元件起始位置；-“轉(zhuǎn)基因植物”是指通過遺傳操作技術(shù)獲得的植物，并包括通過這些技術(shù)所獲得的整株植物、其后代以及植物器官，例如根、莖和葉。按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以具有不同水平的倍數(shù)性，特別可以是多倍體、二倍體和單倍體；-“繁殖體”是指植物細(xì)胞的聚集簇或聯(lián)合體，它可以具有或沒有一定的結(jié)構(gòu)，它可再生完整植株，例如外植體、愈傷組織、莖、葉、根、插條甚至種子。
令人驚奇的是，本發(fā)明的申請(qǐng)人已經(jīng)成功制得核苷酸序列完全已知的、較小的純合成載體，尤其是雙元質(zhì)粒，使得可以消除前述的缺點(diǎn)，尤其提供的復(fù)制率高于最通常使用的現(xiàn)有載體。而且，與此同時(shí)本申請(qǐng)人已經(jīng)成功制得一系列載體，其生產(chǎn)方式使得能夠選擇適宜于本申請(qǐng)?jiān)O(shè)想用途的載體及其使用環(huán)境，并因此使得能夠更好地控制要表達(dá)的、編碼需要產(chǎn)生的多肽的基因的表達(dá)率。
另外，在一些按照本發(fā)明的載體中，每個(gè)功能元件或組件都可以通過單純酶消化分離。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是一種純合成載體，它僅含有其功能性和細(xì)胞(特別是植物細(xì)胞)轉(zhuǎn)基因發(fā)生必需的元件。
按照一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述載體包含以下操作性地結(jié)合的其功能性和細(xì)胞轉(zhuǎn)基因發(fā)生必需的元件-至少一個(gè)核酸序列，它編碼至少一個(gè)第一復(fù)制起點(diǎn)，優(yōu)選oriRK2，更優(yōu)選至少一個(gè)具有廣泛宿主范圍的大腸桿菌pRK2 ori V；-至少一個(gè)核酸序列，它編碼選擇劑，優(yōu)選抗生素抗性基因，更優(yōu)選賦予細(xì)菌對(duì)卡那霉素抗性的nptIII基因；-編碼至少一種蛋白的trfA基因座，使得可以增加所述質(zhì)粒的復(fù)制率，所述trfA基因座優(yōu)選來自pRK2，更優(yōu)選編碼蛋白P285和P382。
按照一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述載體包含鑒定編號(hào)為SEQ.ID01的核酸序列。再更優(yōu)選所述載體由其核酸序列鑒定編號(hào)為SEQ.ID01的單一質(zhì)粒pMRT1105組成。
按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述載體包括至少一個(gè)編碼第二復(fù)制起點(diǎn)的核酸序列，所述復(fù)制起點(diǎn)優(yōu)選大腸桿菌ori，更優(yōu)選oriColEI。所述載體更優(yōu)選包含鑒定編號(hào)為SEQ.ID02的核酸序列，再更優(yōu)選所述載體由其核酸序列鑒定編號(hào)為SEQ.ID02的單一質(zhì)粒pMRT1106組成。
按照本發(fā)明的合成載體優(yōu)選包含由至少一個(gè)核酸序列構(gòu)成的區(qū)，所述核酸序列含有幾個(gè)獨(dú)特的酶促限制位點(diǎn)，總稱為《多克隆位點(diǎn)》(MCS)。
按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述載體還包括編碼T-DNA的核酸序列，所述T-DNA包含右邊界RB和左邊界LB，使得所述載體可以起雙元質(zhì)粒的作用。
最好是，所述MCS位于所述T-DNA的右邊界RB附近。
按照另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述載體還包括編碼至少一個(gè)表達(dá)啟動(dòng)子和至少一個(gè)位于所述T-DNA的左邊界LB和右邊界RB之間的轉(zhuǎn)錄終止子的核酸序列。更優(yōu)選，所述表達(dá)啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、特異性啟動(dòng)子，最好選自植物表達(dá)啟動(dòng)子。再更優(yōu)選，所述表達(dá)啟動(dòng)子選自35SCaMV啟動(dòng)子、CaMV的ep35S、豌豆質(zhì)體藍(lán)素基因啟動(dòng)子、其“增強(qiáng)子”區(qū)和衍生物、小麥“高分子量麥谷蛋白”(HMWG)啟動(dòng)子、“木薯葉脈花葉病毒”CsVMV啟動(dòng)子、“鴨跖草黃色斑點(diǎn)病毒(commelina yellow mottle virus)”CoYMV啟動(dòng)子、CsVMV和CoYMV啟動(dòng)子的嵌合啟動(dòng)子，以及它們的衍生物。
所述表達(dá)終止子最好是選自植物細(xì)胞中的功能性終止子，優(yōu)選35S或nos終止子。
按照再另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述載體包含至少一個(gè)編碼在植物細(xì)胞中有功能的選擇劑的核酸序列，優(yōu)選包含至少一個(gè)編碼抗生素抗性基因和/或除草劑抗性基因的核酸序列。
所述編碼選擇劑的序列優(yōu)選是編碼bar(《bialaphos抗性》)抗性基因或pat(《膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶》)基因的序列，要不就是編碼突變或野生型抗性基因nptII的序列。再更優(yōu)選，編碼所述選擇劑的核酸序列位于所述T-DNA的左邊界附近。
按照本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，所述載體包括至少一個(gè)含啟動(dòng)表達(dá)的核酸序列的表達(dá)盒，所述核酸序列操作性結(jié)合至要表達(dá)的、編碼需要產(chǎn)生的多肽的核酸序列，其自身結(jié)合至轉(zhuǎn)錄終止核酸序列。需要產(chǎn)生的多肽優(yōu)選是在體外和/或人類和或動(dòng)物中具有活性的酶或蛋白或蛋白衍生物，所述活性包括消化、胰腺、膽汁、抗病毒、抗炎癥、肺、抗微生物、營養(yǎng)、化妝、結(jié)構(gòu)、血液、心血管、眼、抗原、免疫刺激和大腦活性。所述蛋白的實(shí)例例如為胰島素、干擾素、胃、胰腺或膽汁脂肪酶、彈性蛋白酶、諸如α-1抗胰蛋白酶的抗蛋白酶、諸如膠原蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白、諸如乳鐵傳遞蛋白的運(yùn)鐵蛋白、衍生自血液的蛋白，諸如血紅蛋白、人白蛋白和血液輔因子，以及諸如超氧化物歧化酶的抗氧化劑。
按照本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述載體以雙元、線性或環(huán)狀質(zhì)粒形式存在，選自鑒定編號(hào)為SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID14、SEQ．ID15、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22的核酸序列。
按照一個(gè)特別有利的實(shí)施方案，所述載體的每個(gè)功能元件都可以獨(dú)立于其它元件被切割。最好是，每個(gè)功能元件都可以獨(dú)立于其它元件，在存在于同一載體中的第一獨(dú)特限制位點(diǎn)和第二獨(dú)特限制位點(diǎn)的水平上通過酶促消化進(jìn)行切割。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是分離的核酸序列，其特征在于它相當(dāng)于選自以下的核酸序列鑒定編號(hào)為SEQ.ID01、SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID14、SEQ.ID15、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.1D19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22的核酸序列。
本發(fā)明的再另一目的是包含如較早所述的載體或核酸序列的細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選是植物細(xì)胞。
本發(fā)明的再另一目的是如較早所述的載體或核酸序列穩(wěn)定整合入其基因組的轉(zhuǎn)基因植物。所述植物優(yōu)選選自雙子葉物種，例如馬鈴薯、煙草、棉花、萵苣、番茄、甜瓜、黃瓜、豌豆、油菜、甜菜根或向日葵，或選自單子葉植物，例如小麥、大麥、燕麥、稻或玉米。
本發(fā)明的再另一目的是如較早所述的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖體。所述繁殖體優(yōu)選是種子。
本發(fā)明的再另一目的是一種方法，用于在細(xì)胞中表達(dá)核酸序列或基因，所述核酸序列或基因編碼需要產(chǎn)生的多肽，所述方法的特征在于包含以下的幾個(gè)階段-用如較早所述的載體或核酸序列轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞；-在允許核酸序列或基因表達(dá)的條件下，制備所述細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中所述核酸序列或基因編碼需要產(chǎn)生的多肽。所述細(xì)胞優(yōu)選是原核或真核細(xì)胞。所述細(xì)胞更優(yōu)選選自微生物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。所述細(xì)胞再更優(yōu)選為植物細(xì)胞。
本發(fā)明的再另一目的是一種獲得如較早所述的轉(zhuǎn)基因植物或繁殖體的方法，其特征在于包含以下的幾個(gè)階段-用權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的核酸序列或包含其的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；-選擇所述載體或核酸序列整合入其中的植物細(xì)胞；-或者通過培養(yǎng)或者通過再生嵌合型全株或轉(zhuǎn)基因全株，繁殖轉(zhuǎn)化并選擇的植物細(xì)胞。
因此，按照本發(fā)明的新合成載體，優(yōu)選為雙元質(zhì)粒，僅含有所述載體的功能性和轉(zhuǎn)基因發(fā)生必需的區(qū)。本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)它們具有高復(fù)制率。另外，它們可以在左邊界附近含有一個(gè)選擇性表達(dá)盒，以及在其《多接頭》(多克隆位點(diǎn))中含有稀有限制位點(diǎn)。
附圖描述根據(jù)下文以實(shí)施例形式給出的不同實(shí)施方案的詳細(xì)描述并參照附圖，可更好地理解本發(fā)明，所述實(shí)施例不是限制性的，其中-


圖1圖解示意按照本發(fā)明的優(yōu)選基本載體，為pMRT1105參考標(biāo)識(shí)的質(zhì)粒形式，長度為3508個(gè)堿基對(duì)；-圖2表示
圖1載體變體的示意圖，為pMRT1106參考標(biāo)識(shí)的質(zhì)粒形式，長度為4098個(gè)堿基對(duì)；-圖3表示按照本發(fā)明的優(yōu)選載體的示意圖，為pMRT1118參考標(biāo)識(shí)的雙元質(zhì)粒形式，長度為5971個(gè)堿基對(duì)，并包括含編碼對(duì)抗生素抗性的選擇性表達(dá)盒和多克隆位點(diǎn)(MCS)的T-DNA；-圖4表示按照?qǐng)D3的載體的優(yōu)選實(shí)施方案，所述多克隆位點(diǎn)(MCS)還包括其它的獨(dú)特位點(diǎn)，所述載體為pMRT1119參考標(biāo)識(shí)的雙元質(zhì)粒形式，長度為6016個(gè)堿基對(duì)；-圖5-22代表按照本發(fā)明的載體的其它優(yōu)選實(shí)施方案，為雙元質(zhì)粒形式，參考標(biāo)識(shí)為pMRT1121(6017個(gè)堿基對(duì))、pMRT1122(6016個(gè)堿基對(duì))、pMRT1155(6017個(gè)堿基對(duì))、pMRT1175(6767個(gè)堿基對(duì))、pMRT1176(6767個(gè)堿基對(duì))、pMRT1191(4805個(gè)堿基對(duì))、pMRT1192(8654個(gè)堿基對(duì))、pMRT1193(9143個(gè)堿基對(duì))、pMRT1195(6865個(gè)堿基對(duì))、pMRT1196(8654個(gè)堿基對(duì))、pMRT1201(7943個(gè)堿基對(duì))、pMRT1202(5614個(gè)堿基對(duì))、pMRT1203(7503個(gè)堿基對(duì))、pMRT1204(9390個(gè)堿基對(duì))、pMRT1205(7503個(gè)堿基對(duì))、pMRT1206(9390個(gè)堿基對(duì))、pMRT1210(10003個(gè)堿基對(duì))和pMRT1212(8987個(gè)堿基對(duì))；-圖23圖示按照本發(fā)明的合成載體和已知載體系統(tǒng)之間的蛋白表達(dá)能力的對(duì)比；圖24-28表示按照本發(fā)明的載體的其它實(shí)施方案，為雙元質(zhì)粒形式，參考標(biāo)識(shí)為pMRT1334(9688bp)、pMRT1335(15208bp)、pMRT1336(9285bp)、pMRT1337(8289bp)、pMRT1341(14108bp)、pMRT1342(15077bp)。
在所述圖中，縮寫具有以下含義-ori RK2具有產(chǎn)生低數(shù)目拷貝的廣泛宿主范圍不穩(wěn)定RK2復(fù)制子的大腸桿菌pRK2的ori V；-ori ColEI大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)ColE1；-nptIII基因；編碼賦予對(duì)卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶；
-nptII基因編碼賦予對(duì)卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶；-trfA來自pRK2、允許產(chǎn)生P285和P382兩種蛋白的trfA基因座(1481bp)，它通過結(jié)合復(fù)制起點(diǎn)增強(qiáng)所述質(zhì)粒的復(fù)制；-Tnosnos(胭脂堿合成酶)終止子；-Pnosnos(胭脂堿合成酶)啟動(dòng)子；-LBT-DNA的左邊界；-RBT-DNA的右邊界；-MCS；多克隆位點(diǎn)，SXXX表示MCS起始?jí)A基的序數(shù)，EXXX表示MCS末端堿基的序數(shù)，列表框以5′→3′方向由頂部的第一限制位點(diǎn)開始，并于底部的最后一個(gè)限制位點(diǎn)終止；-polyA35S轉(zhuǎn)錄終止(聚腺苷酸化)信號(hào)；-gus基因編碼β-葡糖醛酸酶的基因；-IA水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子；-PA水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；-Phmwg小麥《高分子量麥谷蛋白》啟動(dòng)子；-bar(《bialaphos抗性》)基因編碼賦予對(duì)glufosinate抗性的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因；-ep35S35S核糖體的《增強(qiáng)啟動(dòng)子》。
實(shí)施例在下文的詳述中，所有的限制酶酶促消化都按照供應(yīng)商N(yùn)ewEngland Biolabs的建議進(jìn)行。借助于《Qiaquick凝膠提取》試劑盒和《Qiaquick PCR純化》試劑盒，按照供應(yīng)商QIAGEN的建議進(jìn)行純化。按照供應(yīng)商GIBCO BRL Life Technologies的說明書使用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒。所使用的《GeneAmp PCR系統(tǒng)9700》熱循環(huán)儀購自Perkin Elmer Applied Biosystems。實(shí)施例11.合成pMRT1105按照本發(fā)明的純合成載體優(yōu)選以基本質(zhì)粒pMRT1105(3508bp)的形式存在，并由以下元件組成-ori RK2具有產(chǎn)生小數(shù)目拷貝的廣泛宿主范圍不穩(wěn)定RK2復(fù)制子的大腸桿菌pRK2的ori V(643bp)。
-nptIII基因賦予對(duì)卡那霉素抗性(細(xì)菌選擇標(biāo)記，1337bp)。
-TrfA來自pRK2、允許產(chǎn)生P285和P382兩種蛋白的trfA基因座(1481bp)，它通過結(jié)合至所述復(fù)制起點(diǎn)增強(qiáng)所述質(zhì)粒的復(fù)制。
組裝通過剪接重疊延伸《ori RK2》和《部分nptIII》獲得的片段，組裝對(duì)應(yīng)于通過PCR(《聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)》)擴(kuò)增產(chǎn)生的《部分tffA》的片段和組裝通過酶促消化分離的《部分tffA和nptIII》的片段，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRT1105。
1.1.合成具有《ori RK2和部分nptHI》的片段利用各20pmol的以下2種寡脫氧核苷酸含AvrII限制位點(diǎn)的5′AACCTAGGAAAAGACCGAGCGCCTTTGC3′(SEQ.ID23)和具有StuI限制位點(diǎn)的5′CGGATTAATGGTAGAAGGCCTTTCACGGGAGGGTTCGAGAAGG3′(SEQ.ID24)，在50μl終反應(yīng)介質(zhì)中的各200μM的dNTP、60mMTris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶(GIBCO BRL Life Technologies)存在下，通過PCR由5ng pBin19基質(zhì)(matrix)DNA擴(kuò)增具有《ori RK2》(643bp)的AvrII-StuI片段(654bp)。在《GeneAmp PCR系統(tǒng)9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性3分鐘后，對(duì)所述DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下階段組成94℃30秒的變性期、55℃30秒的雜交期和68℃45秒的伸長期。然后在最后一個(gè)循環(huán)中，所述伸長于68℃持續(xù)3分鐘。然后，在各2μl的10mM dNTP存在下，使40μl的PCR反應(yīng)介質(zhì)經(jīng)受12.5U Klenow片段(New England Biolabs)的作用。反應(yīng)于37℃進(jìn)行10分鐘。然后通過在TBE緩沖液(90mM Tris-HCl、2mMNa2-EDTA、90mM硼酸，pH8.0)中的2％瓊脂糖凝膠電泳分離如此處理的PCR產(chǎn)物，并利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化。在30μl水中回收所述DNA。
擴(kuò)增具有《部分nptIII》(344bp)的StuI-BstXI片段(363 bp)，并以和《ori RK2》片段相同的方式處理，例外的是所使用的2個(gè)寡脫氧核苷酸為含StuI限制位點(diǎn)的5′TGAAAGGCCTTCTACCATTAATCCGCGATAAACCCAGCGAACC3′(SEQ.ID25)和具有BstXI限制位點(diǎn)的5′ATGCATCCAAAATTTTGGTAGAATTTACAAGCTATAAGGTTATTGTCCTGGG 3′(SEQ.ID26)。
然后為了獲得片段《ori RK2和部分nptIII》，通過剪接重疊延伸裝配具有《ori RK2》和《部分nptIII》的2個(gè)片段。為此，利用各20pmol的寡脫氧核苷酸5′AACCTAGGAAAAGACCGAGCGCCTTTGC3′(SEQ.ID23)和5′ATGCATCCAAAATTTTGGTAGAATTTACAAGCTATAAGGTTATTGTCCTGGG 3′(SEQ.ID26)，在50μl終反應(yīng)介質(zhì)中的各200μM dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶存在下，由各7.5μl的對(duì)應(yīng)于《ori RK2》和《部分nptIII》的處理的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在《GeneAmp PCR系統(tǒng)9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。于94℃變性3分鐘后，對(duì)所述DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由以下階段組成94℃30秒的變性期、62℃30秒的雜交期和68℃45秒的伸長期。然后在最后一個(gè)循環(huán)中，所述伸長于68℃持續(xù)3分鐘。然后，使40μl的PCR反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行TBE緩沖液中的1.5％瓊脂糖凝膠電泳，并利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化。在30μl水中回收對(duì)應(yīng)于具有《ori RK2》和《部分nptIII》的片段的DNA。接著，用BstXI繼之以AvrII水解27μl的該DNA，然后利用《QIAquick PCR純化》試劑盒純化，并在30μl水中回收。
1.2.合成具有《部分trfA》的片段擴(kuò)增具有《部分trfA》(295bp)的NdeI-AvrII片段(295bp)，并以和片段《ori RK2》同樣的方式處理，例外的是所用的兩個(gè)寡脫氧核苷酸為位于NdeI位點(diǎn)上游的5′ATCGACGAGGAAATCGTCGTGCTGTTTGC3′(SEQ.ID27)和具有AvrII限制位點(diǎn)的5′AAACCTAGGAAATGCCAGTAAAGCGCTGGC3′(SEQ.ID28)。然后利用《QIAquick PCR純化》試劑盒純化對(duì)應(yīng)于由PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的《部分trfA》的DNA片段，回收在30μl水中，用AvrII和NdeI水解，利用《QIAquick PCR純化》試劑盒再純化并回收在30μl水中。
1.3.合成具有《部分trfA和nptIII》的片段通過用BstXI酶促消化，由9μg pBin19 DNA中分離具有《部分trfA和nptIII》(2196bp)的BstXI-NdeI片段(2196bp)，利用《QIAquickPCR純化》試劑盒純化，然后用NdeI水解。再后通過在TBE緩沖液中的0.9％瓊脂糖凝膠電泳分離所述DNA片段，利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化并回收在30μl水中。
1.4.獲得pMRT1105連接以下3個(gè)片段《ori RK2和部分nptIII》、《部分trfA和nptIII》和《部分trfA》。為此，用SpeedVac AES1000(SAVANT)濃縮包含7.5μl對(duì)應(yīng)于《ori RK2和部分nptIII》和《部分tffA和nptIII》的消化片段和11μl對(duì)應(yīng)于《部分trfA》的消化片段的反應(yīng)混合物，以便達(dá)到8μl的體積。此后，加入1μlT4DNA連接酶×10緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs)。通過由200個(gè)循環(huán)組成的PCR反應(yīng)在《GeneAmp PCR System 9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行連接，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)階段，一個(gè)階段為30℃30秒，另一個(gè)階段為10℃30秒。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α(Hanaban，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB，細(xì)菌用胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl10g/l、瓊脂15g/l，pH7.5)上選擇獲得克隆，通過堿裂解法(Bimboim和Doly，1979)提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的選擇質(zhì)粒叫做pMRT1105(3508bp)并示于
圖1。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID01。
2.合成pMRT1106質(zhì)粒pMRT1106(4098bp)和質(zhì)粒pMRT1105的區(qū)別在于其加入了大腸桿菌ColE1復(fù)制起點(diǎn)(《ori ColE1》)。
由購自New England Biolabs的質(zhì)粒pBR322分離具有《oriColE1》(590bp)的片段。用NdeI消化所述質(zhì)粒(5μg)，利用《QIAquickPCR純化》試劑盒純化并回收在30μlTE緩沖液(10mM Tris-HCl、1mM Na2-EDTA，pH8.0)中。因此線性化的所述質(zhì)粒在12μl 500mMTris-HCl，pH7.5-500mM MgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，在120μl反應(yīng)體積中于37℃經(jīng)受20單位的Klenow片段(New England Biolabs)作用30分鐘。利用《QIAquick PCR純化》試劑盒純化如此處理的線性化質(zhì)粒，并回收在30μl水中。然后用AlwNI消化，以便分離具有《ori ColEl》的片段，利用《QIAquickPCR純化》試劑盒純化，并在12μlT4DNA聚合酶×10緩沖液、4μl10mM dNTP和6μlBSA 1mg/ml存在下于120μl反應(yīng)介質(zhì)中經(jīng)受6單位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用。所述反應(yīng)于37℃進(jìn)行30分鐘。然后通過在TBE緩沖液中的1.2％瓊脂糖凝膠電泳分離所述DNA片段，利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化，并回收在50μl水中。然后將該DNA片段插入到StuI消化的質(zhì)粒pMRT1105(2μg)中，利用《QIAquick PCR純化》試劑盒純化，在120μl的終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl3×10緩沖液(New England Biolabs)存在下利用50單位的牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化1小時(shí)，并用《QIAquick PCR純化》試劑盒純化。在10μl的反應(yīng)介質(zhì)中，在1μlT4DNA連接酶×10緩沖液(New England Biolabs)和400單位T4DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，通過pCR反應(yīng)對(duì)10ng消化的去磷酸化pMRT1105質(zhì)粒和100ng具有《ori ColE1》的DNA片段進(jìn)行連接。所述反應(yīng)在《GeneAmp PCR System 9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行180個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)階段，一個(gè)階段為10℃30秒，另一個(gè)階段為30℃30秒。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。使用各10pmol的兩個(gè)寡脫氧核苷酸5′AACCTAGGAAAAGACCGAGCGCCTTTGC3′(SEQ.ID23)和5′ATGCATCCAAAATTTTGGTAGAATTTACAAGCTATAAGGTTATTGTCCTGGG 3′(SEQ.ID26)，在24μl的反應(yīng)介質(zhì)中在22μl的SuperMixPCR(GIBCO BRL Life Technologies)存在下，通過對(duì)細(xì)菌菌落進(jìn)行PCR測試，核實(shí)所獲得的克隆的有效性。所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)在《GeneAmpPCR System 9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行。于94℃變性5分鐘后，所述DNA進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)包括94℃30秒的變性期、60℃30秒的雜交期和72℃30秒的伸長期。然后，在最后一個(gè)循環(huán)中，所述伸長于72℃持續(xù)7分鐘。然后所述PCR反應(yīng)介質(zhì)經(jīng)受在TBE緩沖液中的1％瓊脂糖凝膠電泳。對(duì)插入的《ori ColE1》序列顯色，顯示存在約1.6Kbp的片段。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的選擇質(zhì)粒叫做pMRT1106(4098bp)并示于圖2。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID02.
3.合成pMRT1118質(zhì)粒pMRT1118(5971bp)與pMRT1106的不同之處在于在pMRT1106中引入了純轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)。該純T-DNA由處于根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合酶基因(nos，Depicker等，1982)的啟動(dòng)子和終止子控制下的突變nptII基因(Frisch等，1995)表達(dá)盒組成，該表達(dá)盒位于根癌農(nóng)桿菌胭脂堿菌株的質(zhì)粒pTiT37的右邊界(RB)和左邊界(LB)之間。
3.1.合成具有《末端nptII-Tnos-LB》的片段3.1.1.獲得具有LB的片段用各20pmol的兩個(gè)寡脫氧核苷酸含AvrII和AatII限制位點(diǎn)的5′TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG 3′(SEQ.ID29)和具有SmaI限制位點(diǎn)的5′CCTATGGATATCCCCCGGGGGATAGCCCCAGTACATTAAAAACGTCC 3′(SEQ.ID30)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶(GIBCO BRLufe Technologies)存在下，在50μl終反應(yīng)介質(zhì)中通過PCR由5ngpBin19基質(zhì)DNA擴(kuò)增具有LB(151bp)的AvrII-SmaI片段(173bp)。在《GeneAmp PCR系統(tǒng)9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性3分鐘后，對(duì)所述DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)由以下階段組成94℃30秒的變性期、55℃30秒的雜交期和68℃45秒的伸長期。然后在最后一個(gè)循環(huán)中，所述伸長于68℃持續(xù)3分鐘。然后，在各2μl的10mM dNTP存在下，使40μl的所述PCR反應(yīng)介質(zhì)經(jīng)受12.5U Klenow片段(New England Biolabs)的作用。所述反應(yīng)于37℃進(jìn)行10分鐘。然后通過在TBE緩沖液中的2％瓊脂糖凝膠電泳分離如此處理的PCR產(chǎn)物，并利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化。在50μl水中回收所述DNA。
3.1.2.獲得具有nos終止子(Tnos)的片段擴(kuò)增具有nos終止子(256bp)的SmaI-BspEI片段(288bp)，并以和具有LB的片段相同的方式進(jìn)行處理，例外的是所使用的兩個(gè)寡脫氧核苷酸為含SmaI限制位點(diǎn)的5′CTATCCCCCGGGGGATATCCATAGGCCCGATCTAGTAACATAGATGAC3′(SEQ.ID31)和具有Bsp120I限制位點(diǎn)的5′GCGCACTTGGGCCCATAGCTCGACGAACGATCGTTCAAACATTTGGC 3′(SEQ.ID32)。
3.1.3.獲得具有《nptII末端》基因(《末端nptII》)的片段擴(kuò)增具有《末端nptII》(221bp)的片段(221bp)，并以和具有LB的片段相同的方式進(jìn)行處理，例外的是所使用的兩個(gè)寡脫氧核苷酸為含Bsp120I限制位點(diǎn)的5′TTCGTCGAGCTATGGGCCCAAGTGCGCATCCCGTGGGCGAAGAACTC3′(SEQ.ID33)和BstBI下游的5′TTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGG 3′(SEQ.ID34)。
3.1.4.獲得片段《末端nptII-Tnos-LB》通過剪接重疊延伸，以兩個(gè)階段裝配片段《LB》、《Tnos》和《末端nptII》-裝配片段《LB》和《Tnos》，產(chǎn)生片段《Tnos-LB》，-裝配片段《Tnos-LB》和片段《末端nptII》，產(chǎn)生片段《末端nptII-Tnos-LB》。
為此，用各20pmol的寡脫氧核苷酸5′TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG3′(SEQ.ID29)和5′GCGCACTTGGGCCCATAGCTCGACGAACGATCGTTCAAACATTTGGC 3′(SEQ.ID32)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶(GIBCOBRLLife Technologies)存在下，在50μl終反應(yīng)介質(zhì)中由對(duì)應(yīng)于《LB》和《Tnos》的各10μl處理的PCR產(chǎn)物進(jìn)行第一個(gè)PCR擴(kuò)增。在《GeneAmp PCR系統(tǒng)9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性3分鐘后，對(duì)所述DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)由以下階段組成94℃45秒的變性期、62℃45秒的雜交期和68℃1分鐘的伸長期。然后在最后一個(gè)循環(huán)中，所述伸長于68℃持續(xù)3分鐘。然后，在各2μl的10mM dNTP存在下，使40μl的所述PCR反應(yīng)介質(zhì)經(jīng)受12.5U Klenow片段(New England Biolabs)的作用。所述反應(yīng)于37℃進(jìn)行10分鐘。然后通過在TBE緩沖液中的2％瓊脂糖凝膠電泳分離如此處理的對(duì)應(yīng)于片段《Tnos-LB》(477bp)的PCR產(chǎn)物，并利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化。在30μl水中回收所述DNA。
用各20pmol的寡脫氧核苷酸5′TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG3′(SEQ.ID29)和5′TTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGG 3′(SEQ.ID34)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGAsE酶(GIBCO BRL Life Technologies)存在下，在50μl終反應(yīng)介質(zhì)中由對(duì)應(yīng)于《末端nptII》和《Tnos-LB》的各7μl處理的PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二個(gè)PCR擴(kuò)增。在《GeneAmp PCR系統(tǒng)9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性3分鐘后，對(duì)所述DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)由以下階段組成94℃45秒的變性期、60℃45秒的雜交期和68℃1分鐘的伸長期。然后在最后一個(gè)循環(huán)中，所述伸長于68℃持續(xù)3分鐘。使對(duì)應(yīng)于《末端nptII》和《Tnos-LB》的處理的PCR產(chǎn)物重復(fù)該反應(yīng)3次。然后使所述PCR反應(yīng)介質(zhì)經(jīng)受在TBE緩沖液中的2％瓊脂糖凝膠電泳，并利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化。在100μl水中回收對(duì)應(yīng)于《末端nptII-Tnos-LB》的DNA片段(672bp)。接著，用AvrII水解95μl該DNA，用《QIAquickPCR純化》試劑盒純化，用BstBI消化，用《QIAquickPCR純化》試劑盒純化，并在50μl水中回收。631bp的AvrII-BstBI片段具有序列《末端nptII-Tnos-LB》。
3.2.合成具有《nos啟動(dòng)子(Pnos)末端和nptII基因起始端》(末端Pnos-起始端nptII)的片段擴(kuò)增具有《末端Pnos-起始端nptII》的片段(1023bp)，并和具有LB的片段相同的方式進(jìn)行處理，例外的是所使用的兩個(gè)寡脫氧核苷酸為 5′GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG3′(SEQ.ID39)和5′ATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCC 3′(SEQ.ID40)，以及所述DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)由94℃45秒的變性期、55℃45秒的雜交期和68℃1分鐘的伸長期組成。對(duì)兩個(gè)pBin19 DNA樣品重復(fù)所述擴(kuò)增。
3.3.合成片段《末端Pnos-nptII-Tnos-LB》通過剪接重疊延伸裝配片段《末端Pnos-起始端nptII》和《末端nptII-Tnos-LB》，以產(chǎn)生片段《末端Pnos-nptII-Tnos-LB》。
為此，用各20pmol的寡脫氧核苷酸5′TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGCCTGCCTGTATCG 3′(SEQ.ID29)和5′ATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCC 3′(SEQ.ID40)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶(GIBCOBRL Life Technologies)存在下，在50μl終反應(yīng)介質(zhì)中由對(duì)應(yīng)于《末端Pnos-起始端nptII》和《末端nptII-Tnos-LB》的各5μl處理的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在《GeneAmp PCR系統(tǒng)9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性3分鐘后，對(duì)所述DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)由以下階段組成94℃45秒的變性期、55℃45秒的雜交期和68℃1分鐘的伸長期。然后在最后一個(gè)循環(huán)中，所述伸長于68℃持續(xù)3分鐘。對(duì)每種對(duì)應(yīng)于《末端Pnos-起始端nptII》和《末端nptII-Tnos-LB》的處理的PCR產(chǎn)物重復(fù)該反應(yīng)5次。然后使所述PCR反應(yīng)介質(zhì)經(jīng)受在TBE緩沖液中的0.7％瓊脂糖凝膠電泳，并利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化。在50μ1水中回收對(duì)應(yīng)于《末端Pnos-nptII-Tnos-LB》的DNA片段(1608bp)。接著，在15μl Klenow片段×10緩沖液(NewEng1and Biolabs)和各10μl的10mM dNTP存在下，使該DNA經(jīng)受62.5U Klenow片段(New England Biolabs)的作用。所述反應(yīng)于37℃進(jìn)行10分鐘。然后利用《QIAquick PCR純化》試劑盒純化如此處理的DNA，并在50μl水中回收。
3.4.合成具有《RB-MCS-Pnos起始端》的片段3.4.1.獲得具有《RB和多克隆位點(diǎn)(MCS)》(《RB-MCS》)的片段擴(kuò)增具有《RB-MCS》的片段(210bp)，并以和具有LB的片段相同的方式進(jìn)行處理，例外的是所使用的兩個(gè)寡脫氧核苷酸為具有限制位點(diǎn)KpnI、HindIII、EcoRI和XhoI的5′CGGTACCGAAGCTTTGAATTCACTCGAGCAGATTGTCGTTTCCCGCC3′(SEQ.ID35)和具有限制位點(diǎn)AvrII和AgeI的5′TATCCTAGGAACCGGTAAACCCTGTGGTTGGCATGC 3′(SEQ.ID36)。
3.4.2.獲得具有《多克隆位點(diǎn)(MCS)和nos啟動(dòng)子(Pnos)起始端》(《MCS-Pnos起始端》)的片段擴(kuò)增具有《MCS-Pnos起始端》的片段(209bp)，并以和具有LB的片段相同的方式進(jìn)行處理，例外的是所使用的兩個(gè)寡脫氧核苷酸為5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3′(SEQ.ID37)和具有限制位點(diǎn)XhoI、EcoRI、HindIII和KpnI的5′GCTCGAGTGAATTCAAAGCTTCGGTACCGTTGAAGGAGCCACTCAGCCG 3′(SEQ.ID38)。
3.4.3.獲得具有《RB-MCS-Pnos起始端》的片段通過剪接重疊延伸裝配片段《RB-MCS》和《MCS-Pnos起始端》，以產(chǎn)生片段《RB-MCS-Pnos起始端》。
為此，用各20pmol的寡脫氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3′(SEQ.ID37)和5′TATCCTAGGAACCGGTAAACCCTGTGGTTGGCATGC 3′(SEQ.ID36)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶(GIBCO BRL LifeTechnologies)存在下，在50μl終反應(yīng)介質(zhì)中由對(duì)應(yīng)于《RB-MCS》和《MCS-Pnos起始端》的各12μl處理的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在《GeneAmp PCR系統(tǒng)9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性3分鐘后，對(duì)所述DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)由以下階段組成94℃30秒的變性期、60℃30秒的雜交期和68℃45秒的伸長期。然后在最后一個(gè)循環(huán)中，所述伸長于68℃持續(xù)3分鐘。對(duì)每種剩余3×12μl的對(duì)應(yīng)于《RB-MCS》和《MCS-Pnos起始端》的處理的PCR產(chǎn)物重復(fù)該反應(yīng)。然后使所述PCR反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行在TBE緩沖液中的2％瓊脂糖凝膠電泳，并利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒(QIAGEN)純化。在100μl水中回收對(duì)應(yīng)于《RB-MCS-Pnos起始端》的DNA片段(390bp)。接著，用AvrII水解95μl該DNA，用《QIAquick PCR純化》試劑盒純化，用Bsu36I消化，用《QIAquickPCR純化》試劑盒純化，并在50μl水中回收。295bp的AvrII-Bsu36I片段具有序列《RB-MCS-Pnos起始端》。
3.5.合成T-DNA通過剪接重疊延伸裝配片段《RB-MCS-Pnos起始端》和《末端Pnos-nptII-Tnos-LB》，以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于T-DNA(1883bp)的片段《RB-MCS-Pnos-nptII-Tnos-LB》。
為此，用各20pmol的寡脫氧核苷酸5′TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG 3′(SEQ.ID29)和5′TATCCTAGGAACCGGTAAACCCTGTGGTTGGCATGC3′(SEQ.ID36)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGAsE酶(GIBCO BRL LifeTechnologies)存在下，在50μl終反應(yīng)介質(zhì)中由4μl對(duì)應(yīng)于《RB-MCS-Pnos起始端》的處理PCR產(chǎn)物和5μl對(duì)應(yīng)于《末端Pnos-nptII-Tnos-LB》的處理PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在《GeneAmpPCR系統(tǒng)9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性3分鐘后，對(duì)所述DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)由以下階段組成94℃45秒的變性期、55℃45秒的雜交期和68℃1分鐘的伸長期。然后在最后一個(gè)循環(huán)中，所述伸長于68℃持續(xù)3分鐘。對(duì)每種對(duì)應(yīng)于《RB-MCS-Pnos起始端》和《末端Pnos-nptII-Tnos-LB》的處理的PCR產(chǎn)物重復(fù)該反應(yīng)10次。然后使所述PCR反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行在TBE緩沖液中的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，并利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化。在100μl水中回收對(duì)應(yīng)于T-DNA的DNA片段(1883bp)。接著，用AvrII水解該T-DNA(1873bp片段)，用《QIAquick PCR純化》試劑盒純化，并在100μl水中回收。
3.6.獲得pMRT1118將AvrII消化的T-DNA質(zhì)粒引入去磷酸化的pMRT1106質(zhì)粒的AvrII位點(diǎn)中，產(chǎn)生雙元質(zhì)粒pMRT1118(5971bp)。
為此，用AvrII消化pMRT1106質(zhì)粒(5μg)，利用《QIAquickPCR純化》試劑盒純化，然后在120μl的終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl3×10緩沖液(New England Biolabs)存在下利用50單位的牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化1小時(shí)，通過在TBE緩沖液中的0.6％瓊脂糖凝膠電泳分離，利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化，在前述條件下用牛小腸堿性磷酸酶第二次去磷酸化，最后用《QIAquick PCR純化》試劑盒純化，回收在50μl水中。
在10μl的反應(yīng)介質(zhì)中，在1μlT4DNA連接酶×10緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位T4 DNA連接酶(New Englandd Biolabs)存在下，通過PCR反應(yīng)對(duì)32.5ng消化的去磷酸化pMRT1106質(zhì)粒和50ng消化的T-DNA片段進(jìn)行連接。所述反應(yīng)在《GeneAmp PCR System9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行180個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)階段，一個(gè)階段為10℃30秒，另一個(gè)階段為30℃30秒。
轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法(Bimboim和Doly，1979)提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的選擇質(zhì)粒叫做pMRT1118(圖3)。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID03。
4.合成pMRT1119質(zhì)粒pMRT1119(6016bp)與pMRT1118的不同之處在于在pMRT1118的多克隆位點(diǎn)MCS中加入了額外的獨(dú)特限制位點(diǎn)。
4.1.獲得額外的獨(dú)特限制位點(diǎn)通過雜交兩個(gè)寡脫氧核苷酸5′AGCTTGGCCGGCCGTTAACACGCGTGGATCCTTAATTAAGTCGACTCTAGAG3′(SEQ.ID41)和5′AATTCTCTAGAGTCGACTTAATTAAGGATCCACGCGTGTTAACGGCCGGCCA 3′(SEQ.ID42)，產(chǎn)生額外的獨(dú)特限制位點(diǎn)(XbaI、SaII、PacI、BamHI、MluI、HipaI和FseI)。為此，混合各5μg的所述兩個(gè)寡脫氧核苷酸，并于85℃保持1分鐘，接著溫度在5分鐘內(nèi)逐漸下降至80℃，然后在水浴中溫度緩慢下降至60℃，最后在水浴外溫度迅速下降至室溫。
4.2.獲得pMRT1119將具有所述獨(dú)特限制位點(diǎn)的序列引入到pMRT1118質(zhì)粒的HindIII和EcoRI位點(diǎn)中，產(chǎn)生雙元質(zhì)粒pMRT1119(6016bp)。
為此，用HindIII和EcoRI雙重消化pMRT1118質(zhì)粒DNA(5μg)，利用《QIAquick PCR純化》試劑盒純化，并回收在50μl水中。
在10μl的反應(yīng)介質(zhì)中，在1μlT4 DNA連接酶×10緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，通過PCR反應(yīng)對(duì)75ng消化的pMRT1118質(zhì)粒和500ng具有所述獨(dú)特限制位點(diǎn)(描述于4.1.)的片段進(jìn)行連接。所述反應(yīng)在《GeneAmpPCR System 9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行180個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)階段，一個(gè)階段為10℃30秒，另一個(gè)階段為30℃30秒。
轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的選擇質(zhì)粒叫做pMRT1119(圖4)。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID04。
5.合成pMRT1121將在根癌農(nóng)桿菌的胭脂堿合酶啟動(dòng)子(Pnos)和突變nptII基因之間的獨(dú)特限制位點(diǎn)BspEI插入到pMRT1119中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRT1121(6017bp)。
通過剪接重疊延伸裝配兩個(gè)PCR擴(kuò)增獲得的片段，從而插入BspEI位點(diǎn)。
5.1.合成具有“部分nptII和BspEI位點(diǎn)”的片段用各20pmol的兩個(gè)寡脫氧核苷酸5′GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG 3′(SEQ.ID39)和具有BspEI位點(diǎn)的5′TAATCTGCATCCGGATCTGGATCGTTTCGC 3′(SEQ.ID43)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶(GIBCO BRL LifeTechnologies)存在下，在50μl終反應(yīng)介質(zhì)中由5ng pBin19基質(zhì)DNA通過PCR擴(kuò)增具有“部分nptII和BspEI位點(diǎn)”的892bp片段。重復(fù)該反應(yīng)。在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性3分鐘后，對(duì)所述DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)由以下階段組成94℃45秒的變性期、55℃45秒的雜交期和68℃1分鐘的伸長期。然后在最后一個(gè)循環(huán)中，所述伸長于68℃持續(xù)3分鐘。通過在TBE緩沖液中的2％瓊脂糖凝膠電泳分離如此獲得的PCR產(chǎn)物，并利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化。在50μl水中回收所述DNA。
5.2.合成具有“BspEI位點(diǎn)-MCS”的片段用各20pmol的兩個(gè)寡脫氧核苷酸5′GCTCGAGTGAATTCAAAGCTTCGGTACCGTTGAAGGAGCCACTCAGCCG3′(SEQ.ID38)和具有BspEI位點(diǎn)的5′ACGATCCAGATCCGGATGCAGATTATTTGG 3′(SEQ.ID44)，用5ngpMRT1118基質(zhì)DNA通過PCR擴(kuò)增具有“BspEI位點(diǎn)-MCS”的片段(250 bp)。PCR擴(kuò)增和處理所獲得的PCR片段的條件和在5.1.中描述的一樣。
5.3.合成具有“部分nptII-MCS”的片段通過剪接重疊延伸裝配兩個(gè)PCR片段“部分nptII-BspEI位點(diǎn)”和“BspEI位點(diǎn)-MCS”，產(chǎn)生具有“部分nptII-MCS”的1117bp的片段。
為此，用各20pmol的兩個(gè)寡脫氧核苷酸5′GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG3′(SEQ.ID39)和 5′GCTCGAGTGAATTCAAAGCTTCGGTACCGTTGAAGGAGCCACTCAGCCG 3′(SEQ.ID38)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶(GIBCOBRL Life Technologies)存在下，在50μl終反應(yīng)介質(zhì)中由各7.5μl的對(duì)應(yīng)于“部分nptII-BspEI位點(diǎn)”和“BspEI位點(diǎn)-MCS”的處理的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。重復(fù)該反應(yīng)4次。在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性3分鐘后，對(duì)所述DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)由以下階段組成94℃45秒的變性期、62℃45秒的雜交期和68℃1分鐘的伸長期。然后在最后一個(gè)循環(huán)中，所述伸長于68℃持續(xù)7分鐘。通過在TBE緩沖液中的1％瓊脂糖凝膠電泳分離如此獲得的PCR產(chǎn)物，并利用“QIAquick凝膠提取”試劑盒純化。在50μl水中回收所述DNA，用Bsu36I和PstI消化，并經(jīng)受在TEB緩沖液中的2％瓊脂糖凝膠電泳。分離315bp的DNA片段，并利用“QIAquick凝膠提取”試劑盒純化。
5.4.獲得pMRT1121將具有BspEI位點(diǎn)的315bp的DNA片段Bsu36I-PstI連接至雙元質(zhì)粒pMRT1119的Bsu36I和PstI位點(diǎn)。
預(yù)先用Bsu36I和PstI消化質(zhì)粒pMRT1119，使其經(jīng)受在TEB緩沖液中的1％瓊脂糖凝膠電泳，并利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化。在50μl水中回收所述DNA，在120μl的終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl3×10緩沖液(New England Biolabs)存在下利用50單位的牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化1小時(shí)，利用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化。
在10μl的反應(yīng)介質(zhì)中，在1μlT4DNA連接酶×10緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位T4DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，通過PCR反應(yīng)對(duì)100ng消化的去磷酸化pMRT1119質(zhì)粒和30ng消化的DNA片段(315bp)進(jìn)行連接。所述反應(yīng)在“GeneAmp PCRSystem 9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行180個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)階段，一個(gè)階段為10℃30秒，另一個(gè)階段為30℃30秒。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α或SCS110(Dam和Dcm甲基化酶缺陷)(hanahan，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mhg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1121(圖5)。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID05。
6.合成pMRT1122將突變nptII基因中的點(diǎn)突變引入pMRT1119中，以便恢復(fù)BglII限制位點(diǎn)，并因此導(dǎo)致獲得野生型nptII基因，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pMRT1122(6016bp)。
為此，按照Michael法(1994)通過定向誘變，恢復(fù)pMRT1119的突變nptII基因中的BglII限制位點(diǎn)。
在300μl的終反應(yīng)介質(zhì)中，在30μlT4激酶×10緩沖液(Amersham)和3μl 100mMATP存在下，通過使600pmol的寡脫氧核苷酸5′ATGGGTCACGACGAGATCTTCGCCGTCGGG 3′(SEQ.ID45)經(jīng)受90單位的T4激酶(Amersham)的作用，預(yù)先使所述寡脫氧核苷酸磷酸化。利用《Qiaquick去除核苷酸》(QIAGEN)試劑盒，按照供應(yīng)商的建議純化如此處理的所述寡脫氧核苷酸。
然后利用各200pmol的寡脫氧核苷酸5′GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG 3′(SEQ.ID39)、含BglII限制位點(diǎn)的磷酸化的5′ATGGGTCACGACGAGATCTTCGCCGTCGGG3′(SEQ.ID45)和5′ATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCC3′(SEQ.ID40)，在各400μM的dNTP、10μlTaqDNA連接酶×10緩沖液(NewEngland Biolabs)、5單位Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)和40單位Taq DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，在100μl終反應(yīng)介質(zhì)中通過PCR對(duì)10ng pBIN19基質(zhì)進(jìn)行連接。在《GeneAmp PCR系統(tǒng)9700》熱循環(huán)儀中通過執(zhí)行以下三個(gè)連續(xù)階段進(jìn)行所述PCR連接反應(yīng)第一個(gè)階段包括94℃5分鐘的變性期、50℃1分鐘的雜交期和65℃4分鐘的伸長期組成的一個(gè)循環(huán)；第二個(gè)階段由28個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括94℃30秒的變性期、50℃1分鐘的雜交期和65℃4分鐘的伸長期；最后，最后一個(gè)階段包括由94℃30秒的變性期、50℃1分鐘的雜交期和65℃15分鐘的伸長期組成的一個(gè)循環(huán)。然后使所述PCR反應(yīng)介質(zhì)經(jīng)受在TBE緩沖液中的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，并利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化。用NcoI和PstI水解如此處理的所述DNA片段(1023bp)，并進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。分離383bp的DNA片段，并利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化，在50μl水中回收，并連接至pMRT1119質(zhì)粒的NcoI和PstI位點(diǎn)。為此，利用NcoI和PstI消化pMRT1119質(zhì)粒DNA，在0.8％瓊脂糖凝膠上純化。分離對(duì)應(yīng)于所述質(zhì)粒的片段，利用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化，然后，在120μl的終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl 3×10緩沖液(NewEnglandBiolabs)存在下利用50單位的牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化l小時(shí)，最后在50μ1水中回收。
在10μl的反應(yīng)介質(zhì)中，在1μl T4 DNA連接酶×10緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位T4DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，通過PCR對(duì)50ng消化的去磷酸化pMRT1119質(zhì)粒和所有消化并處理的DNA片段進(jìn)行連接。所述反應(yīng)在《GeneAmp PCR System9700》熱循環(huán)儀中進(jìn)行180個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)階段，一個(gè)階段為10℃30秒，另一個(gè)階段為30℃30秒。
轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α(hanahan，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，并通過用BglII消化進(jìn)行篩選。通過酶促消化和測序核實(shí)所選擇克隆的質(zhì)粒DNA。產(chǎn)生的選擇質(zhì)粒叫做pMRT1122(6016bp)。該質(zhì)粒示于圖6，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID06。7.合成pMRT1155質(zhì)粒pMRT1155(6017bp)與pMRT1122的不同之處在于其存在BspEI位點(diǎn)。
為此，通過用Bsu36I和PstI消化pMRT1121，在TEB緩沖液中的1.2％瓊脂糖凝膠電泳，利用“QIAquick凝膠提取”試劑盒純化，以及在50μl水中回收，獲得含BspEI位點(diǎn)的315bp的插入片段。
通過用Bsu36I和PstI消化pMRT1122，在TEB緩沖液中的1.2％瓊脂糖凝膠電泳，利用“QIAquick凝膠提取”試劑盒純化，以及在50μl水中回收，獲得pMRT1122載體質(zhì)粒。此后，在120μl的終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl 3×10緩沖液(New England Biolabs)存在下利用50單位的牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃對(duì)消化的pMRT1122去磷酸化1小時(shí)，并用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化。
在10μl的反應(yīng)介質(zhì)中，在1μl T4 DNA連接酶×10緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs)存在下，通過PCR反應(yīng)對(duì)100ng去磷酸化的消化的pMRT1122質(zhì)粒和50ng消化的DNA片段(315bp)進(jìn)行連接。所述反應(yīng)在“GeneAmp PCRSystem 9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行180個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)階段，一個(gè)階段為10℃30秒，另一個(gè)階段為30℃30秒。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α或SCS110(Dam和Dcm甲基化酶缺陷)(hanahan，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，并通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1155(圖7)。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID07。8.獲得含序列“eP35S-T35S”的基本雙元質(zhì)粒8.1.獲得pMRT1205質(zhì)粒pMRT1205(7503bp)包括突變nptII基因的表達(dá)盒和用于克隆目的基因的“雙35S啟動(dòng)子-35S終止子”序列(eP35S-T35S)。該質(zhì)粒通過將花椰菜花葉病毒(CaMV)的eP35S啟動(dòng)子克隆入pMRT1175中產(chǎn)生。所述CaMVeP35S啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)于位于所述35S啟動(dòng)子的TATA元件上游的重復(fù)的轉(zhuǎn)錄激活序列(Kay等，1987)。至于質(zhì)粒pMRT1175(6767bp)，通過將花椰菜花葉病毒的T35S克隆入pMRT1121中產(chǎn)生。轉(zhuǎn)錄終止序列CaMVT35S對(duì)應(yīng)于產(chǎn)生35S轉(zhuǎn)錄物的花椰菜花葉病毒的環(huán)狀雙鏈DNA序列的3′端的非編碼區(qū)(Franck等，1980)。8.1.1.獲得pMRT1175通過將對(duì)應(yīng)于T35S的EcoRI-XhoI插入DNA片段克隆入大腸桿菌菌株SCS110產(chǎn)生的載體pMRT1121的EcoRI和XhoI位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRT1175。
通過用EcoRI和XhoI消化7μg的pMRT1121，利用“QIAquickPCR純化”試劑盒純化，以及在50μl水中回收，獲得pMRT1121載體片段。此后，在120μl的終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl3×10緩沖液(NewEngland Biolabs)存在下利用50單位的牛小腸堿性磷酸酶(New EnglandBiolabs)于37℃對(duì)消化的pMRT1121去磷酸化1小時(shí)，并用“QIAquickPCR純化”試劑盒純化，在50μl水中回收。
通過用EcoRI和XhoI消化衍生自質(zhì)粒pJIT60(Guerineau和Mullineaux，1993)的質(zhì)粒pJIT163，獲得對(duì)應(yīng)于所述T35S(750bp)的EcoRI-XhoI插入DNA片段(757bp)。然后使它們經(jīng)受在TEB緩沖液中的1％瓊脂糖凝膠電泳，用《QIAquick凝膠提取》試劑盒純化，并在30μl水中回收。
如先前在7中所述，通過PCR反應(yīng)對(duì)80ng去磷酸化的消化的pMRT1121質(zhì)粒和80ng消化的插入DNA片段進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，并通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1175(6767bp)。該質(zhì)粒示于圖8，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID08。8.1.2.獲得pMRT1205通過將對(duì)應(yīng)于eP35S的KpnI-HindIII插入DNA片段克隆入載體pMRT1175的KpnI和HindIII位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRT1205。
通過用KpnI和HindIII消化4.1μg的pMRT1175，利用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，以及在100μl水中回收，獲得pMRT1175載體片段。此后，在120μl的終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl3×10緩沖液(New England Biolabs)存在下利用50單位的牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃對(duì)消化的pMRT1175去磷酸化1小時(shí)，并用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，在50μl水中回收。
通過用KpnI和HindIII消化衍生自質(zhì)粒pJIT60(Guerineau和Mullineaux，1993)的質(zhì)粒pJIT163，獲得對(duì)應(yīng)于eP35S(735bp)的KpnI和HindIII插入DNA片段(743bp)。然后使它們經(jīng)受在TEB緩沖液中的1％瓊脂糖凝膠電泳，用“QIAquick凝膠提取”試劑盒純化，并在30μl水中回收。
如先前在7中所述，通過PCR反應(yīng)對(duì)48ng去磷酸化的消化的pMRT1175質(zhì)粒和30ng消化的插入DNA片段進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，并通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1205(7503bp)。該質(zhì)粒示于
圖19，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID19。8.2.獲得pMRT1203質(zhì)粒pMRT1203(7503bp)包括野生型nptII基因的表達(dá)盒和用于克隆目的基因的“雙35S啟動(dòng)子-35S終止子”序列(eP35S-T35S)。該質(zhì)粒通過將花椰菜花葉病毒(CaMV)的eP35S啟動(dòng)子克隆入pMRT1176中產(chǎn)生。至于質(zhì)粒pMRT1176(6767bp)，通過將花椰菜花葉病毒的T35S克隆入pMRT1155中產(chǎn)生。eP35S啟動(dòng)子和T35S終止子如8.1.所述。8.2.1.獲得pMRT1176通過將對(duì)應(yīng)于T35S(750bp)的EcoRI-XhoI插入DNA片段(757bp)克隆入大腸桿菌菌株SCS110產(chǎn)生的載體pMRT1155的EcoRI和XhoI位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRT1176。
按照8.1.1.中描述的方法學(xué)獲得質(zhì)粒pMRT1176，例外的是消化和處理6.3μg的構(gòu)成所述克隆載體的載體pMRT1155。所述質(zhì)粒pMRT1176(6767bp)示于圖9，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID09。8.2.2.獲得pMRT1203通過將對(duì)應(yīng)于eP35S(735bp)的KpnI-HindIII插入DNA片段(743bp)克隆入載體pMRT1176的KpnI和HindIII位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRT1203。
按照8.1.2.中描述的方法學(xué)獲得質(zhì)粒pMRT1203，例外的是消化和處理3.9μg的構(gòu)成所述克隆載體的載體pMRT1176。所述質(zhì)粒pMRT1203(7503bp)示于
圖17。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID17。9.獲得含序列“eP35S-uidA-T35S”的雙元質(zhì)粒使用這些載體轉(zhuǎn)化煙草，以便評(píng)價(jià)它們和測定nptII基因的突變發(fā)生率。9.1.獲得pMRT1206質(zhì)粒pMRT1206(9390bp)包括突變nptII基因的表達(dá)盒和uidA基因(gus)的表達(dá)盒。該質(zhì)粒通過將花椰菜花葉病毒的eP35S啟動(dòng)子克隆入pMRT1196中產(chǎn)生。至于質(zhì)粒pMRT1196(8654bp)，通過將uidA基因(Jefferson RA等，1986)克隆入pMRT1175中產(chǎn)生。9.1.1.獲得pMRT1196通過將對(duì)應(yīng)于uidA基因的插入DNA片段(SmaI-“SacI＋T4DNA聚合酶”)克隆入載體pMRT1175的“XbaI＋Klenow”位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRT1196。
通過用XbaI消化10μg的pMRT1175，利用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化，在50μl水中回收， 以及在120μl反應(yīng)體積中，在12μl500mM Tris-HCl，pH7.5、500mM MgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃經(jīng)受20單位的Klenow片段(New England Biolabs)作用30分鐘，獲得pMRT1175載體片段。然后利用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化，并在50μl水中回收。在120μl終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl3×10緩沖液(New England Biolabs)存在下利用50單位的牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃對(duì)如此消化和處理的質(zhì)粒pMRT1175去磷酸化1小時(shí)，并用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化，在50μl水中回收。
通過用SacI消化pBI221(購自Clontech)，用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化，以及在50μl水中回收，獲得對(duì)應(yīng)于uidA基因(1.8kbp)的插入DNA片段(2μg)。此后，在120μl反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl T4 DNA聚合酶×10緩沖液、 4μl10mM dNTP和6μlBSA1mg/ml存在下，使消化的pBI221經(jīng)受6單位T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用。所述反應(yīng)于37℃進(jìn)行30分鐘。用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化如此處理的質(zhì)粒pBI221，并回收在50μl水中。最后，用SmaI消化如此處理的pBI221。通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離《[SacI＋T4DNA聚合酶]-SmaI》片段(1882bp)，用“QIAquick凝膠提取”試劑盒純化，并在50μl水中回收。
按照在7中所述的方法學(xué)，通過PCR反應(yīng)對(duì)15ng去磷酸化的消化的pMRT1175質(zhì)粒和100ng消化的插入DNA片段進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，并通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1196(8654bp)。該質(zhì)粒示于
圖14，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID14。9.1.2.獲得pMRT1206將對(duì)應(yīng)于eP35S(735bp)的Kpnd-HindIII插入DNA片段(743bp)克隆入載體pMRT1196的KpnI和HindIII位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRT1206(9390bp)。
按照8.1.2.中描述的方法學(xué)獲得質(zhì)粒pMRT1206，例外的是消化和處理2μg的構(gòu)成所述克隆載體的載體pMRT1196。該質(zhì)粒示于圖24，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID24。
按照Holsters等(1978)的方法，通過直接轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pMRT1206引入到根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。9.2.獲得pMRT1204質(zhì)粒pMRT1204(9390bp)包括野生型nptII基因的表達(dá)盒和uidA基因的表達(dá)盒。該質(zhì)粒通過將花椰菜花葉病毒的eP35S啟動(dòng)子克隆入pMRT1192中產(chǎn)生。至于質(zhì)粒pMRT1192(8654bp)，通過將uidA基因克隆入pMRT1176中產(chǎn)生。9.2.1.獲得pMRT1192通過將對(duì)應(yīng)于uidA基因的插入DNA片段(SmaI-“SacI＋T4 DNA聚合酶”)克隆入載體pMRT1176的“XbaI＋Klenow”位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRT1192。
按照9.1.2.中描述的方法學(xué)獲得質(zhì)粒pMRT1192(8654bp)，例外的是所述克隆載體為pMRT1176。該質(zhì)粒示于
圖11，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID11。9.2.2.獲得pMRT1204將對(duì)應(yīng)于eP35S(735bp)的KpnI-HindIII插入DNA片段(743bp)克隆入載體pMRT1192的KpnI和HindIII位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRT1204(9390bp)。
按照8.1.2.中描述的方法學(xué)獲得質(zhì)粒pMRT1204，例外的是消化和處理2μg的構(gòu)成所述克隆載體的載體pMRT1192。該質(zhì)粒示于
圖18，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID18。
按照Holsters等(1978)的方法，通過直接轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pMRT1204引入到根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。10.獲得含bar基因的雙元質(zhì)粒為了評(píng)價(jià)最后的質(zhì)粒，使用它們轉(zhuǎn)化玉米和/或煙草。10.1.產(chǎn)生pMRT1210質(zhì)粒pMRT1210(10003bp)包括bar基因的表達(dá)盒和uidA基因的表達(dá)盒。該質(zhì)粒通過將uidA基因的表達(dá)盒克隆入pMRT1195中產(chǎn)生。至于質(zhì)粒pMRT1195(6865bp)，通過將序列“水稻肌動(dòng)蛋白基因內(nèi)含子1之前的啟動(dòng)子”(McElroy D等，1991)克隆入pMRT1191中產(chǎn)生。質(zhì)粒pMRT1191(4805bp)衍生自pMRT1119。10.1.1.獲得pMRT1191質(zhì)粒pMRT1191(4805bp)與pMRT1119的不同之處在于其缺失nos啟動(dòng)子和突變nptII序列。
通過用Bsp120I消化10μgpMRT1119，然后利用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化，以及在50μ1水中回收，獲得所述質(zhì)粒pMRT1191。此后，用KpnI水解消化的pMRT1119和[sic]，利用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化，在50μl水中回收，并在120μl反應(yīng)介質(zhì)中，在12μlT4DNA聚合酶×10緩沖液、4μl10mMdNTP和6μl1mg/mlBSA存在下，接受6單位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用。所述反應(yīng)于37℃進(jìn)行30分鐘。然后通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離所述載體片段，利用“QIAquick凝膠提取”試劑盒純化，并回收在50μl水中。
通過PCR反應(yīng)(方法描述于7)連接，對(duì)30ng如此處理的所述質(zhì)粒進(jìn)行再連接。
產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1191。該質(zhì)粒示于
圖10，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID10。10.1.2.獲得pMRT1201質(zhì)粒pMRT1201(7943bp)與pMRT1191的不同之處在于其插入了分離自質(zhì)粒pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos的uidA基因表達(dá)盒，所述質(zhì)粒pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos包含插入到pUC19(購自New EnglandBiolabs)的EcoRI和HindIII位點(diǎn)中的uidA基因表達(dá)盒。通過連續(xù)克隆獲得該質(zhì)粒。通過連續(xù)用《EcoRI繼之以Klenow片段的作用》和pBI221ΔSacI(＝通過SacI消化繼之以T4DNA聚合酶作用接著連接消除了其ScaI位點(diǎn)的pBI221(Clontech))的SmaI消化，分離對(duì)應(yīng)于序列《uidA基因-nos終止子》的片段。將分離純化的片段插入pUC19(Clontech)的《SmaI-[SphI＋T4DNA聚合酶]》位點(diǎn)，以便獲得質(zhì)粒pUC19-uidA-Tnos。此后，利用兩個(gè)寡脫氧核苷酸含BstBI位點(diǎn)的5′AGGCATTGGTTTCGAAGCG3′(SEQ.ID46)和5′TACGCCAAGCTTGGCAATTCC 3′(SEQ.ID47)，通過PCR由pUC19-uidA-Tnos基質(zhì)擴(kuò)增片段(1054bp)，通過用消化該片段獲得的BstBI-HindIII片段替換pUC19-uida-Tnos的BstBI-HindIII片段，消除在Tnos的3′側(cè)重新產(chǎn)生的EcoRI位點(diǎn)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pUC19-uidA-TnosΔEcoRI。然后，為了在uidA基因的起始密碼子水平上引入NcoI位點(diǎn)，用兩個(gè)寡脫氧核苷酸含NcoI和SmaI位點(diǎn)的5′AATACCCGGGACCATGGTCCGTCCTGTAG3′(SEQ.ID48)和位于SnabI下游的5′ATAGTCTGCCAGTTCAGTTCGTTG 3′(SEQ.ID49)，通過PCR由pUC19-uidA-TnosΔEcoRI基質(zhì)擴(kuò)增440bp的片段。然后將用SmaI和SnaBI消化的PCR片段插入pUC19-uidA-TnosΔEcoRI中，以便替換原有的SmaI-SnaBI片段。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pUC19-NcoI-uidA-Tnos。此后，將EcoRI-SmaI片段具有的Phmwg啟動(dòng)子[高分子量麥谷蛋白，Anderson等，(1989)]引入pUC19-NcoI-uidA-Tnos的EcoRI和SmaI位點(diǎn)中，以便產(chǎn)生質(zhì)粒pUC19-Phmwg-uidA-Tnos。最后，水稻肌動(dòng)蛋白基因的內(nèi)含子1(IA，EcoRV-SmaI片段)來自質(zhì)粒pActl-F6(McElroy D等，1991)，該質(zhì)粒特別通過在含IA的EcoRV-SmaI片段兩側(cè)加入限制位點(diǎn)而自身修飾。由修飾的pActl-F6分離具有IA的SmaI-NcoI片段，將其插入pUC19-Phmwg-uidA-Tnos的SmaI和NcoI位點(diǎn)中，以便產(chǎn)生質(zhì)粒pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos。所用的技術(shù)是已經(jīng)在本專利中描述的技術(shù)。
通過用EcoRI消化2μg的pMRT1191，利用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，接著在120μl反應(yīng)體積中，在12μl 500mMTris-HCl，pH7.5、500mM MgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃經(jīng)受20單位的Klenow片段(NewEngland Biolabs)作用30分鐘，利用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，以及在50μl水中回收，獲得pMRT1191載體片段。此后，在120μl終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl3×10緩沖液(New England Biolabs)存在下用50單位牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃對(duì)消化和處理的pMRT1191去磷酸化1小時(shí)，用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，并在50μl水中回收。
通過用ScaI(pUC19中存在的位點(diǎn))消化pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos，用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化，在50μl水中回收，用HindIII消化，用“QIAquickPCR純化”試劑盒純化，在50μl水中回收，在120μl反應(yīng)體積中，在12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5、500mMMgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃用20單位的Klenow片段(New England Biolabs)處理30分鐘，用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化，在50μl水中回收，以及用EcoRI消化，獲得對(duì)應(yīng)于uidA基因表達(dá)盒(3kbp)的插入DNA片段(2μg)，即處于水稻肌動(dòng)蛋白基因內(nèi)含子1之前的小麥“高分子量麥谷蛋白”啟動(dòng)子和根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合酶終止子控制下的uidA基因。此后，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離所述插入的DNA片段，用“QIAquick凝膠提取”試劑盒純化，如上所述經(jīng)受Klenow片段的作用，并在50μl水中回收。
如先前在7中所述，通過PCR反應(yīng)對(duì)10ng去磷酸化的消化的pMRT1191質(zhì)粒和100ng消化和處理的插入DNA片段進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，并通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1201(7943bp)。該質(zhì)粒示于
圖15，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID15。10.1.3.獲得pMRT1210質(zhì)粒pMRT1210(10003bp)與pMRT1201的不同之處在于其插入了分離自pSB12-Pact-IA-bar-Tnos的序列“水稻肌動(dòng)蛋白基因內(nèi)含子1之前的啟動(dòng)子-bar基因”(Pact-IA-bar)，所述pSB12-Pact-IA-bar-Tnos衍生自Komari等(1996)所述的pSB12。通過將分離自pDM302的表達(dá)盒《Pact-IA-bar-Tnos》(BspDI-《XhoI＋Klenow》片段)克隆到其LB側(cè)的XhoI位點(diǎn)缺失的pSB12的SmaI和BspDI位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pSB12-Pact-IA-bar-Tnos。在Wu R.的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的質(zhì)粒pDM302包含購自Promega的質(zhì)粒pSP72中的表達(dá)盒《Pact-IA-bar-Tnos》。
通過用HpaI消化2μg的pMRT1201，利用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，以及在98μl水中回收，獲得pMRT1201載體片段。此后，在120μl的終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl3×10緩沖液(New EnglandBiolabs)存在下用50單位的牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃對(duì)消化的pMRT1201去磷酸化1小時(shí)，用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，并在50μl水中回收。
通過用XbaI消化pBIOS273，用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化，在50μl水中回收，在120μl反應(yīng)體積中，在12μl500mMTris-HCl，pH7.5-500mM MgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇和各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃用20單位的Klenow片段(New EnglandBiolabs)處理30分鐘，獲得對(duì)應(yīng)于“Pact-IA-bar”(2.1kbp)的插入DNA片段(2μg)。然后通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離如此處理的所述插入DNA片段，用“QIAquickPCR純化”試劑盒純化并在50μl水中回收。
如先前在7中所述，通過PCR反應(yīng)對(duì)60ng去磷酸化的消化的pMRT1201質(zhì)粒和100ng消化和處理的插入DNA片段進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，并通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1210。該質(zhì)粒示于圖21，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID21。
然后按照Holsters等(1978)的方法，通過直接轉(zhuǎn)化將該質(zhì)粒pMRT1210引入到根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404(pSBl)[KomariT等，1996]和菌株LBA4404中。10.1.4.獲得pMRT1193通過將具有分離自10.1.2.所述的pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos的序列《Phmwg-IA-uidA-Tnos》的《EcoRI-[HindIII＋Klenow片段作用]》片段克隆入pMRT1119的EcoRI和[XhoI＋Klenow片段作用]位點(diǎn)，獲得雙元質(zhì)粒pMRT1193。
為此，通過用XhoI消化10μg的pMRT1119，利用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化，在50μl水中回收，在120μl反應(yīng)體積中，在12μl500mM Tris-HCI，pH7.5-500mM MgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇和各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃用20單位的Klenow片段(NewEngland Biolabs)處理30分鐘，獲得pMRT1119載體片段。然后用“QIAquickPCR純化”試劑盒純化并用EcoRI消化。通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離處理的載體片段，用“QIAquickPCR純化”試劑盒純化并在50μl水中回收。此后，在120μl終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl3×10緩沖液(New England Biolabs)存在下用50單位的牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃對(duì)消化的pMRT1119去磷酸化1小時(shí)，用“QIAquickPCR純化”試劑盒純化，并在50μl水中回收。
通過用ScaI(pUC19中存在的位點(diǎn))消化pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos，用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化，在50μl水中回收，用HindIII消化，用“QIAquickPCR純化”試劑盒純化，在50μl水中回收，在120μl反應(yīng)體積中，在12μl500mM Tris-HCl，pH7.5，500mMMgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃用20單位的Klenow片段(New England Biolabs)處理30分鐘，用“QIAquick PCR純化”試劑盒純化，在50μl水中回收，以及用EeoRI消化，獲得對(duì)應(yīng)于uidA基因表達(dá)盒(3kbp)的插入DNA片段(2μg)，即處于水稻肌動(dòng)蛋白基因內(nèi)含子1之前的小麥“高分子量麥谷蛋白”啟動(dòng)子和根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合酶終止子控制下的uidA基因。然后，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離所述插入的DNA片段，用“QIAquick凝膠提取”試劑盒純化，并在50μl水中回收。
如先前在7中所述，通過PCR反應(yīng)對(duì)20ng去磷酸化的消化的pMRT1119質(zhì)粒和100ng消化和處理的插入DNA片段進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，并通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1193(9143bp)。該質(zhì)粒示于
圖12，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID12。10.2.獲得pMRT1195質(zhì)粒pMRT1195(6857bp)與pMRT1191的不同之處在于其插入了序列“水稻肌動(dòng)蛋白基因內(nèi)含子1之前的啟動(dòng)子-bar基因”(Pact-IA-bar)。如10.1.1所述，通過用Bsp120I和KpnI消化載體pMRT1191，接著用酶T4DNA聚合酶作用并去磷酸化，但不重新連接，獲得所述質(zhì)粒pMRT1195。
如10.1.3.所述，獲得對(duì)應(yīng)于“Pact-IA-bar”(2.1kbp)的插入DNA片段。
如先前在7中所述，通過PCR反應(yīng)對(duì)20ng去磷酸化的消化的pMRT1191質(zhì)粒和100ng消化和處理的插入DNA片段進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，并通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1195。該質(zhì)粒示于
圖13，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID13。10.3.獲得pMRT1202質(zhì)粒pMRT1202(5614bp)與pMRT1195的不同之處在于其用分離自大腸桿菌菌株SCS110產(chǎn)生的pMRT1121的根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合酶(Pnos)啟動(dòng)子替換序列“Pact-IA”。
用PstI消化2μg的pMRT1195載體片段，利用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，在98μl水中回收，在120μl反應(yīng)介質(zhì)中，在12μlT4DNA聚合酶×10緩沖液、4μl10mMdNTP和6μlBSA1mg/ml存在下，通過6單位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用進(jìn)行處理。所述反應(yīng)于37℃進(jìn)行30分鐘。然后利用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化所述載體片段，在50μl水中回收，用HindIII消化，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，利用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，并在98μl水中回收。此后，在120μl終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl3×10緩沖液(New England Biolabs)存在下，用50單位的牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃對(duì)消化和處理的pMRT1195去磷酸化1小時(shí)，用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，并在50μl水中回收。
通過用BspEI消化pMRT1121，利用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，在98μl水中回收，在120μl反應(yīng)體積中，在12μl500mMTris-HCl，pH7.5-500mMMgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇和各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃用20單位的klenow片段(New EnglandBiolabs)處理30分鐘，利用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，在50μl水中回收，并用HindIII消化，獲得對(duì)應(yīng)于“Pnos”的插入DNA片段。然后通過2％瓊脂糖凝膠電泳分離具有Pnos(209 bp)的插入DNA片段(219bp)，用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，并在50μl水中回收。
如先前在7中所述，通過PCR反應(yīng)對(duì)48ng去磷酸化的消化的pMRT1195質(zhì)粒和56ng消化和處理的插入DNA片段進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，并通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1202。該質(zhì)粒示于
圖16，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID16。10.4.獲得pMRT1212質(zhì)粒pMRT1212(8987bp)與pMRT1206的不同之處在于其用bar基因替換了nptII基因。
為此，通過用Bsu36I消化2μg的pMRT1206，利用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，在50μl水中回收并用AatII消化，獲得pMRT1206載體片段。通過用Bsu36I和AatII消化使得所述載體缺失對(duì)應(yīng)于《部分Pnos nptII Tnos LB》的片段。然后對(duì)所述消化的載體片段進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳分離，利用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，并在98μl水中回收。然后在120μl終反應(yīng)介質(zhì)中，在12μl3×10緩沖液(New England Biolabs)存在下，用50單位的牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃對(duì)此消化和處理的載體片段去磷酸化1小時(shí)，用《協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，并在50μl水中回收。
通過用Bsu36I消化2μg的pMRT1202，利用協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)試劑盒純化，在40μl水中回收，用AatII消化，通過1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，利用協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)試劑盒純化，并在50μl水中回收，獲得對(duì)應(yīng)于《部分Pnos npuI Tnos LB》(1.2kbp)的插入DNA片段。
如先前在7中所述，通過PCR反應(yīng)對(duì)100ng去磷酸化的消化的pMRT1206質(zhì)粒和50ng消化的插入DNA片段進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，通過堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，并通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1212。該質(zhì)粒示于圖22，在序列表中給出了其全序列SEQ.ID22.11.評(píng)價(jià)在細(xì)菌中產(chǎn)生的合成載體測定得自細(xì)菌大腸桿菌菌株DH5α的質(zhì)粒的產(chǎn)量。I.非雙元合成質(zhì)粒在10ml補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃由各500ml的質(zhì)粒pMRT1105、pMRT1106或pMRT1105-ori ColE1的“甘油原液”連續(xù)16小時(shí)制備具有所述各個(gè)質(zhì)粒的重組細(xì)菌的原始培養(yǎng)物。此后，在100ml補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB中，于37℃培養(yǎng)各500ml的所述原始培養(yǎng)物23小時(shí)。對(duì)于pMRT1106，制備兩種培養(yǎng)物，一種沒有加入氯霉素，而另一種在培養(yǎng)7小時(shí)后加入了40mg/l的氯霉素。然后以5000g離心所述培養(yǎng)物10分鐘。采用“QIAFilter質(zhì)粒Midi試劑盒”(QIAGEN)，按照生產(chǎn)商的建議提取所述質(zhì)粒DNA，并用分光光度計(jì)定量測定。測定所獲得的質(zhì)粒的量，pMRT1105、pMRT1106、用氯霉素處理的pMRT1106和pMRT1105-ori ColE1(其中在pMRT1106的反方向插入ori ColE1的質(zhì)粒pMRT1105)分別為10mg、50.6mg、86.2mg和9.8mg。這些結(jié)果表明，所述合成質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，在右方存在的復(fù)制起點(diǎn)“ori ColE1”(“ori RK2”附近的“ori ColE1”的NdeI位點(diǎn))使得產(chǎn)量增加5倍，而反向的“ori ColE1”顯示沒有影響，用氯霉素處理額外增加了1.6倍。11.2.合成雙元質(zhì)粒相對(duì)于對(duì)照pBin19和pBIOC4，評(píng)價(jià)合成雙元質(zhì)粒pMRT1118和pMRT1119。質(zhì)粒pBIOC4與pGA492(An，1986)的不同之處在于其實(shí)際上缺失了所有的pGA492 cat基因編碼序列，以及其HindIII位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)镋coRI位點(diǎn)。通過用SacI和ScaI雙重消化pGA492，接著經(jīng)受酶T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用，并在10μl反應(yīng)介質(zhì)中，在1μlT4 DNA連接酶×10緩沖液(Amersham)和2.5單位的T4DNA連接酶(Amersham)存在下，于14℃連接修飾的質(zhì)粒(20ng)16小時(shí)，獲得所述質(zhì)粒pBIOC4。轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的細(xì)菌—大腸桿菌DH5α(Hanahan，1983)。通過在四環(huán)素(12mg/l)上選擇獲得克隆，通過堿裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，并通過酶促消化分析。然后用磷酸化的HindIII-EcoRI連接物(Stratagene)，將所選擇的克隆的質(zhì)粒DNA的HindIII位點(diǎn)修飾為EcoRI位點(diǎn)。為此，用HindIII消化500ng的所選擇克隆的質(zhì)粒DNA，用酶牛小腸堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim)按照生產(chǎn)商的建議去磷酸化，并在1500ng的HindIII-EcoRI連接DNA、0.1體積的3M乙酸鈉，pH4.8和2.5體積的無水乙醇存在下，于-80℃共沉淀30分鐘。以12000g離心30分鐘后，用70％乙醇洗滌沉淀的DNA，干燥、在8μl水中回收、于65℃保持10分鐘，然后如前所述連接。在T4 DNA連接酶于65℃失活10分鐘后，用EcoRI消化連接反應(yīng)混合物、通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化、電洗脫、用無水乙醇沉淀、以12000g離心30分鐘、用70％乙醇洗滌、干燥，然后連接并引入到大腸桿菌菌株DH5α中，并如前所述處理。
在10ml補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃由各500ml的上述各個(gè)質(zhì)粒的“甘油原液”連續(xù)16小時(shí)制備具有所述各個(gè)質(zhì)粒的重組細(xì)菌的原始培養(yǎng)物，pBIOC4除外，它在12mg/l的四環(huán)素上選擇。此后，在100ml補(bǔ)加相應(yīng)抗生素的LB中，于37℃培養(yǎng)各250ml的所述原始培養(yǎng)物23小時(shí)。然后以5000g離心所述培養(yǎng)物10分鐘。采用“QIAFilter質(zhì)粒Midi試劑盒”(QIAGEN)，按照生產(chǎn)商的建議提取所述質(zhì)粒DNA，并用分光光度計(jì)定量測定。測定所獲得的質(zhì)粒的量，pMRT1118、pMRT1119、pBin19和pBIOC4分別為94.2mg、113mg、37.2mg和45.6mg。
這些結(jié)果表明，所述合成雙元質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，pMRT1119的產(chǎn)量相對(duì)于pBinl9和pBIOC4對(duì)照，分別增加3倍和2.5倍。
而且，這些合成質(zhì)粒在根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中復(fù)制。12.通過轉(zhuǎn)基因生成評(píng)價(jià)所述合成質(zhì)粒12.1.轉(zhuǎn)化煙草12.1.1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)化煙草按照Horsch等(1985)所述的方法，通過用重組農(nóng)桿菌體外感染分離自6周齡的煙草幼苗的葉盤，對(duì)煙草(煙草屬PBD6變種(NicotianatabacumL.var.PBD6))進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
在控制的環(huán)境艙中制備所有的體外培養(yǎng)物，在所述環(huán)境艙中，光強(qiáng)度為200μE.m-2.s-1，光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，溫度為25℃。
除了開始的共培養(yǎng)階段，再生期、發(fā)育期和生根期在補(bǔ)加抑菌劑(即400mg/l的復(fù)方羥氨芐青霉素)和選擇劑(即200或100mg/l的卡那霉素)的不同選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行。
不同的階段和使用的培養(yǎng)基如下在補(bǔ)加終濃度為6mM的CaCl2和合適抗生素的5ml2YT培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl5g/l，pH7.2)中，于28℃原代培養(yǎng)農(nóng)桿菌48小時(shí)后，在補(bǔ)加CaCl2和抗生素的10ml 2YT培養(yǎng)基中于28℃進(jìn)行一夜的培養(yǎng)。然后以3000g離心所述培養(yǎng)物10分鐘，并在10ml液體MS30(4.4g/l的M0404，購自SIGMA，補(bǔ)加30g/l的蔗糖，pH5.7)中重懸浮所述細(xì)菌。
通過使約1cm2的切自所述幼苗葉片的葉外植體體外接觸在液體MS30中稀釋10倍的農(nóng)桿菌懸浮液20分鐘，進(jìn)行共培養(yǎng)。然后將如此處理的所述外植體在濾紙上快速干燥，并在控制的環(huán)境艙中置于固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基(CM)(MS30、芐氨基嘌呤(BAP)1mg/l、0.1mg/l的吲哚-3乙酸(ANA)、8g/l的瓊脂)上培養(yǎng)48小時(shí)。
然后將所述處理的外植體置于固體再生培養(yǎng)基上(固體CM、復(fù)方氨芐青霉素400mg/l、卡那霉素200mg/l)。兩周后將所述外植體移植到相同培養(yǎng)基上。
兩周后將苗條移植到固體發(fā)育培養(yǎng)基上(M04044.4g/l，購自SIGMA，補(bǔ)加蔗糖20g/l，pH5.7(液體MS20)、復(fù)方氨芐青霉素400mg/l、卡那霉素100mg/l、瓊脂8g/l)。
兩周后，將轉(zhuǎn)化的幼苗移植到與所述發(fā)育培養(yǎng)基相同的固體生根培養(yǎng)基上。需要2-3周生根，此后將幼苗移至Giffy箱(pot)的生長室中達(dá)10天(光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，23℃，70％相對(duì)濕度)，然后置于溫室中。12.1.2.評(píng)價(jià)用于轉(zhuǎn)化煙草的合成質(zhì)粒使用含所述合成雙元質(zhì)粒pMRT1118或?qū)φ针p元質(zhì)粒pBin19的重組農(nóng)桿菌(根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404)轉(zhuǎn)化煙草(煙草屬PBD6變種)。
結(jié)果顯示，兩種受試雙元質(zhì)粒在選擇劑(卡那霉素)存在下發(fā)育的幼苗的數(shù)目和生長情況相似。這些觀察結(jié)果表明，所述合成雙元質(zhì)粒對(duì)于轉(zhuǎn)化煙草完全有效。12.2.轉(zhuǎn)化玉米12.2.1.遺傳轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織無論使用何種方法(電穿孔、農(nóng)桿菌、微絲(microfibres)、基因槍)，遺傳轉(zhuǎn)化玉米通常都需要使用快速分裂的未分化細(xì)胞，所述細(xì)胞保有再生為全株的能力。這種類型的細(xì)胞組成了玉米的松散胚發(fā)生愈傷組織(稱為II型)。
這些愈傷組織按照Armstrong(Maize handbook，1994，F(xiàn)reeling M和Walbot V(編輯)，665-671頁)描述的方法，并在Armstrong所述的培養(yǎng)基上，由基因型HI、II或(A188×B73)的未成熟胚獲得。繁殖如此獲得的愈傷組織，并通過每2周1次的在起始培養(yǎng)基(starting medium)上的連續(xù)傳代培養(yǎng)來保持。
按照Vain等(1989)描述的方法，通過改變所述細(xì)胞的激素平衡和滲透平衡，由這些愈傷組織再生幼苗。然后在溫室中使這些植株茁壯，在所述溫室中所述植株可以雜交或自交。12.2.2.用基因槍遺傳轉(zhuǎn)化玉米在12.2.1.中描述了需要轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系的產(chǎn)生和再生。
Finer等(1992)描述了使用基因槍進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的方法。靶細(xì)胞為表面積10-20mm2的愈傷組織碎片。將這些碎片置于補(bǔ)加0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的起始培養(yǎng)基上4小時(shí)，然后轟擊。
按照Klein(1987)所述的方法，共沉淀鎢粒(M10)和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。按照Finer等(1992)的方法，利用基因槍讓如此包被的顆粒射向所述靶細(xì)胞。
將受轟擊的愈傷組織于27℃置于黑暗中。24小時(shí)后，第一次傳代培養(yǎng)，接著在3個(gè)月內(nèi)在起始培養(yǎng)基上每2周傳代培養(yǎng)1次，所述起始培養(yǎng)基已經(jīng)加入了僅選擇所述轉(zhuǎn)化的愈傷組織的合適的選擇劑。然后如12.2.1.所述在所述選擇劑存在下培養(yǎng)這些愈傷組織，以便再生為轉(zhuǎn)化幼苗。使獲得的幼苗茁壯，并轉(zhuǎn)移到它們可以雜交或自交的溫室中。12.2.3.用根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化玉米所使用的技術(shù)描述于Ishida等(1996)。在LS-inf培養(yǎng)基中洗滌長度為1.0-1.2mm(授粉后9-14天)的未成熟胚，然后在農(nóng)桿菌懸浮液中浸漬，如Ishida等(1996)所述制備，渦旋30秒，并于室溫下溫育5分鐘。在黑暗中于25℃將如此處理的所述未成熟胚在LS-AS培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)移至補(bǔ)加5mg/l膦絲菌素和250mg/l頭孢噻肟的LSD1.5培養(yǎng)基，在黑暗中于25℃兩周，最后置于補(bǔ)加10mg/l膦絲菌素和250mg/l頭孢噻肟的LSD1.5培養(yǎng)基上，在黑暗中于25℃三周。分離由此再生的I型愈傷組織，粉碎并轉(zhuǎn)移至補(bǔ)加10mg/l膦絲菌素和250mg/l頭孢噻肟的LSD1.5培養(yǎng)基上，在黑暗中于25℃三周。然后分離增殖的所述I型愈傷組織，并將其置于補(bǔ)加5mg/l膦絲菌素和250mg/l頭孢噻肟的LSZ培養(yǎng)基上，于25℃經(jīng)受16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期2-3周。然后將再生的幼苗轉(zhuǎn)移至1/2LSF培養(yǎng)基，于25℃經(jīng)受16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期1-2周，然后轉(zhuǎn)移至生長室和溫室。13.載體主鏈對(duì)基因表達(dá)的影響獲得用具有野生型nptII基因的合成雙元質(zhì)粒pMRT1204(16株植株)和具有突變nptII基因的pMRT1206(12株植株)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草植株，還獲得用對(duì)照載體pBI21(Clontech銷售，對(duì)應(yīng)于具有野生型nptII基因并含有表達(dá)盒“P35S-A-polyAnos”的質(zhì)粒pBIN19)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草植株(11株植株)。
使用5Prime→3Prime出售的NPTII ELISA試劑盒，通過對(duì)蛋白提取物進(jìn)行ELISA分析，評(píng)價(jià)所述合成載體主鏈和所述對(duì)照的影響。所述分析能夠定量所產(chǎn)生的相對(duì)于可溶性提取蛋白量(ng)的NPTII蛋白量(μg)。
在“Tris-HCl 25mM pH7.8；苯基甲磺酰氟1mM”緩沖液中，由液氮中磨碎的煙草葉片中提取所述蛋白。以10000g和4℃離心10分鐘后，按照Bradford法(利用蛋白-染料結(jié)合原理快速且敏感地檢測微克量蛋白的方法，Anal.Biochem.(1976)72，248-254)檢測包含在上清液中的提取出的可溶性蛋白。
用于ELISA定量的抗體為特異性識(shí)別包被的NPTII蛋白的兔多克隆抗體和用于檢測NPTII蛋白的生物素?；目?NPTII抗體。
分析結(jié)果示于圖23，它表明·對(duì)于野生型nptII基因盒和不同的質(zhì)粒主鏈，用所述合成雙元質(zhì)粒pMRT1204獲得的NPTII量比用最初的pBIN19雙元質(zhì)粒獲得的NPTII量高6.7倍，這證實(shí)了所述合成載體的功效。
·對(duì)于具有不同nptII基因(即野生型nptII基因和突變nptII基因)的相同質(zhì)粒主鏈，即合成雙元質(zhì)粒pMRT1204和pMRT1206，所述野生型基因獲得的NPTII量與突變nptII基因獲得的NPTII量相差1.2倍。14.合成pMRT1334通過用pBIN19的nptII表達(dá)盒替換pMRT1206的nptII表達(dá)盒，獲得質(zhì)粒pMRT1334(9688bp)。
通過用KpnI消化10μg的pMRT1206，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，并在50μl水中回收，獲得衍生自pMRT1206的載體片段。然后在120μl反應(yīng)混合物中，在12μlT410×DNA聚合酶緩沖液、4μl10 mMdNTP和6μl1mg/mlBSA存在下，使消化的pMRT1206經(jīng)受6單位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用。所述反應(yīng)于37℃進(jìn)行30分鐘。利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”純化消化并如此處理的pMRT1206載體，在50μl水中回收，然后用AflII消化。通過在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離衍生自pMRT1206的載體片段，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，并在50μl水中回收。
通過用DraI和AflII消化9μgp BIN19質(zhì)粒，獲得對(duì)應(yīng)于nptII表達(dá)盒的DNA插入片段DraI-AflII(1.5kbp)。然后，使所述片段在TEB緩沖液中的1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”純化，并在50μl水中回收。
在20μl反應(yīng)混合物中，在2μlT410×DNA連接酶緩沖液(Epicentre Technologies)、2μl2.5mM ATP和4單位T4 DNA連接酶(Epicentre Technologies)存在下，使用100ng衍生自pMRT1206的質(zhì)粒片段和100ng所述DNA插入片段DraI-AflII進(jìn)行PCR連接反應(yīng)。所述反應(yīng)在“GeneAmp PCR System 9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行180個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)步驟，第一個(gè)步驟為10℃30秒，第二個(gè)步驟為30℃30秒。
轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細(xì)菌(Hanahan，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，按照堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1334(圖24)。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID50。15.合成pMRT1335質(zhì)粒pMRT1335(15208bp)是對(duì)照載體，通過將分離自pMRT1206的表達(dá)盒“ep35S-gus(uidA)-polyA35S”插入到pBIN19中產(chǎn)生。
用EcoRI消化13μg的pBIN19質(zhì)粒，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”純化，并在50μl水中回收。然后在120μl反應(yīng)體積中，在12μl500mM pH7.5 Tris-HCl500mMMgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，使先前消化的pBIN19于37℃經(jīng)受20單位的-enow片段(New England Biolabs)作用60分鐘。利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”純化消化的pBIN19載體，在50μl水中回收，然后用KpnI消化。通過在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離如此產(chǎn)生的所述載體片段，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”純化，并在50μl水中回收。
通過用XhoI消化10μg的質(zhì)粒pMRT1206，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”純化，并在50μl水中回收，接著在120μl反應(yīng)體積中，在12μl500mM pH7.5 Tris-HCl500mM MgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃經(jīng)受20單位的Klenow片段(NewEngland Biolabs)作用60分鐘，然后利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”純化，在50μl水中回收，最后用KpnI消化，獲得對(duì)應(yīng)于“ep35S-gus(uidA)-polyA35S”(3.5kbp)表達(dá)盒的DNA插入片段。通過在TEB緩沖液中的1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離如此產(chǎn)生的所述DNA插入片段，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”純化，并在50μl水中回收。
在20μl反應(yīng)體積中，在2μlT410×DNA連接酶緩沖液(EpicentreTechnologies)、2μl2.5mM ATP和4單位T4 DNA連接酶(EpicentreTechnologies)存在下，使用100ng處理的pBIN19和100gn先前制備的DNA插入片段進(jìn)行PCR連接反應(yīng)。所述反應(yīng)在“GeneAmp PCRSystem 9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行180個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)步驟，第一個(gè)步驟為10℃30秒，第二個(gè)步驟為30℃30秒。
轉(zhuǎn)化先前已被制成感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細(xì)菌(Hanahan，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，按照堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1335(圖25)。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID51。16.合成pMRT1336通過將分離自質(zhì)粒pMRT1322的啟動(dòng)子MPr1165(610bp)插入到pMRT1196中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRT1336(9285bp)，所述質(zhì)粒pMRT1322描述于PCT專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/IB00/00370，該專利申請(qǐng)通過引用其相關(guān)部分結(jié)合到本說明書中。
用KpnI消化10μg的pMRT1196質(zhì)粒，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”純化，在50μl水中回收，并用HpaI再消化。使如此處理的載體片段在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”純化，然后在50μl水中回收。
用KpnI消化10μgpMRT1322質(zhì)粒，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”純化，在50μl水中回收，然后用HpaI再消化，獲得具有所述啟動(dòng)子MPr1165(0.5kbp)的DNA插入片段。使如此產(chǎn)生的所述DNA插入片段在TEB緩沖液中的1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”純化，并在50μl水中回收。
在20μl反應(yīng)體積中，在2μ1 T410×DNA連接酶緩沖液(EicentreTechnologies)、2μl2.5mM ATP和4單位T4 DNA連接酶(EpicentreTechnologies)存在下，使用100ng載體片段和100ng具有如上所述制備的啟動(dòng)子MPr1165的DNA插入片段進(jìn)行PCR連接反應(yīng)。所述反應(yīng)在“GeneAmp PCRSystem 9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行180個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)步驟，第一個(gè)步驟為10℃30秒，第二個(gè)步驟為30℃30秒。
轉(zhuǎn)化先前制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)菌(Hanahan，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，按照堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1336(圖26)。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID52。
通過將啟動(dòng)子MPrn165插入pMRT1176中，獲得質(zhì)粒pMRT1322。用XbaI和EcoRI消化10μg的pMRT1176質(zhì)粒，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，在50μl水中回收，在120μl終反應(yīng)體積中，在12μl3×10緩沖液(New England Biolabs)存在下，利用50單位牛小腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化1小時(shí)，并利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，然后在50μl水中回收。使用各20pmol的兩個(gè)寡脫氧核苷酸具有位點(diǎn)XbaI的5′AGCTCTAGAGCTGCCTGCAGCACTAGTATCC 3′(SEQ.ID53)和具有位點(diǎn)EcoRI的5′CGGAATTCGGCCTCTAGGTTGTTGTGTTG 3′(SEQ.ID54)，利用酶高保真性鉑Taq聚合酶(GIBCO BRL Life Technologies)并按照供應(yīng)商的說明書，通過PCR擴(kuò)增由10ngpMRT1240基質(zhì)DNA獲得對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子MPr1165的DNA插入片段。在“GeneAmp PCR系統(tǒng)9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在于94℃變性2分鐘后，對(duì)所述DNA進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)包括94℃45秒的變性步驟、55℃45秒的雜交期和68℃45秒的伸長期。在最后一個(gè)循環(huán)所述伸長于68℃持續(xù)3分鐘。通過在TEB緩沖液中的1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離所獲得的PCR產(chǎn)物，并利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，然后在50μl水中回收。然后用XbaI和EcoRI消化所述PCR產(chǎn)物，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，并在50μl水中回收。使用80ng pMRT1176載體片段和具有所述MPr1165啟動(dòng)子的110ng DNA插入片段如先前所述進(jìn)行PCR連接反應(yīng)。轉(zhuǎn)化先前制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)菌(Hanahan，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，按照堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pMRT1322。
通過將DNA片段插入質(zhì)粒pMRT1234中，按照供應(yīng)商對(duì)HindIII位點(diǎn)和BamHI的說明用Klenow片段(New England Biolabs)處理，獲得質(zhì)粒pMRT1240。通過用PstI和BamHI雙重消化質(zhì)粒pMRT1165，接著按照供應(yīng)商的說明書，經(jīng)受T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用，獲得為L5啟動(dòng)子片段的DNA插入片段，所述質(zhì)粒pMRT1165描述于PCT專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/IB00/00370，該專利申請(qǐng)通過引用其相關(guān)部分結(jié)合到本說明書中。
通過在pMRT1175的EcoRI位點(diǎn)插入對(duì)應(yīng)于編碼人乳鐵蛋白的cDNA的DNA插入片段EcoRI，獲得質(zhì)粒pMRT1234，所述DNA插入片段EcoRI分離自如先前公開的專利申請(qǐng)WO98/50543所述的質(zhì)粒pHMWG-IA-PSSp-Lf。17.合成pMRT1337將分離自pBINm-gfp5-ER的gfp基因插入到pMRT1205中，獲得質(zhì)粒pMRT1337(8289bp)，該質(zhì)粒描述于Haseloff J和Siemering KR.1998，“綠色熒光蛋白在植物中的應(yīng)用”，載于Green fluorescent proteinStrategies，applications and protocols(Chalfie M和Kain S編輯，Wiley，191-220頁)。
用EcoRI消化10μg的質(zhì)粒pMRT1205，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，在50μl水中回收，在120μl反應(yīng)體積中，在12μl 500mM pH7.5Tris-HCl 500mM MgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃經(jīng)受20單位的Klenow片段(NewEngland Biolabs)作用60分鐘，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，在50μl水中回收，然后用BamHI消化。使如此處理的載體片段在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，并在50μl水中回收。
用SacI消化10μg的質(zhì)粒pBINm-gfp5-ER，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，在50μl水中回收，并在120μl反應(yīng)體積中，在12μlT4 10×DNA聚合酶緩沖液、4μl10mM dNTP和6μl1mg/mlBSA存在下，經(jīng)受6單位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用，獲得具有g(shù)fp基因的DNA插入片段(0.7kbp)。所述反應(yīng)于37℃進(jìn)行30分鐘。然后利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化如此處理的質(zhì)粒pBINm-gfp5-ER，在50μl水中回收并用BamHI消化。使如此產(chǎn)生的DNA插入片段在TEB緩沖液中的1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，并在50μl水中回收。
在20μl反應(yīng)體積中，在2μlT410×DNA連接酶緩沖液(EpicentreTechnologies)、2μl2.5mM ATP和4單位T4DNA連接酶(EpicentreTechnologies)存在下，使用100ng的pMRT1205載體片段和100ng以上制備的具有g(shù)fp基因的DNA插入片段進(jìn)行PCR連接反應(yīng)。所述反應(yīng)在“GeneAmp PCR System 9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行180個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)步驟，第一個(gè)步驟為10℃30秒，第二個(gè)步驟為30℃30秒。
轉(zhuǎn)化先前制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)菌(Hanahan，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，按照堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1337(圖27)。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID55。18.合成pMRT1341用分離自pMRT1337的表達(dá)盒“ep35S-gfp-poIyA35S”替換pMRT1335的“ep35S-gus-polyA35S”表達(dá)盒，獲得質(zhì)粒pMRT1341(14108bp)。
用AgeI和KpnI消化10μg的質(zhì)粒pMRT1335。通過在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離如此消化的載體片段，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，然后在50μl水中回收。
用XhoI消化10μg的質(zhì)粒pMRT1337，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)》試劑盒純化，在50μl水中回收，在120μl反應(yīng)體積中，在12μl500mM pH7.5 Tris-HCl500mM MgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃經(jīng)受20單位的Klenow片段(NewEngand Biolabs)作用30分鐘，然后利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，在50μl水中回收，最后用KprI消化，獲得對(duì)應(yīng)于表達(dá)盒“ep35S-gfp-polyA35S”的DNA插入片段(2.4kbp)。通過在TEB緩沖液中的0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離如此制備的DNA插入片段，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，在50μl水中回收，用AgeI消化，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，并在50μl水中再回收。
在20μl反應(yīng)體積中，在2μlT410×DNA連接酶緩沖液(EpicentreTechnologies)、2μl2.5mM ATP和4單位T4DNA連接酶(EpicentreTechnologies)存在下，使用100ng的衍生自pMRT1335的載體片段和100ng如上產(chǎn)生的DNA插入片段進(jìn)行PCR連接反應(yīng)。所述反應(yīng)在“GeneAmp PCR System 9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行180個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)步驟，第一個(gè)步驟為10℃30秒，第二個(gè)步驟為30℃30秒。
轉(zhuǎn)化先前制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)菌(Hanaban，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，按照堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1341(圖28)。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID56。19.合成pMRT1342用分離自pMRT1336的表達(dá)盒“L5-gus-polyA35S”替換pMRT1335的表達(dá)盒“ep35S-gus-polyA35S”，獲得質(zhì)粒pMRT1342(15077bp)。
用AgeI和KprI消化10μg的質(zhì)粒pMRT1335。通過在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離如此消化的載體片段，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，并在50μl水中回收。
用XhoI消化10μg的質(zhì)粒pMRT1336，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，在50μl水中回收，在120μl反應(yīng)體積中，在12μl500mM pH7.5Tris-HCl 500mM MgCl2、6μl1M二硫蘇糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃經(jīng)受20單位的Klenow片段(NewEngland Biolabs)作用30分鐘，然后利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，并在50μl水中回收，最后用KpnI消化，獲得對(duì)應(yīng)于表達(dá)盒“L5-gus-polyA35S”的DNA插入片段(3.4kbp)。通過在TEB緩沖液中的0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離如此制備的DNA插入片段，利用“協(xié)同快速PCR純化系統(tǒng)”試劑盒純化，在50μl水中回收，用AgeI消化，利用如上所述的試劑盒純化，并在50μl水中再回收。
在20μl反應(yīng)混合物中，在2μlT410×DNA連接酶緩沖液(Epicentre Technologies)、2μl2.5mM ATP和4單位T4DNA連接酶(Epicentre Technologies)存在下，使用100ng的衍生自pMRT1335的載體片段和100ng以上制備的DNA插入片段進(jìn)行PCR連接反應(yīng)。所述反應(yīng)在“GeneAmp PCRSystem 9700”熱循環(huán)儀中進(jìn)行180個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括2個(gè)步驟，第一個(gè)步驟為10℃30秒，第二個(gè)步驟為30℃30秒。
轉(zhuǎn)化先前制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)菌(Hanahan，1983)。通過在補(bǔ)加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，按照堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA，通過酶促消化和測序核實(shí)。產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pMRT1342(圖29)。在序列表中給出了其全序列SEQ.ID57。20.產(chǎn)生重組農(nóng)桿菌按照Holsters等[Holsters M.，Dewaele D.，Depicker A，Messenf E.，Van Montagu M.和Schell J.(1978)，轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，Mol.Gen.Genet.136，181-187]描述的技術(shù)，將所述雙元質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株中。通過在補(bǔ)加利福平(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選擇獲得克隆，按照在細(xì)胞重懸浮緩沖液中加入溶菌酶(25mg/ml)進(jìn)行改良的堿裂解法提取所述克隆的質(zhì)粒DNA。通過酶促消化對(duì)所獲得的質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析。將所獲得的農(nóng)桿菌克隆用于植物遺傳轉(zhuǎn)化。
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序列表<110>MERISTE THERAPEUTICS<120>純合成載體、質(zhì)粒、包含所述載體的特基因植物或植物部分，以及生產(chǎn)它們的方法<130>synVecl<140><141><160>57<170>Patentln版本2.1<210>1<211>3508<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述質(zhì)粒pMRT1105<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(1)..(654)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori RK2<220><221>基因<222>(655)..(2013)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>misc特征<222>(2014)..(3508)<223>編碼能夠增加復(fù)制率的兩個(gè)蛋白P285和P382的pRK2TrfA基因座<400>1 <210>2<211>4098<212>DNA<213>人工序列<210><223>人工序列的描述質(zhì)粒pMRT1106<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(1)..(654)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori RK2<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(655)..(1263)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori ColEI<220><221>基因<222>(1264)..(2603)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>misc特征<222>(2604)..(4098)<223>編碼能夠增加復(fù)制率的兩個(gè)蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<400>2 <210>3<211>5971<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述質(zhì)粒pMRT1118<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(1)..(654)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori RK2<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(655)..(1263)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori ColEI<220><221>基因<222>(1264)..(2603)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>misc特征<222>(2604)..(4098)<223>編碼能夠增加復(fù)制率的兩個(gè)蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<220><221>misc特征<222>(4106)..(4271)<223>T-DNA左邊界<220><221>終止子<222>(4272)..(4559)<223>胭脂堿合成酶終止子<220><221>基因<222>(4560)..(5556)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTII基因<220><221>啟動(dòng)子<222>(5557)..(5770)<223>胭脂堿合成酶啟動(dòng)子<220><221>misc特征<222>(5791)..(5964)<223>T-DNA右邊界<220><221>misc特征<222>(5770)..(5791)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<400>3 <210>4<21l>60l6<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述質(zhì)粒pMRT1119<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(1)..(654)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori RK2<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(655)..(1263)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori ColEI<220><221>基因<222>(1264)..(2603)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>misc特征<222>(2604)..(4098)<223>編碼能夠增加復(fù)制率的兩個(gè)蛋白P285和P382的pRK2 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ColEI<220><221>基因<222>(1264)..(2603)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>misc特征<222>(2604)..(4098)<223>編碼能夠增加復(fù)制率的兩個(gè)蛋白P285和P382的pRK2TrfA基因座<220><221>misc特征<222>(4106)..(4271)<223>T-DNA左邊界<220><221>終止子<222>(4272)..(4559)<223>胭脂堿合成酶終止子<220><221>基因<222>(4560)..(5556)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTII基因<220><221>mist差異<222>(5559)<223>相對(duì)于pMRT1ll9引入BspEI限制位點(diǎn)<220><221>啟動(dòng)子<222>(5557)..(5771)<223>胭脂堿合成酶啟動(dòng)子<220><221>misc特征<222>(5771)..(5837)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<220><221>misc特征<222>(5837)..(6010)<223>T-DNA右邊界<400>5 <210>6<211>6016<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述質(zhì)粒PMRT1122<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(1)..(654)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori RK2<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(655)..(1263)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori ColEI<220><221>基因<222>(1264)..(2603)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>misc特征<222>(2604)..(4098)<223>編碼能夠增加復(fù)制率的兩個(gè)蛋白P285和P382的pRK2TrfA基因座<220><221>misc特征<222>(4106)..(4271)<223>T-DNA左邊界<220><221>終止子<222>(4272)..(4559)<223>胭脂堿合成酶終止子<220><221>基因<222>(4560)..(5556)<223>編碼新霉紊磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的野生型NPTII基因<220><221>啟動(dòng)子<222>(5557)..(5770)<223>胭脂堿合成酶啟動(dòng)子<220><221>misc特征<222>(5770)..(5836)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<220><221>misc特征<222>(5836)..(6009<223>T-DNA右邊界<400>6 <210>7<211>6017<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述質(zhì)粒pMRT1155<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(1)..(654)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori RK2<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(655)..(1263)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori ColEI<220><221>基因<222>(1264)..(2603)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>misc特征<222>(2604)..(4098)<223>編碼能夠增加復(fù)制率的兩個(gè)蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<220><221>misc特征<222>(4106)..(4271)<223>T-DNA左邊界<220><221>終止子<222>(4272)..(4559)<223>胭脂堿合成酶終止子<220><221>基因<222>(4560)..(5556)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的野生型NPTII基因<220><221>啟動(dòng)子<222>(5557)..(5771)<223>胭脂堿合成酶啟動(dòng)子<220><221>misc特征<222>(5771)..(5837)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<220><221>misc特征<222>(5837)..(6010)<223>T-DNA右邊界<400>7 (210>8<211>6767<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述質(zhì)粒pMRTll75<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(1)..(654)<223>復(fù)制起點(diǎn)oriRK2<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(655)..(1263)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori ColEI<220><221>基因<222>(1264)..(2603)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>misc特征<222>(2604)..(4098)<223>編碼能夠增加復(fù)制率的兩個(gè)蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<220><221>misc特征<222>(4106)..(4271)<223>T-DNA左邊界<220><221>終止子<222>(4272)..(4559)<223>胭脂堿合成酶終止子<220><221>基因<222>(4559)..(5556)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTII基因<220><221>啟動(dòng)子<222>(5557)..(5771)<223>胭脂堿合成酶啟動(dòng)子<220><221>misc特征<222>(5771)..(5830)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<220><221>polyA信號(hào)<222>(5830)..(6560)<223>35S核糖體的polyA<220><221>misc特征<222>(6560)..(6587)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<220><221>misc特征<222>(6587)..(6760)<223>T-DNA右邊界<400>8ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120 <210>9<211>6767<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述質(zhì)粒pMRT1176<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(1)..(654)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori RK2<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(655)..(1263)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori ColEI<220><221>基因<222>(1264)..(2603)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>misc特征<222>(2604)..(4098)<223>編碼能夠增加復(fù)制率的兩個(gè)蛋白P285和P382的pRK2TrfA基因座<220><221>misc特征<222>(4106)..(4271)<223>T-DNA左邊界<220><221>終止子<222>(4272)..(4559)<223>胭脂堿合成酶終止子<220><221>基因<222>(4559)..(5556)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的野生型NPTII基因<220><221>啟動(dòng)子<222>(5557)..(5771)<223>胭脂堿合成酶啟動(dòng)子<220><221>misc特征<222>(5771)..(5830)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<220><221>polyA信號(hào)<222>(5830)..(6560)<223>35S核糖體的polyA<220><221>misc特征<222>(6560)..(6587)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<220><221>misc特征<222>(6587)..(6760)<223>T-DNA右邊界<400>9ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat 420tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc 600cttctcgaac cctcccggaa aggtatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 660 <210>10<211>4805<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述質(zhì)粒pMRT1191<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(1)..(654)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori RK2<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(655)..(1263)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori ColEI<220><221>基因<222>(1264)..(2603)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>misc特征<222>(2604)..(4098)<223>編碼能夠增加復(fù)制率的兩個(gè)蛋白P285和P382的pKK2 TrfA基因座<220><221>misc特征<222>(4106)..(4271)<223>T-DNA左邊界<220><221>終止子<222>(4272)..(4559)<223>胭脂堿合成酶終止子<220><221>misc特征<222>(4566)..(4625)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<220><221>misc特征<222>(4625)..(4798)<223>T-DNA右邊界<400>10 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RK2<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(655)..(1263)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori ColEI<220><221>基因<222>(1264)..(2603)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>misc特征<222>(2604)..(4098)<223>編碼能夠增加復(fù)制率的兩個(gè)蛋白P285和P382的pRK2TrfA基因座<220><221>misc特征<222>(4106)..(4271)<223>T-DNA左邊界<220><221>終止子<222>(4272)..(4559)<223>胭脂堿合成酶終止子<220><221>基因<222>(4560)..(5556)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTII基因<220><221>啟動(dòng)子<222>(5557)..(5770)<223>胭脂堿合成酶啟動(dòng)子<220><221>misc特征<222>(5770)..(5829)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<220><221>啟動(dòng)子<222>(5829)..(6254)<223>小麥高分子量麥谷蛋白啟動(dòng)子<220><221>misc特征<222>(6154)..(6301)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<220><22l>內(nèi)含子<222>(6301)..(6833)<223>水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子<220><221>基因<222>(6834)..(8643)<223>編碼β-葡糖醛酸酶的GUS基因<220><221>終止子<222>(8644)..(8959)<223>胭脂堿合成酶終止子<220><221>misc特征<222>(8959)..(9136)<223>T-DNA右邊界<400>12 <210>13<2ll>6865<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述質(zhì)粒pMRT1195<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(1)..(654)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori 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atatttcgcc actggcggaa 8940gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac 9000gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga 9060tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg 9120gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta 9180gccgggctgc actcaatgta caccgacatg tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg 9240gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat 9300ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc 9360ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc 9420atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga ggcaaacaat gaatcaacaa ctctcctggc 9480gcaccatcgt cggctacagc ctcgggaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa 9540gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga 9600attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt 9660ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg 9720caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattgccaa 9780gctaattcac tcgagcagat tgtcgtttcc cgccttcagt ttaaactatc agtgtttgac 9840aggatatatt ggcgggtaaa cctaagagaa aagagcgttt attagaataa tcggatattt 9900aaaagggcgt gaaaaggttt atccgttcgt ccatttgtat gtgcatgcca accacagggt 9960ttaccggttc ctaggaaaag accgagcgcc tttgcgacgc tca 10003<210>22<211>8987<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述質(zhì)粒pMRT1212<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(1)..(654)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori RK2<220><221>復(fù)制起點(diǎn)<222>(655)..(1263)<223>復(fù)制起點(diǎn)ori ColEI<220><221>基因<222>(1264)..(2603)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>misc特征<222>(2604)..(4098)<223>編碼能夠增加復(fù)制率的兩個(gè)蛋白P285和P382的pRK2TffA基因座<220><221>基因<222>(1264)..(2603)<223>編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>終止子<22> (4272)..(4559)<223>胭脂堿合成酶終止子<220><221>基因<222>(4575)..(5150)<223>編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶和glufosinate抗性的Bar基因<220><221>啟動(dòng)子<222>(5151)..(5368)<223>胭脂堿合成酶終止子<220><221>啟動(dòng)子<222>(5369)..(6111)<223>增強(qiáng)的35S核糖體啟動(dòng)子<220><221>misc特征<222>(6111)..(6159)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<220><221>基因<222>(6159)..(8050)<223>編碼β葡糖醛酸酶的GUS基因<220><221>聚腺苷酸信號(hào)<222>(8051)..(8780)<223>來自35S核糖體的聚腺苷酸<220><221>misc特征<222>(8780)..(8807)<223>MCS多克隆位點(diǎn)<220><221>misc特征<222>(8807)..(8980)<223>T-DNA右邊界<400>22ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat 420tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc 600cttctcgaac cctcccggaa aggtatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 660aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 720cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 780ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 840aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 900cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 960cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 1020gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 1080tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 1140cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 1200ccactggcag cagccttcta ccataatccg cgataaaccc agcgaaccat ttgaggtgat 1260aggtaagatt ataccgaggt atgaaaacga gaattggacc tttacagaat tactctatga 1320agcgccatat ttaaaaagct accaagacga agaggatgaa gaggatgagg aggcagattg 1380ccttgaatat attgacaata ctgataagat aatacatctt ttatatagaa gatatcgccg 1440tatgtaagga tttcaggggg caaggcatag gcagcgcgct tatcaatata tctatagaat 1500gggcaaagca taaaaacttg catggactaa tgcttgaaac ccaggacaat aaccttatag 1560cttgtaaatt ctaccaaaat tgtggtttca aaatcggctc cgtcgatact atgttatacg 1620ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg ttttctggta tttaaggttt tagaatgcaa 1680ggaacagtga attggagttc gtcttgttat aattagcttc ttggggtatc tttaaatact 1740gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc taaaatgaga atatcaccgg aattgaaaaa 1800actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga tacggaagga atgtctcctg ctaaggtata 1860taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata tttaaaaatg acggacagcc ggtataaagg 1920gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga catgatgcta tggctggaag gaaagctgcc 1980tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca tgatggctgg agcaatctgc tcatgagtga 2040ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta tgaagatgaa caaagccctg aaaagattat 2100cgagctgtat gcggagtgca tcaggctctt tcactccatc gacatatcgg attgtcccta 2160tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga attggattac ttactgaata acgatctggc 2220cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga cactccattt aaagatccgc gcgagctgta 2280tgatttttta aagacggaaa agcccgaaga ggaacttgtc ttttcccacg gcgacctggg 2340agacagcaac atctttgtga aagatggcaa agtaagtggc tttattgatc ttgggagaag 2400cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc cttctgcgtc cggtcgatca gggaggatat 2460cggggaagaa cagtatgtcg agctattttt tgacttactg gggatcaagc ctgattggga 2520gaaaataaaa tattatattt tactggatga attgttttag tacctagatg tggcgcaacg 2580atgccggcga caagcaggag cgcaccgact tcttccgcat caagtgtttt ggctctcagg 2640ccgaggccca cggcaagtat ttgggcaagg ggtcgctggt attcgtgcag ggcaagattc 2700ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga cggtctacgg gaccgacttc attgccgata 2760aggtggatta tctggacacc aaggcaccag gcgggtcaaa tcaggaataa gggcacattg 2820ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag gagggtgaat gaatcggacg tttgaccgga 2880aggcatacag gcaagaactg atcgacgcgg ggttttccgc cgaggatgcc gaaaccatcg 2940caagccgcac cgtcatgcgt gcgccccgcg aaaccttcca gtccgtcggc tcgatggtcc 3000agcaagctac ggccaagatc gagcgcgaca gcgtgcaact ggctccccct gccctgcccg 3060cgccatcggc cgccgtggag cgttcgcgtc gtctcgaaca ggaggcggca ggtttggcga 3120agtcgatgac catcgacacg cgaggaacta tgacgaccaa gaagcgaaaa accgccggcg 3180aggacctggc aaaacaggtc agcgaggcca agcaggccgc gttgctgaaa cacacgaagc 3240agcagatcaa ggaaatgcag ctttccttgt tcgatattgc gccgtggccg gacacgatgc 3300gagcgatgcc aaacgacacg gcccgctctg ccctgttcac cacgcgcaac aagaaaatcc 3360cgcgcgaggc gctgcaaaac aaggtcattt tccacgtcaa caaggacgtg aagatcacct 3420acaccggcgt cgagctgcgg gccgacgatg acgaactggt gtggcagcag gtgttggagt 3480acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga tcaccttcac gttctacgag ctttgccagg 3540acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt acacgaaggc cgaggaatgc ctgtcgcgcc 3600tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg accgcgttgg gcacctggaa tcggtgtcgc 3660tgctgcaccg cttccgcgtc ctggaccgtg gcaagaaaac gtcccgttgc caggtcctga 3720tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg gcgaccacta cacgaaattc atatgggaga 3780agtaccgcaa gctgtcgccg acggcccgac ggatgttcga ctatttcagc tcgcaccggg 3840agccgtaccc gctcaagctg gaaaccttcc gcctcatgtg cggatcggat tccacccgcg 3900tgaagaagtg gcgcgagcag gtcggcgaag cctgcgaaga gttgcgaggc agcggcctgg 3960tggaacacgc ctgggtcaat gatgacctgg tgcattgcaa acgctagggc cttgtggggt 4020cagttccggc tgggggttca gcagccagcg ctttactggc atttcctagg ttgacgtctt 4080ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt 4140ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata 4200acacattgcg gacgttttta atgtactggg gctatccccc gggggatatc cataggcccg 4260atctagtaac ataatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg 4320ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata 4380aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat 4440atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg 4500tttgaacgat cgttcgtcga gctatgggcc ctagaactag tggatccccc gggtcatcag 4560atctcggtga cgggcaggac cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag 4620aaacccacgt catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg 4680gcatatccga gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg 4740accacgctct tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag 4800cccagtcccg tccgctggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg 4860taggcgttgc gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc 4920tcggcgacga gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc 4980ggttcctgcg gctcggtacg gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg 5040gtgcagaccg ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct 5100gggctcatgg tagatccccg ggcccggatg cagattattt ggattgagag taaatatgag 5160actctaattg gataccgagg ggaatttatg gaacgtcagt ggagcatttt tgacaagaaa 5220tatttgctag ctgatagtga ccttaggcga cttttgaacg cgcaataatg gtttctgacg 5280tatgtgctta gctcattaaa ctccagaaac ccgcggctga gtggctcctt caacggtacc 5340ctactccaag aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca 5400acaaagggta atttcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat 5460cgaaaggaca gtagaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa 5520ggctatcatt caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag 5580gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga 5640catctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccacccc tactccaaaa atgtcaaaga 5700tacagtctca gaagaccaaa gggctattga gacttttcaa caaagggtaa tttcgggaaa 5760cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcacttcatc gaaaggacag tagaaaagga 5820aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gctatcattc aagatgcctc 5880tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga 5940cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgac atctccactg acgtaaggga 6000tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca 6060tttggagagg acagcccaag cttggccggc cgttaacacg cgtggatcct taattaagtc 6120gactctaggg gtggtcagtc ccttatgtta cgtcctgtag aaaccccaac ccgtgaaatc 6180aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg aattgatcag 6240cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg cagttttaac 6300gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta tcagcgcgaa 6360gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga tgcggtcact 6420cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg cggctatacg 6480ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg tatcaccgtt 6540tgtgtgaaca acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa 6600aacggcaaga aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc 6660agcgtaatgc tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat 6720gtcgcgcaag actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc 6780agcgttgaac tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg 6840actttgcaag tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg 6900tgcgtcacag ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg 6960tcagtggcag tgaagggcga acagttcctg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc 7020tttggtcgtc atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg 7080cacgaccacg cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct 7140tacgctgaag agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact 7200gctgctgtcg gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa 7260gaactgtaca gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt 7320aaagagctga tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac 7380gaaccggata cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc ggaagcaacg 7440cgtaaactcg acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg cgacgctcac 7500accgatacca tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta cggatggtat 7560gtccaaagcg gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact tctggcctgg 7620caggagaaac tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac gttagccggg 7680ctgcactcaa tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg gctggatatg 7740tatcaccgcg tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg gaatttcgcc 7800gattttgcga cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg gatcttcact 7860cgcgaccgca aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac tggcatgaac 7920ttcggtgaaa aaccgcagca gggaggcaaa caatgaatca acaactctcc tggcgcacca 7980tcgtcggcta cagcctcggg aattgctacc gctagagaat tcggtacgct gaaatcacca 8040gtctctctct acaaatctat ctctctctat tttctccata aataatgtgt gagtagtttc 8100ccgataaggg aaattagggt tcttataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac 8160ccttagtatg tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa 8220ccaaaatcca gtactaaaat ccagatctcc taaagtccct atagatcttt gtcgtgaata 8280taaaccagac acgagacgac taaacctgga gcccagacgc cgttcgaagc tagaagtacc 8340gcttaggcag gaggccgtta gggaaaagat gctaaggcag ggttggttac gttgactccc 8400ccgtaggttt ggtttaaata tgatgaagtg gacggaagga aggaggaaga caaggaagga 8460taaggttgca ggccctgtgc aaggtaagaa gatggaaatt tgatagaggt acgctactat 8520acttatacta tacgctaagg gaatgcttgt atttataccc tataccccct aataacccct 8580tatcaattta agaaataatc cgcataagcc cccgcttaaa aattggtatc agagccatga 8640ataggtctat gaccaaaact caagaggata aaacctcacc aaaatacgaa agagttctta 8700actctaaaga taaaagatct ttcaagatca aaactagttc cctcacaccg gtgacgggga 8760tcgcatgcga tatctcgagc agattgtcgt ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt 8820tgacaggata tattggcggg taaacctaag agaaaagagc gtttattaga ataatcggat 8880atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca 8940gggtttaccg gttcctagga aaagaccgag cgcctttgcg acgctca 8987<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含AvrII限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>23aacctaggaa aagaccgagc gcctttgc 28<210>24<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含StuI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>24cggattaatg gtagaaggcc tttcacggga gggttcgaga agg 43<210>25<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含StuI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>25tgaaaggcct tctaccatta atccgcgata aacccagcga acc 43<210>26<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含BstXI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>26atgcatccaa aattttggta gaatttacaa gctataaggt tattgtcctg gg52<210>27<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述位于NdeI限制位點(diǎn)上游的寡脫氧核苷酸<400>27atcgacgagg aaatcgtcgt gctgtttgc 29<210>28<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含AvrII限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>28aaacctagga aatgccagta aagcgctggc 30<210>29<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含AvrII和AatII限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>29ttcctaggtt gacgtcttct gatgggctgc ctgtatcg38<210>30<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含SmaI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>30cctatggata tcccccgggg gatagcccca gtacattaaa aaccgtcc 47<210>31<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含SmaI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>31ctatcccccg ggggatatcc ataggcccga tctagtaaca tagatgac 48<210>32<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含Bsp120I限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>32gcgcacttgg gcccatagct cgacgaacga tcgttcaaac atttggc 47<210>33<211>47(212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含Bsp120I限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>33ttcgccgagc tatgggccca agtgcgcatu ccgtgggcga agaactc47<210>34<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述BstBI限制位點(diǎn)上游的寡脫氧核苷酸<400>34ttcttgacga gttcttctga gcggg 25<210>35<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含KpnI、Hind、EcoRI和XhoI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>35cggtaccgaa gctttgaatt cactcgagca gattgtcgtt tcccgcc 47<210>36<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含AvrII和AgcI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>36tatcctagga accggtaaac cctgtggttg gcatgc 36<210>37<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于合成片段“MCs-beg.Pnos”的寡脫氧核苷酸<400>37atatgagact ctaattggat accgagggg 29<210>38<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><23>人工序列的描述包含XhoI、EcoRI、HindIII和KpnI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>38gctcgagtga attcaaagct tcggtaccgt tgaaggagcc actcagccg 49<210>39<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于合成部分nptII和BspEI位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>39ggaatcgaaa tctcgtgatg gcagg 25<210>40<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于合成部分Pnos和nptII的寡脫氧核苷酸<400>40attattgcgc gttcaaaagt cgcc 24<210>41<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于合成MCS的XbaI、SalI、PacI、BamHI、MluI、HpaI和FseI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>41agcttggccg gccgttaaca cgcgtggatc cttaattaag tcgactctag ag 52<210>42<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于合成MCS的XbaI、SaII、PacI、BamHI、MluI、HpaI和FseI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>42aattctctag agtcgactta attaaggatc cacgcgtgtt aacggccggc ca52<210>43<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含BspEI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>43taatctgcat ccggatctgg atcgtttcgc 30<210>44<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><23>人工序列的描述包含BspEI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>44acgatccaga tccggatgca gattatttgg 30<210>45<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含BglII限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>45atgggtcacg acgagatctt cgccgtcggg 30<210>46<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含BstBI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>46aggcattggt ttcgaagcg 19<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于合成質(zhì)粒pUC19-uidA-TnosΔEcoRI的寡脫氧核苷酸<400>47tacgccaagc ttggcaattcc 21<210>48<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><23> 人工序列的描述包含NcoI和SmaI限制位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸<400>48aatacccggg accatggtcc gtcctgtag29<210>49<211>24<212>DNA<13> 人工序列<220><23> 人工序列的描述位于SnaBI限制位點(diǎn)上游的寡脫氧核苷酸<400>49atagtctgcc agttcagttc gttg 24<210>50<211>9688<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述pMRT1334<220><221>misc特征<22> (1)<23> 通過用pBIN19的nptII表達(dá)盒替換pMRT1206的nptII表達(dá)盒，獲得pMRT1334<400>50ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat 420tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc 600cttctcgaac cctcccggaa aggtatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 660aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 720cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 780ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 840aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 900cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 960cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 1020gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 1080tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 1140cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 1200ccactggcag cagccttcta ccataatccg cgataaaccc agcgaaccat ttgaggtgat 1260aggtaagatt ataccgaggt atgaaaacga gaattggacc tttacagaat tactctatga 1320agcgccatat ttaaaaagct accaagacga agaggatgaa gaggatgagg aggcagattg 1380ccttgaatat attgacaata ctgataagat aatacatctt ttatatagaa gatatcgccg 1440tatgtaagga tttcaggggg caaggcatag gcagcgcgct tatcaatata tctatagaat 1500gggcaaagca taaaaacttg catggactaa tgcttgaaac ccaggacaat aaccttatag 1560cttgtaaatt ctaccaaaat tgtggtttca aaatcggctc cgtcgatact atgttatacg 1620ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg ttttctggta tttaaggttt tagaatgcaa 1680ggaacagtga attggagttc gtcttgttat aattagcttc ttggggtatc tttaaatact 1740gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc taaaatgaga atatcaccgg aattgaaaaa 1800actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga tacggaagga atgtctcctg ctaaggtata 1860taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata tttaaaaatg acggacagcc ggtataaagg 1920gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga catgatgcta tggctggaag gaaagctgcc 1980tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca tgatggctgg agcaatctgc tcatgagtga 2040ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta tgaagatgaa caaagccctg aaaagattat 2100cgagctgtat gcggagtgca tcaggctctt tcactccatc gacatatcgg attgtcccta 2160tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga attggattac ttactgaata acgatctggc 2220cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga cactccattt aaagatccgc gcgagctgta 2280tgatttttta aagacggaaa agcccgaaga ggaacttgtc ttttcccacg gcgacctggg 2340agacagcaac atctttgtga aagatggcaa agtaagtggc tttattgatc ttgggagaag 2400cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc cttctgcgtc cggtcgatca gggaggatat 2460cggggaagaa cagtatgtcg agctattttt tgacttactg gggatcaagc ctgattggga 2520gaaaataaaa tattatattt tactggatga attgttttag tacctagatg tggcgcaacg 2580atgccggcga caagcaggag cgcaccgact tcttccgcat caagtgtttt ggctctcagg 2640ccgaggccca cggcaagtat ttgggcaagg ggtcgctggt attcgtgcag ggcaagattc 2700ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga cggtctacgg gaccgacttc attgccgata 2760aggtggatta tctggacacc aaggcaccag gcgggtcaaa tcaggaataa gggcacattg 2820ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag gagggtgaat gaatcggacg tttgaccgga 2880aggcatacag gcaagaactg atcgacgcgg ggttttccgc cgaggatgcc gaaaccatcg 2940caagccgcac cgtcatgcgt gcgccccgcg aaaccttcca gtccgtcggc tcgatggtcc 3000agcaagctac ggccaagatc gagcgcgaca gcgtgcaact ggctccccct gccctgcccg 3060cgccatcggc cgccgtggag cgttcgcgtc gtctcgaaca ggaggcggca ggtttggcga 3120agtcgatgac catcgacacg cgaggaacta tgacgaccaa gaagcgaaaa accgccggcg 3180aggacctggc aaaacaggtc agcgaggcca agcaggccgc gttgctgaaa cacacgaagc 3240agcagatcaa ggaaatgcag ctttccttgt tcgatattgc gccgtggccg gacacgatgc 3300gagcgatgcc aaacgacacg gcccgctctg ccctgttcac cacgcgcaac aagaaaatcc 3360cgcgcgaggc gctgcaaaac aaggtcattt tccacgtcaa caaggacgtg aagatcacct 3420acaccggcgt cgagctgcgg gccgacgatg acgaactggt gtggcagcag gtgttggagt 3480acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga tcaccttcac gttctacgag ctttgccagg 3540acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt acacgaaggc cgaggaatgc ctgtcgcgcc 3600tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg accgcgttgg gcacctggaa tcggtgtcgc 3660tgctgcaccg cttccgcgtc ctggaccgtg gcaagaaaac gtcccgttgc caggtcctga 3720tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg gcgaccacta cacgaaattc atatgggaga 3780agtaccgcaa gctgtcgccg acggcccgac ggatgttcga ctatttcagc tcgcaccggg 3840agccgtaccc gctcaagctg gaaaccttcc gcctcatgtg cggatcggat tccacccgcg 3900tgaagaagtg gcgcgagcag gtcggcgaag cctgcgaaga gttgcgaggc agcggcctgg 3960tggaacacgc ctgggtcaat gatgacctgg tgcattgcaa acgctagggc cttgtggggt 4020cagttccggc tgggggttca gcagccagcg ctttactggc atttcctagg ttgacgtctt 4080ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt 4140ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata 4200acacattgcg gacgttttta atgtactggg gctatccccc gggggatatc cataggcccg 4260atctagtaac ataatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg 4320ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata 4380aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat 4440atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg 4500tttgaacgat cggggatcat ccgggtctgt ggcgggaact ccacgaaaat atccgaacgc 4560agcaagatat cgcggtgcat ctcggtcttg cctgggcagt cgccgccgac gccgttgatg 4620tggacgccgg gcccgatcat attgtcgctc aggatcgtgg cgttgtgctt gtcggccgtt 4680gctgtcgtaa tgatatcggc accttcgacc gcctgttccg cagagatccc gtgggcgaag 4740aactccagca tgagatcccc gcgctggagg atcatccagc cggcgtcccg gaaaacgatt 4800ccgaagccca acctttcata gaaggcggcg gtggaatcga aatctcgtga tggcaggttg 4860ggcgtcgctt ggtcggtcat ttcgaacccc agagtcccgc tcagaagaac tcgtcaagaa 4920ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc 4980ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct 5040gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt 5100ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatca tcgccgtcgg 5160gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt 5220ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat 5280gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg 5340catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc 5400ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag 5460ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt 5520cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca 5580gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata 5640gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa 5700acgatccaga tccggtgcag attatttgga ttgagagtga atatgagact ctaattggat 5760accgagggga atttatggaa cgtcagtgga gcatttttga caagaaatat ttgctagctg 5820atagtgacct taggcgactt ttgaacgcgc aataatggtt tctgacgtat gtgcttagct 5880cattaaactc cagaaacccg cggctgagtg gctccttcaa cgttgcggtt ctgtcagttc 5940caaacgtaaa acggcttgtc ccgcgtcatc ggcgggggtc ataacgtgac tcccttaatt 6000ctccgctcat gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt cctactccaa gaatatcaaa 6060gatacagtct cagaagacca aagggctatt gagacttttc aacaaagggt aatttcggga 6120aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcgaaaggac agtagaaaag 6180gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa 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tgccaaccac agggtttacc ggttcctagg 9660aaaagaccga gcgcctttgc gacgctca9688<210>51<211>15208<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述pMRT1335<220><221>misc特征<222>(1)<223>將分離自pMRT1206的表達(dá)盒“ep35S-gus(uidA)-polyA35S”插入pBIN19，獲得pMRT1335<400>51ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat 420tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc 600cttctcgaac cctcccggcc cgctaacgcg ggcctcccat ccccccaggg gctgcgcccc 660tcggccgcga 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tcggcatagt tctcaagatc gacagcctgt cacggttaag 5820cgagaaatga ataagaaggc tgataattcg gatctctgcg agggagatga tatttgatca 5880caggcagcaa cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt 5940gtttcaaacc cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag 6000tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat 6060cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga 6120tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt 6180taatgtactg gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc 6240accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga 6300aaatcctgtt tgatggtggt tccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaatagc 6360ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 6420actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 6480cacccaaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 6540ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 6600agaaagcgaa aggagcgggc gccattcagg 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tagccgctaa aacggccggg gggtgcgcgt gattgccaag cacgtcccca 15120tgcgctccat caagaagagc gacttcgcgg agctggtgaa gtacatcacc gacgagcaag 15180gcaagaccga gcgcctttgc gacgctca15208<210>52<211>9285<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述 pMRT1336<220><221>misc特征<222>(1)<223>將分離自PCT專利申請(qǐng)PCT/IB00/00370描述的質(zhì)粒pMRT1322的啟動(dòng)子MPr1165插入到pMRT1196中，獲得pMRT1336<400>52ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat 420tgacatttga ggggctgtcc acacgcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540tttttaacca gggctgcgcc 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attgccaagc acgtccccat gcgctccatc 15000aagaagagcg acttcgcgga gctggtgaag tacatcaccg acgagcaagg caagaccgag 15060cgcctttgcg acgctca1507權(quán)利要求
1.僅含有其功能性和細(xì)胞、尤其是植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因發(fā)生(transgenesis)必需的元件的純合成載體，它包含以下與其功能性和細(xì)胞轉(zhuǎn)基因發(fā)生必需的有效連接元件-至少一個(gè)核酸序列，它編碼至少一個(gè)第一復(fù)制起點(diǎn)，優(yōu)選oriRK2，更優(yōu)選至少一個(gè)具有廣泛宿主范圍的大腸桿菌pRK2的ori V；-至少一個(gè)核酸序列，它編碼選擇劑，優(yōu)選抗生素抗性基因，更優(yōu)選賦予細(xì)菌對(duì)卡那霉素抗性的nptIII基因；-編碼至少一種蛋白的trfA基因座，所述蛋白可以增加所述質(zhì)粒的復(fù)制率，它優(yōu)選得自pRK2，更優(yōu)選編碼蛋白P285和P382。
2.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于它包括鑒定編號(hào)為SEQ.ID01的核酸序列。
3.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于它由其核酸序列鑒定編號(hào)為SEQ.ID01的單純質(zhì)粒pMRT1105組成。
4.按照前述權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于它包括至少一個(gè)編碼第二復(fù)制起點(diǎn)的核酸序列，所述第二復(fù)制起點(diǎn)優(yōu)選大腸桿菌的ori，更優(yōu)選ori ColEI。
5.按照前述權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于它包括鑒定編號(hào)為SEQ.ID02的核酸序列。
6.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于它由其核酸序列鑒定編號(hào)為SEQ.ID02的單純質(zhì)粒pMRT1106組成。
7.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于它包括由至少一個(gè)核酸序列組成的區(qū)，所述核酸序列包含幾個(gè)獨(dú)特的酶限制位點(diǎn)，總稱為《多克隆位點(diǎn)》(MCS)。
8.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于它還包括編碼T-DNA的核酸序列，所述T-DNA包括右邊界RB和左邊界LB，使得所述載體可以起雙元質(zhì)粒的作用。
9.按照權(quán)利要求7或8的純合成載體，其特征在于所述MCS位于所述T-DNA的右邊界RB附近。
10.按照權(quán)利要求8的純合成載體，其特征在于它還包括編碼至少一個(gè)表達(dá)啟動(dòng)子和至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子的核酸序列，所述核酸序列位于所述T-DNA的左邊界LB和右邊界RB之間。
11.按照權(quán)利要求10的純合成載體，其特征在于所述表達(dá)啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選選自植物表達(dá)啟動(dòng)子。
12.按照權(quán)利要求11的純合成載體，其特征在于所述表達(dá)啟動(dòng)子選自35S CaMV啟動(dòng)子、CaMV的ep35S、豌豆質(zhì)體藍(lán)素基因啟動(dòng)子、其“增強(qiáng)子”區(qū)和衍生區(qū)、小麥“高分子量麥谷蛋白”(HMWG)啟動(dòng)子、CsVMV“木薯花葉病毒”啟動(dòng)子、CoYMV“鴨跖草黃色斑點(diǎn)花葉病毒(commelina ycllow mosaic virus)”啟動(dòng)子、CsVMV和CoYMV啟動(dòng)子的嵌合啟動(dòng)子，以及它們的衍生物。
13.按照權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于所述表達(dá)終止子選自在植物細(xì)胞中有效的終止子，優(yōu)選為35S或nos終止子。
14.按照權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于它包括至少一個(gè)編碼在植物細(xì)胞中有效的選擇劑的核酸序列，優(yōu)選包括至少一個(gè)編碼抗生素抗性基因和/或除草劑抗性基因的核酸序列。
15.按照權(quán)利要求14的純合成載體，其特征在于它含有編碼bar抗性(《bialaphos抗性》)基因或pat(《膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶》)基因的序列。
16.按照權(quán)利要求14的純合成載體，其特征在于所述編碼在植物細(xì)胞中有效的選擇劑的核酸序列是編碼突變或野生型nptII抗性基因的序列。
17.按照權(quán)利要求14、15或16中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于編碼所述選擇劑的所述核酸序列位于所述T-DNA的左邊界附近。
18.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于它包括至少一個(gè)含啟動(dòng)表達(dá)的核酸序列的表達(dá)盒，所述核酸序列與需要表達(dá)的核酸序列有效連接，所述表達(dá)核酸序列編碼需要產(chǎn)生的多肽，表達(dá)盒本身結(jié)合轉(zhuǎn)錄終止核酸序列。
19.按照權(quán)利要求18的純合成載體，其特征在于所述需要產(chǎn)生的多肽是在體外和/或人類和/或動(dòng)物中具有活性的酶或蛋白或蛋白衍生物，所述活性包括消化、胰腺、膽汁、抗病毒、抗炎癥、肺、抗微生物、營養(yǎng)、化妝、結(jié)構(gòu)、血液、心血管、眼、抗原、免疫刺激和大腦活性。
20.按照前述權(quán)利要求8-19中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于它以雙元、線性或環(huán)狀質(zhì)粒形式存在，選自鑒定編號(hào)為SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID14、SEQ.ID15、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22的核酸序列。
21.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的純合成載體，其特征在于每個(gè)功能性元件都可以獨(dú)立于其它元件被切割。
22.按照權(quán)利要求21的純合成載體，其特征在于每個(gè)功能性元件都可以通過酶促消化，在存在于同一載體中的第一獨(dú)特限制位點(diǎn)和第二獨(dú)特限制位點(diǎn)的水平上獨(dú)立于其它元件被切割。
23.分離的核酸序列，其特征在于它對(duì)應(yīng)于選自以下的核酸序列鑒定編號(hào)為SEQ.ID01、SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID14、SEQ.ID15、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22的核酸序列。
24.具有穩(wěn)定整合入其基因組的按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的載體或核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物。
25.按照權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于它選自雙子葉物種，例如馬鈴薯、煙草、棉花、萵苣、番茄、甜瓜、黃瓜、豌豆、油菜、甜菜根或向日葵，或選自單子葉植物，例如小麥、大麥、燕麥、稻或玉米。
26.按照前述權(quán)利要求24或25的任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖體。
27.按照權(quán)利要求26的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖體，其特征在于它是種子。
28.包含按照前述權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的載體或核酸序列的細(xì)胞。
29.按照權(quán)利要求28的細(xì)胞，其特征在于它是植物細(xì)胞。
30.在細(xì)胞中表達(dá)編碼需要產(chǎn)生的多肽的核酸序列或基因的方法，其特征在于它包含以下步驟-用按照權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的載體或核酸序列轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞；-在允許表達(dá)編碼所述需要產(chǎn)生的多肽的核酸序列或基因的條件下，制備所述細(xì)胞的培養(yǎng)物。
31.按照權(quán)利要求30的方法，其特征在于所述細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
32.按照前述權(quán)利要求30或31中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述細(xì)胞是選自以下的細(xì)胞微生物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。
33.按照前述權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
34.獲得按照前述權(quán)利要求24或25中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物或按照權(quán)利要求26的繁殖體的方法，其特征在于它包含以下步驟-用按照前述權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的核酸序列或包含其的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞植物；-選擇所述載體或所述核酸序列整合入其中的植物細(xì)胞；-或者通過培養(yǎng)或者通過再生嵌合或轉(zhuǎn)基因全株，繁殖所述轉(zhuǎn)化并選擇的植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用以促進(jìn)或改進(jìn)一個(gè)或多個(gè)目的基因插入真核細(xì)胞(尤其是植物細(xì)胞)的純合成載體。本發(fā)明還涉及獲得這些載體以及包含它們的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1335891SQ00802418
公開日2002年2月13日 申請(qǐng)日期2000年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月3日
發(fā)明者V·格魯伯, D·科梅奧 申請(qǐng)人:默里斯坦治療公司