專利名稱：采用多種dna聚合酶的dna測序方法和所用的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA核苷酸序列分析方法和所用的試劑盒，更具體地，涉及通過對DNA核苷酸序列進行一次分析而比常規(guī)方法能更準(zhǔn)確地分析DNA全長核苷酸序列的DNA核苷酸序列分析方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
已經(jīng)知道，桑格雙脫氧核苷酸介導(dǎo)的鏈終止法是用于分析DNA核苷酸序列的常規(guī)方法。在桑格法中，DNA核苷酸鏈通過和在戊糖的C-3位含有取代的羥基的脫氧核苷酸(dNTP)反應(yīng)而延長，并通過和在戊糖的C-3位不含有取代的羥基的雙脫氧核苷酸(ddNTP)反應(yīng)而終止。
在桑格法中，四種dNTP如脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)、脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧胸苷三磷酸(dTTP)和脫氧胞苷三磷酸(dCTP)用作產(chǎn)生與模板DNA互補的DNA片段的底物。四種ddNTP如雙脫氧鳥苷三磷酸(ddGTP)、雙脫氧腺苷三磷酸(ddATP)、雙脫氧胸苷三磷酸(ddTTP)和雙脫氧胞苷三磷酸(ddCTP)用作用于終止互補DNA片段的鏈延長反應(yīng)的底物。與dNTP不同，ddNTP在戊糖的C-3位不含有羥基。因此，當(dāng)ddNTP和延長反應(yīng)中的互補DNA片段的末端反應(yīng)時，互補DNA片段的鏈延長反應(yīng)被終止。
因此，在桑格法中產(chǎn)生了不同長度的其末端被ddNTP終止的DNA片段。在桑格法中，產(chǎn)生了與模板DNA的核苷酸數(shù)目相對應(yīng)的不同的互補DNA片段，進而通過電泳，按分子量的順序?qū)⑵溥M行分離。之后，通過測定每個互補DNA片段的末端堿基來識別模板DNA的核苷酸序列。
然而，盡管桑格法很方便，但是它的一個缺陷在于，由于互補DNA延長反應(yīng)的持續(xù)合成能力是有限的，只有長度在500-700bp的DNA可以被準(zhǔn)確測定。例如，為了準(zhǔn)確和完整地識別平均長度為2Kb的人類cDNA，DNA測序步驟需要通過對人類cDNA的分割來重復(fù)三次以上。如上所解釋的，作為長DNA的測序方法，桑格法是一種費時、費力和昂貴的方法。
同時，在所謂的鳥槍法(已知是用于基因組DNA的大規(guī)模核苷酸測序方法)中，全長DNA被分割為幾個DNA片段，分別識別每個片段的堿基的序列。之后，使用計算機相互比較每個片段的序列，通過刪除重疊部分來分析全長DNA序列。在上述鳥槍法中，利用可通過一次DNA序列分析識別的DNA長度的擴展來縮減全長DNA序列分析所需的時間和勞力。
通常，在常規(guī)的桑格雙脫氧核苷酸介導(dǎo)的鏈終止方法中，采用單個的DNA聚合酶。因此，對應(yīng)于模板DNA 20-30bp的短DNA片段和對應(yīng)于模板DNA 600-700bp的長DNA片段少量生成。然而，對應(yīng)于模板DNA 40-500bp的DNA片段大量生成。所以，短DNA片段和長DNA片段的含量相對較低，從而DNA兩端末端部分的核苷酸序列比其中間部分難以測定。
由于上述原因，可通過對核苷酸序列的一次分析進行分析的DNA的長度實際上受到限制。因此，人們長期以來為得到一種新方法進行了多種研究，該方法應(yīng)能擴展通過核苷酸序列的一次分析來識別的DNA長度，所述核苷酸序列的一次分析是借助對模板DNA兩端末端部分更準(zhǔn)確的測定進行的。
發(fā)明的公開因此，本發(fā)明的目的在于提供一種通過核苷酸序列的一次分析測定較長DNA序列的方法以及該方法所用的試劑盒。本發(fā)明的方法是對常規(guī)桑格DNA測序方法的改進，它可以用于測定比可由桑格測序方法所測定的更長的DNA。
本發(fā)明的目的可以通過提供一種DNA序列分析方法來實現(xiàn)，該方法采用了兩種以上的DNA聚合酶，該聚合酶包括其對ddNTP的親和力高于常規(guī)桑格法中所用的DNA聚合酶對ddNTP的親和力的DNA聚合酶，和其對ddNTP的親和力低于常規(guī)桑格法中所用的DNA聚合酶對ddNTP的親和力的DNA聚合酶。
更具體地，其對ddNTP的親和力高于桑格法中所用的DNA聚合酶對ddNTP的親和力的DNA聚合酶大量產(chǎn)生相對短的DNA片段，而其對ddNTP的親和力低于桑格法中所用的DNA聚合酶對ddNTP的親和力的DNA聚合酶則大量生成相對長的DNA片段。因此，通過本發(fā)明的方法，同時采用對ddNTP的親和力相互不同的多種DNA聚合酶，可以無差別地得到從10bp到大于1,000bp的不同長度的DNA片段。所以，對于那些比可通過常規(guī)桑格法分析的DNA片段還長的DNA片段，可以通過本發(fā)明的方法進行DNA序列分析。
用于本發(fā)明的術(shù)語“DNA聚合酶對dNTP或ddNTP的親和力”是代表特定DNA聚合酶對dNTP或ddNTP與進行延長的DNA片段的一端的反應(yīng)頻率的貢獻程度的相對值。在本發(fā)明中，由韓國BIONEERCORPORATION制造的TopTM DNA聚合酶對dNTP或ddNTP的親和力作為DNA聚合酶對dNTP或ddNTP的親和力的標(biāo)準(zhǔn)。
圖2是DNA片段的電泳照片，該DNA片段是利用對dNTP的親和力是對ddNTP親和力0.5倍的DNA聚合酶生成的。
圖3是DNA片段的電泳照片，該DNA片段是利用對dNTP的親和力是對ddNTP親和力8000倍的DNA聚合酶生成的。
圖4是DNA片段的電泳照片，該DNA片段是利用同時包含對ddNTP的親和力不同的


圖1到圖3中的三種DNA聚合酶的DNA聚合酶混合物而生成的。
圖5是DNA片段的電泳照片，該DNA片段是利用同時包含對ddNTP的親和力不同的圖2和圖3中的兩種DNA聚合酶的DNA聚合酶混合物而生成的。
本發(fā)明的最佳實施模式下面將詳細地描述本發(fā)明。
在常規(guī)桑格法中，使用對dNTP的親和力是對ddNTP的親和力3000倍的DNA聚合酶。
本發(fā)明的方法是對桑格法的改進，其特征在于，使用DNA聚合酶混合物，該混合物同時包含其對ddNTP的親和力和對dNTP的親和力的比率高于常規(guī)用于桑格法中的DNA聚合酶的該比率的DNA聚合酶和其對ddNTP的親和力和對dNTP的親和力的比率低于常規(guī)用于桑格法中的DNA聚合酶的該比率的DNA聚合酶。
用于常規(guī)桑格法中DNA測序分析的DNA聚合酶對dNTP的親和力和對ddNTP的親和力的比率，可以代表通過由DNA聚合酶催化的將dNTP引入到DNA片段末端的鏈延長反應(yīng)頻率和通過由DNA聚合酶催化的將ddNTP引入到DNA片段末端的鏈終止反應(yīng)頻率之間的比率。
在本發(fā)明的方法中，同時使用兩類DNA聚合酶，一類是其參與dNTP引入反應(yīng)的頻率小于參與進行延長的DNA片段的鏈終止反應(yīng)的ddNTP引入反應(yīng)頻率的3000倍，優(yōu)選不超過1000倍，更優(yōu)選不超過0.5倍的DNA聚合酶；另一類是其參與dNTP引入反應(yīng)的頻率高于參與進行延長的DNA片段的鏈終止反應(yīng)的ddNTP引入反應(yīng)頻率的3000倍，優(yōu)選不小于5000倍，更優(yōu)選不小于8000倍的DNA聚合物。
因此，本發(fā)明的方法包括(i)核苷酸混合物的制備步驟，該混合物同時包含對dNTP的親和力小于對ddNTP的親和力3000倍，優(yōu)選不超過1000倍，更優(yōu)選不超過0.5倍的DNA聚合酶，和對dNTP的親和力高于對ddNTP的親和力3000倍，優(yōu)選不小于5000倍，更優(yōu)選不小于8000倍的DNA聚合酶；(ii)通過將模板DNA連同引物一起加入所述核苷酸混合物而生成互補DNA片段的步驟；和(iii)識別按照分子量順序分離的所述互補DNA片段的末端堿基以測定模板DNA的核苷酸序列的步驟。
作為本發(fā)明的另一個目的，DNA測序試劑盒由四種氣密性容器組成，該容器裝有核苷酸混合物以及對dNTP的親和力小于對ddNTP的親和力3000倍，優(yōu)選不超過1000倍，更優(yōu)選不超過0.5倍的DNA聚合酶，和對dNTP的親和力高于對ddNTP的親和力3000倍，優(yōu)選不小于5000倍，更優(yōu)選不小于8000倍的DNA聚合酶。
更詳細地，本發(fā)明的試劑盒包括(i)一氣密性容器，裝有ddATP、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、緩沖溶液、穩(wěn)定劑、對dNTP的親和力小于對ddNTP的親和力3000倍，優(yōu)選不超過1000倍，更優(yōu)選不超過0.5倍的DNA聚合酶，和對dNTP的親和力高于對ddNTP的親和力3000倍，優(yōu)選不小于5000倍，更優(yōu)選不小于8000倍的DNA聚合酶；
(ii)一氣密性容器，裝有ddGTP、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、緩沖溶液、穩(wěn)定劑、對dNTP的親和力小于對ddNTP的親和力3000倍，優(yōu)選不超過1000倍，更優(yōu)選不超過0.5倍的DNA聚合酶，和對dNTP的親和力高于對ddNTP的親和力3000倍，優(yōu)選不小于5000倍，更優(yōu)選不小于8000倍的DNA聚合酶；(iii)一氣密性容器，裝有ddCTP、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、緩沖溶液、穩(wěn)定劑、對dNTP的親和力小于對ddNTP的親和力3000倍，優(yōu)選不超過1000倍，更優(yōu)選不超過0.5倍的DNA聚合酶，和對dNTP的親和力高于對ddNTP的親和力3000倍，優(yōu)選不小于5000倍，更優(yōu)選不小于8000倍的DNA聚合酶；和(vi)一氣密性容器，裝有ddTTP、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、緩沖溶液、穩(wěn)定劑、對dNTP的親和力小于對ddNTP的親和力3000倍，優(yōu)選不超過1000倍，更優(yōu)選不超過0.5倍的DNA聚合酶，和對dNTP的親和力高于對ddNTP的親和力3000倍，優(yōu)選不小于5000倍，更優(yōu)選不小于8000倍的DNA聚合酶。
下面，參照下面的實施例更詳細地描述本發(fā)明。這些實施例用于闡明本發(fā)明，并不意味著對本發(fā)明的限定。
同時，將對dNTP的親和力是對ddNTP的親和力的3000倍的TopTM聚合酶(由Bioneer公司制造)分別加入上述四(4)種核苷酸混合物中以制備用于生成互補DNA片段的混合物，其目的是用于與本發(fā)明的結(jié)果相比較。
1.5μg的pUC19質(zhì)粒DNA作為模板DNA、M13 Universal Forward17聚體(5’-gtaaaacgacggccagt，30pmoles)作為引物和蒸餾水分別加入上述三(3)種混合物，每種制備40μg的用于生成互補DNA片段的反應(yīng)混合物。之后，將互補DNA片段生成反應(yīng)順序地重復(fù)30個循環(huán)在94℃240秒，94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 60秒，最后再在72℃進行300秒處理，制成DNA片段混合物。向每一DNA片段混合物加入40μl終止(Stop)溶液(2.5％溴酚藍，2.5％氰基二甲苯，10mMNaOH)，從而終止互補DNA片段的生成反應(yīng)。將這樣得到的DNA片段通過由8M尿素和6％丙烯酰胺制成的聚丙烯酰胺凝膠電泳，以其分子量順序進行分離。每個DNA片段的末端堿基通過使用銀-染色法(通過使用Bioneer公司制造的Silverstar染色試劑盒)識別。
將10X反應(yīng)緩沖溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain穩(wěn)定劑、5個單位的DNA聚合酶混合物(其由2.5個單位的Thermo測序酶和2.5個單位的Tfi突變DNA聚合酶組成)，和由3μM的dGTP、30μM的dATP、30μM的dTTP、30μM的dCTP和3.02μM的ddTTP組成的核苷酸混合物加入一氣密性容器；和將10X反應(yīng)緩沖溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain穩(wěn)定劑、5個單位的DNA聚合酶混合物(其由2.5個單位的Thermo測序酶和2.5個單位的Tfi突變DNA聚合酶組成)，和由3μM的dGTP、30μM的dATP、30μM的dTTP、30μM的dCTP和1μM的ddCTP組成的核苷酸混合物加入一氣密性容器，這樣制成本發(fā)明的DNA測序試劑盒，其包含四種氣密性容器。
向所述DNA核苷酸測序試劑盒的每個氣密性容器中分別加入1.5μg作為模板DNA的pUC19質(zhì)粒DNA、作為引物的M13 UniversalForward 17聚體(5’-gtaaaacgacggccagt，30pmoles)和蒸餾水，制成40μg的用于生成互補DNA片段的反應(yīng)混合物。這樣生成的DNA片段分別按其分子量順序進行分離。然后，根據(jù)實施例1的方法分析DNA片段的末端堿基。
圖1是利用常規(guī)DNA聚合酶(TopTMDNA聚合酶，5個單位)生成的DNA片段的電泳照片，其中所述DNA聚合酶對ddNTP的親和力是常規(guī)的。
圖2是利用DNA聚合酶(Tfi突變DNA聚合酶，5個單位)生成的DNA片段的電泳照片，其中所述DNA聚合酶對ddNTP的親和力高于常規(guī)DNA聚合酶對ddNTP的親和力。
圖3是利用DNA聚合酶(Thermo測序酶，5個單位)生成的DNA片段的電泳照片，其中所述DNA聚合酶對ddNTP的親和力低于常規(guī)DNA聚合酶對ddNTP的親和力。
圖4是利用由
圖1到圖3中的三種DNA聚合酶(分別為2個單位，2個單位，1個單位)組成的DNA聚合酶混合物生成的DNA片段的電泳照片，其中這些DNA聚合酶對ddNTP的親和力彼此互不相同。
圖5是利用由圖2和圖3中的兩種DNA聚合酶(分別為2.5個單位，2.5個單位)組成的本發(fā)明的DNA聚合酶混合物生成的DNA片段的電泳照片，其中這些DNA聚合酶對ddNTP的親和力不同。
工業(yè)實用性如上所述，利用本發(fā)明的方法或試劑盒可以比利用常規(guī)桑格法更準(zhǔn)確和完整地分析10-1000bp的DNA的核苷酸序列。所以，有可能通過對核苷酸序列的一次分析而測定比桑格法可測定的更長的DNA序列。
權(quán)利要求
1.一種采用雙脫氧核苷酸介導(dǎo)的鏈終止反應(yīng)的DNA核苷酸序列分析方法，其特征在于，包括(i)核苷酸混合物的制備步驟，該混合物同時包含對dNTP的親和力小于對ddNTP的親和力3000倍的DNA聚合酶和對dNTP的親和力高于對ddNTP的親和力3000倍的DNA聚合酶；(ii)通過將模板DNA連同引物一起加入所述核苷酸混合物中生成DNA片段的步驟；和(iii)識別按照分子量順序分離的所述DNA片段的末端堿基以測定模板DNA的核苷酸序列的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中核苷酸混合物同時包含對dNTP的親和力不超過對ddNTP的親和力1000倍的DNA聚合酶和對dNTP的親和力不小于對ddNTP的親和力5000倍的DNA聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中核苷酸混合物同時包含對dNTP的親和力不超過對ddNTP的親和力0.5倍的DNA聚合酶和對dNTP的親和力不小于對ddNTP的親和力8000倍的DNA聚合酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中核苷酸混合物還包含對dNTP的親和力是對ddNTP的親和力3000倍的DNA聚合酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA核苷酸序列分析方法，其中核苷酸混合物還包含對dNTP的親和力是對ddNTP的親和力1000-5000倍的DNA聚合酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的DNA核苷酸序列分析方法，其中核苷酸混合物還包含對dNTP的親和力是對ddNTP的親和力0.5-8000倍的DNA聚合酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中將DNA片段通過電泳按照其分子量順序進行分離。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中每個DNA片段的末端堿基通過銀染色法進行識別。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA核苷酸序列分析方法，其中將DNA片段通過電泳按照其分子量順序進行分離。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA核苷酸序列分析方法，其中每個DNA片段的末端堿基通過銀染色法進行識別。
11.根據(jù)權(quán)利要求3的DNA核苷酸序列分析方法，其中將DNA片段通過電泳按照其分子量順序進行分離。
12.根據(jù)權(quán)利要求3的DNA核苷酸序列分析方法，其中每個DNA片段的末端堿基通過銀染色法進行識別。
13.根據(jù)權(quán)利要求4的DNA核苷酸序列分析方法，其中將DNA片段通過電泳按照其分子量順序進行分離。
14.根據(jù)權(quán)利要求4的DNA核苷酸序列分析方法，其中每個DNA片段的末端堿基通過銀染色法進行識別。
15.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA核苷酸序列分析方法，其中將DNA片段通過電泳按照其分子量順序進行分離。
16.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA核苷酸序列分析方法，其中每個DNA片段的末端堿基通過銀染色法進行識別。
17.根據(jù)權(quán)利要求6的DNA核苷酸序列分析方法，其中將DNA片段通過電泳按照其分子量順序分離。
18.根據(jù)權(quán)利要求6的DNA核苷酸序列分析方法，其中每個DNA片段的末端堿基通過銀染色法進行識別。
19.一種DNA核苷酸測序試劑盒，包括一裝有反應(yīng)緩沖液、穩(wěn)定劑、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ddATP和DNA聚合酶的氣密性容器，一裝有反應(yīng)緩沖液、穩(wěn)定劑、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ddGTP和DNA聚合酶的氣密性容器，一裝有反應(yīng)緩沖液、穩(wěn)定劑、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ddCTP和DNA聚合酶的氣密性容器，和一裝有反應(yīng)緩沖液、穩(wěn)定劑、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ddTTP和DNA聚合酶的氣密性容器；其特征在于，所述DNA聚合酶是對dNTP的親和力小于對ddNTP的親和力3000倍的DNA聚合酶和對dNTP的親和力高于對ddNTP的親和力3000倍的DNA聚合酶的混合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的DNA核苷酸測序試劑盒，其中所述DNA聚合酶混合物由對dNTP的親和力不超過對ddNTP的親和力1000倍的DNA聚合酶和對dNTP的親和力不小于對ddNTP的親和力5000倍的DNA聚合酶組成。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的DNA核苷酸測序試劑盒，其中所述DNA聚合酶混合物由對dNTP的親和力不超過對ddNTP親和力0.5倍的DNA聚合酶和對dNTP的親和力不小于對ddNTP的親和力8000倍的DNA聚合酶組成。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的DNA核苷酸測序試劑盒，其中所述DNA聚合酶混合物還包含對dNTP的親和力是對ddNTP的親和力3000倍的DNA聚合酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的DNA核苷酸測序試劑盒，其中所述DNA聚合酶混合物還包含對dNTP的親和力是對ddNTP的親和力1000-5000倍的DNA聚合酶。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的DNA核苷酸測序試劑盒，其中所述DNA聚合酶混合物還包含對dNTP的親和力是對ddNTP的親和力0.5-8000倍的DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用雙脫氧核苷酸介導(dǎo)的鏈終止反應(yīng)的DNA核苷酸序列分析方法和所用的試劑盒,更具體地,直接涉及利用多種對雙脫氧核苷酸的親和力相互不同的DNA聚合酶進行分析的DNA核苷酸序列分析方法。
文檔編號C12Q1/68GK1336960SQ00802714
公開日2002年2月20日 申請日期2000年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月26日
發(fā)明者樸韓浯, 俞在亨 申請人:株式會社百尼爾