專(zhuān)利名稱(chēng)：用于改進(jìn)體外核酸合成和擴(kuò)增的提升熱穩(wěn)定dna聚合酶保真性的熱穩(wěn)定酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地講，涉及多核苷酸合成。本發(fā)明也涉及基本純的熱穩(wěn)定外切核酸酶、在大腸桿菌中克隆和表達(dá)熱穩(wěn)定外切核酸酶III及其在擴(kuò)增反應(yīng)中的應(yīng)用。本發(fā)明有利于在允許從遺留和合成的長(zhǎng)產(chǎn)物中去雜質(zhì)的條件下高保真性地?cái)U(kuò)增DNA。本發(fā)明可以用于許多工業(yè)、醫(yī)學(xué)和法醫(yī)目的。
使用DNA聚合酶加上或不加額外的多肽常規(guī)進(jìn)行體外核酸合成。DNA聚合酶是一個(gè)參與DNA復(fù)制和修復(fù)的酶家族。已經(jīng)在從中溫微生物例如大腸桿菌中分離DNA聚合酶方面進(jìn)行了廣泛地研究。參見(jiàn)例如Bessman等(1957)J.Biol.Chem.223171-177以及Buttin和Kornberg，(1996)J.Biol.Chem.2415419-5427。
也已經(jīng)在從嗜熱菌例如水生棲熱菌(Thermus aquaticus)中分離和純化DNA聚合酶方面進(jìn)行了研究。Chien，A.等，(1976)J.Bacteriol.1271550-1557公開(kāi)了從水生棲熱菌YT1菌株中分離并純化最適溫度為80℃的DNA聚合酶。美國(guó)專(zhuān)利第4,889,818號(hào)公開(kāi)了一種得自水生棲熱菌的純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶-Taq聚合酶，其分子量約為86,000-90,000道爾頓。另外，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0 258 017公開(kāi)了Taq聚合酶作為用于PCR方法中的優(yōu)選酶。
研究已經(jīng)表明，雖然Taq DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶依賴(lài)性外切核酸酶功能，但Taq DNA聚合酶不具有3’-5’外切核酸酶III功能(Lawyer，F(xiàn).C.等，(1989)J.Biol.Chem.，2646427-6437；Bemad A.等(1989)Cell59219)。DNA聚合酶的3’-5’外切核酸酶活性通常被稱(chēng)為“校正活性”。所述3’-5’外切核酸酶活性除去在引物-模板雙鏈體3’端錯(cuò)配的堿基。存在3’-5’外切核酸酶活性可能是有利的，因?yàn)樗鼘?dǎo)致核酸鏈復(fù)制的保真性提高并且延伸提前終止的產(chǎn)物。由于Taq DNA聚合酶不能除去錯(cuò)配的引物端，因此易出堿基摻入錯(cuò)誤，使得在某些應(yīng)用中其應(yīng)用不合要求。例如，嘗試克隆擴(kuò)增的基因存在問(wèn)題，因?yàn)樗龌虻娜魏我粋€(gè)拷貝均可能含有一個(gè)由于隨機(jī)錯(cuò)摻事件產(chǎn)生的錯(cuò)誤。根據(jù)發(fā)生錯(cuò)誤的循環(huán)(例如在早期復(fù)制循環(huán)中)，所擴(kuò)增的整個(gè)DNA可能含有錯(cuò)誤摻入的堿基，因此產(chǎn)生突變的基因產(chǎn)物。
在本領(lǐng)域中已知有幾種表現(xiàn)出3’-5’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，如得自嗜熱古細(xì)菌、用于高保真性DNA擴(kuò)增的B型聚合酶。表現(xiàn)出3’-5’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶可以分離或克隆自熱球菌屬(Pyrococcus)(純化的熱穩(wěn)定激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，Mathur E.，Stratatgene，WO92/09689，US5,545,552；得自熱球菌(Pyrococcus species)的純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，Comb D.G.等，New England Biolabs，Inc.，EP0547 359；得自古細(xì)菌(archaeon)激烈熱球菌的DNA聚合酶基因的組構(gòu)和核苷酸序列，Uemori T.等(1993)Nucl.Acids Res.，21259-265)、熱網(wǎng)菌(Pyrodictium spec.)(熱穩(wěn)定核酸聚合酶，Gelfand D.H.，F(xiàn).Hoffmann-La Roche AG，EP0624 641；得自熱網(wǎng)菌的純化的熱穩(wěn)定核酸聚合酶和DNA編碼序列，Gelfand D.H.，Hoffmann-La Roche Inc.，US5,491,086)、熱球菌屬(Thermococcus)(例如得自熱球菌的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，TY，Niehaus F.等WO97/35988；純化的Thermococcus barossiiDNA聚合酶，Luhm R.A.，Pharmacia Biotech，Inc.，WO96/22389；得自Thermococcus barossii、具有中等外切核酸酶活性并且在高溫下有較好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性、可用于DNA測(cè)序、PCR等的DNA聚合酶，Dhennezel O.B.，Pharmacia Biotech Inc.，WO96/22389；得自Thermococcus litoralis、用于DNA操作的純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，Comb D.G.，New England Biolabs，Inc.，US5,322,785，EP0 455430；得自古細(xì)菌的重組熱穩(wěn)定DNA聚合酶，Comb D.G.，NewEnglandBiolabs，Inc.，US5,322,778,EP0 547 920，EP0 701 000；得自Thermococcus gorgonarius的新分離的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，Angerer B.等Boehringer Mannheim GmbH. WO98/14590。
在校正功能存在下提供PCR的另一種可能性是應(yīng)用幾種聚合酶的混合物，其中一種聚合酶表現(xiàn)出這樣的校正活性(例如熱穩(wěn)定性增強(qiáng)和引物延伸長(zhǎng)度和效力增強(qiáng)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，Bames W.M，US5,436,149，EP0 693 078；新聚合酶組合物及其應(yīng)用，Sorge J. A.，Stratagene，WO95/16028)。通常的做法是應(yīng)用熱穩(wěn)定DNA聚合酶制劑，其包含至少一種缺乏3’-5’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的大部分組分和表現(xiàn)出3’-5’外切核酸酶活性的小部分組分，例如Taq聚合酶和Pfu DNA聚合酶。在這些混合物中，加工性由pol I型酶如Taq聚合酶提供，而校正功能由熱穩(wěn)定B型聚合酶如Pfu提供。高保真性DNA合成是核酸擴(kuò)增中的一個(gè)理想的參數(shù)，另一個(gè)重要的特征是去雜質(zhì)的可能性。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以將一個(gè)分子擴(kuò)增一萬(wàn)億倍(billionfold)。因此，甚至微小量的污染物都可以被擴(kuò)增，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。這樣的污染物通常是先前PCR擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物(遺留污染物)。因此，研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種方法以避免這樣的污染物。
所述方法依賴(lài)于在PCR擴(kuò)增期間用dUTP取代TTP，以產(chǎn)生含尿嘧啶DNA(U-DNA)。在PCR擴(kuò)增之前用尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)處理隨后的PCR反應(yīng)混合物，所述污染性核酸被降解，而不適于擴(kuò)增。dUTP可以容易地由pol I型熱穩(wěn)定聚合酶摻入，而不是由B型聚合酶摻入(G.Slupphaug等(1993)Anal.Biochem.211164-169)。在通過(guò)PCR擴(kuò)增重復(fù)分析同一類(lèi)型模板時(shí)，B型聚合酶對(duì)dUTP的摻入低限制它們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用。
也從真細(xì)菌菌株如棲熱袍菌屬(Thermotoga)中分離出表現(xiàn)出3’-5’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶(得自那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，S1ater M.R.等Promega Corporation，WO96/41014；得自那不勒斯棲熱袍菌的克隆的DNA聚合酶及其突變體，Hughes A.J.等，Life Technologies，Inc.WO96/10640；得自海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)的純化的熱穩(wěn)定核酸聚合酶，Gelfand D.H.等，GETUS Corporation，WO92/03556)。這些酶具有強(qiáng)的能夠去除錯(cuò)摻或錯(cuò)配堿基的3’-5’外切核酸酶活性。遺傳工程形式的該酶以ULTma市售，這是一種可以不用額外的多肽而用于PCR過(guò)程的DNA聚合酶。該酶能夠去除錯(cuò)摻堿基、摻入dUTP，但其保真性由于未知原因不高于Taq聚合酶的保真性(在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的復(fù)制準(zhǔn)確性。Diaz R.S.等Braz.J.Med.Biol.Res.(1998)311239-1242；Pfu DNA聚合酶和其它熱穩(wěn)定DNA聚合酶的PCR保真性，Cline J.等，Nucleic Acids Res.(1996)243546-3551)。
對(duì)于高保真性DNA合成，應(yīng)用B型聚合酶或含其混合物的另一種替代方法是應(yīng)用嗜熱DNA聚合酶III全酶，這是一種18個(gè)多肽鏈的復(fù)合體。這些復(fù)合體與細(xì)菌染色體復(fù)制酶相同，包含合成數(shù)百個(gè)千堿基的DNA鏈或整個(gè)染色體所必需的所有因子。該酶的10個(gè)不同的亞基中某些亞基以多個(gè)拷貝存在，這10個(gè)不同的亞基可以通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生，將其重新構(gòu)建并且用于體外DNA合成中。作為這些復(fù)合體的可能用途，提出通過(guò)PCR擴(kuò)增數(shù)千個(gè)千堿基對(duì)至數(shù)百個(gè)千堿基對(duì)的核酸。(得自嗜熱生物、用作染色體復(fù)制酶的酶及其制備和應(yīng)用，Yurieva O.等，The Rockfeller University，WO98/45452；新型嗜熱聚合酶III全酶，McHenry C.，ENZYCO Inc.，WO99/13060)。
本發(fā)明的目標(biāo)是開(kāi)發(fā)優(yōu)選同時(shí)能夠摻入dUTP的高保真性PCR系統(tǒng)。按照本發(fā)明，提供表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的熱穩(wěn)定酶，而當(dāng)將該酶加入表現(xiàn)出聚合酶活性的第二種酶中時(shí)，該酶增強(qiáng)擴(kuò)增過(guò)程的保真性。所提供的酶可以切下錯(cuò)配引物端，使得在合成DNA的過(guò)程中表現(xiàn)出聚合酶活性的第二種酶例如Taq聚合酶能夠重新組合并再進(jìn)行延伸。本發(fā)明的酶能夠作為校正酶與表現(xiàn)出聚合酶活性的第二種酶配合。發(fā)現(xiàn)適合于這一任務(wù)的酶是例如熱穩(wěn)定外切核酸酶III。最好使用從3’至5’方向作用、切割磷酸酯的5’、留下3’羥基并且理想的是僅對(duì)雙鏈DNA作用的外切核酸酶III。DNA聚合酶的3’-5’外切核酸酶活性對(duì)雙鏈和單鏈DNA均有活性。后一活性可能導(dǎo)致引物降解，這是在PCR測(cè)定中不希望有的。最好是，該酶于70-80℃有活性，足夠穩(wěn)定以經(jīng)受住變性循環(huán)，并且在較低溫度下無(wú)活性，以在PCR過(guò)程完成后使得PCR產(chǎn)物未被降解。表現(xiàn)出這些特征的酶可以來(lái)源于嗜熱真細(xì)菌或得自嗜熱古細(xì)菌(archaea)的相關(guān)酶。對(duì)三種熱穩(wěn)定古細(xì)菌的基因組進(jìn)行測(cè)序，這三種古細(xì)菌是詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(產(chǎn)甲烷古細(xì)菌詹氏甲烷球菌的全基因組序列，Bult C.J.等，(1996)Science2731058-1072)、熱自養(yǎng)甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(熱自養(yǎng)甲烷桿菌ΔH的全基因組序列功能分析和比較基因組，Smith DR.等，J.of Bacteriology(1997)1797135-7155)和閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(嗜高溫硫酸鹽還原古細(xì)菌閃爍古生球菌的全基因組序列，Klenk H.-P.等(1997)Nature390364-370)。
特別是，提供可得自閃爍古生球菌的熱穩(wěn)定酶，該酶在雙鏈DNA中催化引物或多核苷酸的錯(cuò)配末端以3’-5’方向降解?？寺×司幋a可得自閃爍古生球菌(Afu)的熱穩(wěn)定外切核酸酶III的基因，將其在大腸桿菌中表達(dá)并進(jìn)行分離。該酶在用于PCR反應(yīng)中的溫育和溫度條件下有活性。在反應(yīng)混合物中存在或不存在dUTP的情況下，該酶支持DNA聚合酶如Taq以低出錯(cuò)率進(jìn)行DNA合成并且在基因組DNA上以良好的收率合成超過(guò)3kb的產(chǎn)物，3kb是由Taq聚合酶合成的產(chǎn)物的上限。優(yōu)選每2.5U Taq聚合酶使用50-500ng可得自Afu的外切核酸酶III，以便得到最佳PCR性能。更優(yōu)選在PCR反應(yīng)中每2.5U Taq聚合酶使用67ng-380ng可得自Afu的外切核酸酶III。
因此，本發(fā)明的酶能夠作為校正酶與Taq聚合酶配合。與其它酶相比應(yīng)用本發(fā)明酶的優(yōu)點(diǎn)是，本發(fā)明的酶優(yōu)選對(duì)雙鏈DNA有活性。本發(fā)明的熱穩(wěn)定酶可以用于必需或需要這種酶活性的任何目的。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該酶結(jié)合熱穩(wěn)定DNA聚合酶一起用于稱(chēng)為PCR的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，以便去除導(dǎo)致提前終止的錯(cuò)配引物端，提供被所述聚合酶更有效地延伸的引物端，校正堿基摻入錯(cuò)誤，并且使得所述聚合酶能夠產(chǎn)生長(zhǎng)PCR產(chǎn)物。
此外，本發(fā)明的主題是一種組合物，所述組合物包含一種第一種熱穩(wěn)定酶和一種第二種熱穩(wěn)定酶，所述第一種熱穩(wěn)定酶表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性，所述第二種熱穩(wěn)定酶表現(xiàn)出聚合酶活性，而與單獨(dú)應(yīng)用所述第二種熱穩(wěn)定酶相比，擴(kuò)增過(guò)程的保真性由于應(yīng)用該組合物而得到增強(qiáng)。本發(fā)明的表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的熱穩(wěn)定酶也包括表現(xiàn)出DNA聚合酶活性降低或根本無(wú)這種活性的合適的酶。按照本發(fā)明的DNA聚合酶活性降低是指低于表現(xiàn)出DNA聚合酶活性的酶的所述活性的50％。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物中的第二種酶缺失校正活性。特別優(yōu)選的是，所述第二種酶是Taq聚合酶。
本發(fā)明的另一個(gè)主題是一種DNA合成方法，該方法使用包含一種表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的第一種熱穩(wěn)定酶和一種表現(xiàn)出聚合酶活性的第二種酶的混合物。按照該方法，提前終止的鏈通過(guò)從3’至5’的降解作用而被修剪。按照該方法，或者引物或者生長(zhǎng)中的鏈的錯(cuò)配端被去除。
本發(fā)明還包括一種按照上述描述的方法，但其中dUTP存在于所述反應(yīng)混合物中，部分或全部取代TTP。最好是按照該方法，使用尿嘧啶糖基化酶(UDG或UNG)來(lái)降解污染性核酸。
最好是，按照該方法，以下酶的混合物-第一種熱穩(wěn)定酶，表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性，和-第二種酶，表現(xiàn)出聚合酶活性產(chǎn)生出錯(cuò)率較低的PCR產(chǎn)物，其出錯(cuò)率低于在缺乏表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的所述第一種熱穩(wěn)定酶時(shí)由表現(xiàn)出聚合酶活性的所述第二種酶產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的出錯(cuò)率。在該方法中，表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的所述第一種熱穩(wěn)定酶和一種表現(xiàn)出聚合酶活性的第二種酶的混合物，產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度大于在缺乏表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的所述第一種熱穩(wěn)定酶時(shí)由表現(xiàn)出聚合酶活性的所述第二種酶產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度。此外，表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的所述第一種熱穩(wěn)定酶與大腸桿菌的外切核酸酶III相關(guān)，但按照該方法是熱穩(wěn)定的。上述方法的另一個(gè)實(shí)施方案是其中獲得具有平端的PCR產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明的主題也是獲得表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的本發(fā)明熱穩(wěn)定酶的方法以及產(chǎn)生該酶的方法和材料例如載體和宿主細(xì)胞(例如DSM no.13021)。
提供以下實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述附圖簡(jiǎn)述


圖1得自閃爍古生球菌的外切核酸酶III的DNA聚合酶的編碼基因的DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。圖2如實(shí)施例V中描述的在大腸桿菌中表達(dá)的閃爍古生球菌的重組外切核酸酶III對(duì)熱變性的抗性。
1道于50℃溫育2道于60℃溫育3道于70℃溫育4道于80℃溫育5道于90℃溫育6道未用Afu外切核酸酶III的編碼基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌宿主細(xì)胞提取物
7道大腸桿菌的外切核酸酶III8道分子量標(biāo)記圖3如實(shí)施例VI中描述的Afu外切核酸酶III對(duì)DNA片段的外切核酸酶活性。
1道10單位大腸桿菌外切核酸酶III，于37℃溫育2道50ng Afu外切核酸酶III，于72℃溫育3道100ng Afu外切核酸酶III，于72℃溫育4道150ng Afu外切核酸酶III，于72℃溫育5道100ng Afu外切核酸酶III，于72℃溫育6道200ng Afu外切核酸酶III，于72℃溫育7道300ng Afu外切核酸酶III，于72℃溫育8道250ng Afu外切核酸酶III，于72℃溫育9道750ng Afu外切核酸酶III，于72℃溫育10道1μg Afu外切核酸酶III，于72℃溫育11道500ng Afu外切核酸酶III，于72℃溫育12道1μg Afu外切核酸酶III，于72℃溫育13道1.5μg Afu外切核酸酶III，于72℃溫育14道1.5μg Afu外切核酸酶III，于72℃溫育15道3μg Afu外切核酸酶III，于72℃溫育16道4.5μg Afu外切核酸酶III，于72℃溫育17道7.6μg Afu外切核酸酶III，于72℃溫育18道15.2μg Afu外切核酸酶III，于72℃溫育19道22.8μg Afu外切核酸酶III，于72℃溫育20道不加入外切核酸酶圖4錯(cuò)配校正測(cè)定的原理。圖5如實(shí)施例VII中描述的在PCR中錯(cuò)配引物校正。
1道DNA分子量標(biāo)記V(ROCHE Molecular Biochemicals No.821705)2道G∶A錯(cuò)配引物，用Taq DNA聚合酶擴(kuò)增3道與2道相同，但隨后用BsiEI切割4道G∶A錯(cuò)配引物，用擴(kuò)增HiFi PCR系統(tǒng)擴(kuò)增5道與4道相同，但隨后用BsiEI切割6道G∶A錯(cuò)配引物，用Taq聚合酶/Afu外切核酸酶III擴(kuò)增7道與6道相同，但隨后用BsiEI切割8道G∶A錯(cuò)配引物，用Tgo DNA聚合酶擴(kuò)增9道與8道相同，但隨后用BsiEI切割10道G∶T錯(cuò)配引物，用Taq DNA聚合酶擴(kuò)增11道與10道相同，但隨后用BsiEI切割12道G∶T錯(cuò)配引物，用擴(kuò)增HiFi PCR系統(tǒng)擴(kuò)增13道與12道相同，但隨后用BsiEI切割14道G∶T錯(cuò)配引物，用Taq聚合酶/Afu外切核酸酶III擴(kuò)增15道與14道相同，但隨后用BsiEI切割16道G∶T錯(cuò)配引物，用Tgo DNA聚合酶擴(kuò)增17道與16道相同，但隨后用BsiEI切割18道DNA分子量標(biāo)記V19道DNA分子量標(biāo)記V20道G∶C錯(cuò)配引物，用Taq DNA聚合酶擴(kuò)增21道與20道相同，但隨后用BsiEI切割22道 G∶C錯(cuò)配引物，用擴(kuò)增HiFi PCR系統(tǒng)擴(kuò)增
23道與22道相同，但隨后用BsiEI切割24道G∶C錯(cuò)配引物，用Taq聚合酶/Afu外切核酸酶III擴(kuò)增25道與24道相同，但隨后用BsiEI切割26道G∶C錯(cuò)配引物，用Tgo DNA聚合酶擴(kuò)增27道與26道相同，但隨后用BsiEI切割28道CG∶AT錯(cuò)配引物，Taq DNA聚合酶29道與28道相同，但隨后用BsiEI切割30道CG∶AT錯(cuò)配引物，擴(kuò)增HiFi PCR系統(tǒng)31道與2道相同，但隨后用BsiEI切割32道CG∶AT錯(cuò)配引物，Taq聚合酶/Afu外切核酸酶III33道與2道相同，但隨后用BsiEI切割34道CG∶AT錯(cuò)配引物，用Tgo DNA聚合酶擴(kuò)增35道與2道相同，但隨后用BsiEI切割36道DNA分子量標(biāo)記V。圖6A在PCR中不同聚合酶的出錯(cuò)率圖6B如實(shí)施例VIII中描述，在PCR混合物中存在的Afu外切核酸酶III提高保真性。
將藍(lán)色白色菌落之比作圖，與Taq DNA聚合酶(Taq)、擴(kuò)增HiFiPCR系統(tǒng)(HiFi)和Pwo DNA聚合酶(Pwo)相比，測(cè)試Taq DNA聚合酶和Afu外切核酸酶III的各種混合物(Taq/Exo 1∶30、Taq/Exo 1∶20、Taq/Exo 1∶15、Taq/Exo 1∶12.5、Taq/Exo 1∶10，分別相當(dāng)于2.5單位Taq DNA聚合酶與125ng、175ng、250ng、375ng和500ng Afu外切核酸酶III混合)。圖7如實(shí)施例IX中所述，由Taq DNA聚合酶/Afu外切核酸酶III混合物摻入dUTP。
1道DNA分子量標(biāo)記XIV(Roche Molecular Biochemicals No.1721933)2道用2.5單位Taq DNA聚合酶擴(kuò)增3道用2.5單位Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III擴(kuò)增4道用2.5單位Taq DNA聚合酶和250ng Afu外切核酸酶III擴(kuò)增5道用2.5單位Taq DNA聚合酶和375ng Afu外切核酸酶III擴(kuò)增6道用2.5單位Taq DNA聚合酶和500ng Afu外切核酸酶III擴(kuò)增圖8如實(shí)施例IX所述，由尿嘧啶-DNA糖基化酶降解含dUTP的PCR產(chǎn)物。
1道DNA分子量標(biāo)記XIV(Roche Molecular Biochenucals No.1721933)2道1μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及隨后的UNG和熱處理獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。
3道2μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及隨后的UNG和熱處理獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。
4道3μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及隨后的UNG和熱處理獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。
5道4μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及隨后的UNG和熱處理獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。
6道5μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及隨后的UNG和熱處理獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。
7道5μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及隨后的UNG和熱處理獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。
8道5μl用Taq DNA聚合酶和125ng Afu外切核酸酶III以及隨后的UNG和熱處理獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。
9道DNA分子量標(biāo)記XIV(Roche Molecular Biochemicals No1721933)圖9Afu外切核酸酶III對(duì)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的影響。如實(shí)施例X中所述，利用人基因組DNA分析Taq DNA聚合酶/Afu外切核酸酶III混合物。
1道9.3kb tPA片段，使用Taq/Exo III混合物2道” Taq/Pol.
3道12kb tPA片段，使用Taq/Exo III混合物4道”Taq-Pol.
3道15kb tPA片段，使用Taq/Exo III混合物4道”Taq-Pol.
圖10如實(shí)施例XI中所述，可以用聚合酶活性降低但3’外切核酸酶活性提高的聚合酶突變體取代熱穩(wěn)定外切核酸酶III。
1道分子量標(biāo)記2道反應(yīng)1，Taq聚合酶，4.8kb片段3道反應(yīng)2，Taq聚合酶加上Tag聚合酶突變體，4.8kb片段4道反應(yīng)3，無(wú)Taq聚合酶，Tag聚合酶突變體，4.8kb片段5道反應(yīng)4，Taq聚合酶加上Afu ExoHI，4.8kb片段6道反應(yīng)5，Taq聚合酶，9.3kb片段
7道反應(yīng)6，Taq聚合酶加上Tag聚合酶突變體，93kb片段8道反應(yīng)7，無(wú)Taq聚合酶，Tag聚合酶突變體，93kb片段9道反應(yīng)8，Taq聚合酶加上Afu ExoIII，9.3kb片段10道分子量標(biāo)記
圖11如實(shí)施例XII中所述，Afu外切核酸酶III對(duì)線性單鏈DNA無(wú)活性1道Afu Exo III，不溫育2道Afu Exo III，于65℃ 1小時(shí)3道Afu Exo III，于65℃ 2小時(shí)4道Afu Exo III，于65℃ 3小時(shí)5道Afu Exo III，于65℃ 4小時(shí)6道Afu Exo III，于65℃ 5小時(shí)7道無(wú)酶的反應(yīng)緩沖液，不溫育8道無(wú)酶的反應(yīng)緩沖液，于65℃ 5小時(shí)9道分子量標(biāo)記
圖12如實(shí)施例XIII中所述，Afu外切核酸酶III與熱穩(wěn)定B型聚合酶在引物降解活性方面的比較。
1道分子量標(biāo)記2道1u Tgo，預(yù)溫育(反應(yīng)1)3道1.5u Tgo，預(yù)溫育(反應(yīng)2)4道1u Tgo，無(wú)預(yù)溫育(反應(yīng)3)5道1.5u Tgo，無(wú)預(yù)溫育(反應(yīng)4)6道1u Tgo，在缺乏dNTP的情況下預(yù)溫育(反應(yīng)5)7道1.5u Tgo，在缺乏dNTP的情況下預(yù)溫育(反應(yīng)6)
8道1u Tgo，在缺乏dNTP的情況下無(wú)預(yù)溫育(反應(yīng)7)9道1.5u Tgo，在缺乏dNTP的情況下無(wú)預(yù)溫育(反應(yīng)8)10道1u Tgo，在缺乏dNTP的情況下預(yù)溫育，補(bǔ)充額外的引物(反應(yīng)9)11道1.5u Tgo，在缺乏dNTP的情況下預(yù)溫育，補(bǔ)充額外的引物(反應(yīng)10)12道Taq聚合酶，預(yù)溫育(反應(yīng)11)13道Taq加上37.5ng Afu Exo III，預(yù)溫育(反應(yīng)12)14道Taq加上75ng Afu Exo III，預(yù)溫育(反應(yīng)13)15道Taq聚合酶，無(wú)預(yù)溫育(反應(yīng)14)16道Taq加上37.5ng Afu Exo III，無(wú)預(yù)溫育(反應(yīng)15)17道Taq加上75ng Afu Exo III，無(wú)預(yù)溫育(反應(yīng)16)18道分子量標(biāo)記實(shí)施例I編碼序列的分離此中優(yōu)選的熱穩(wěn)定酶是可得自閃爍古生球菌VC-16菌株(DSM No.4304)的熱穩(wěn)定非常高的外切脫氧核糖核酸酶。該菌株分離自意大利Vulcano island and Stufe di Nerone，Naples的海洋溫濕系統(tǒng)(Stetter，K.O.等，Science(1987)236822-824)。該生物是極強(qiáng)的嗜熱、硫代謝古細(xì)菌，生長(zhǎng)范圍在60℃和95℃之間，最適溫度為83℃。(Klenk，H.P.等，Nature(1997)390364-370)。所述基因組序列保存在TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)中。推定編碼外切核酸酶III的基因(xthA)的登錄號(hào)為AF0580。當(dāng)與已知分子量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)相比時(shí)(SDS-PAGE)，可得自閃爍古生球菌的外切脫氧核糖核酸酶的表觀分子量約為32,000道爾頓。本發(fā)明的熱穩(wěn)定酶的真正分子量可以由閃爍古生球菌外切脫氧核糖核酸酶III基因的編碼序列來(lái)確定。
實(shí)施例II得自閃爍古生球菌的外切核酸酶III編碼基因的克隆用約6ml DSM No.4304的細(xì)胞培養(yǎng)物，從閃爍古生球菌中分離染色體DNA。
設(shè)計(jì)以下引物，所述引物具有與所需表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)匹配的限制位點(diǎn)，并且與閃爍古生球菌外切核酸酶III基因的N末端和C末端互補(bǔ)SEQ ID NO.1 5‘-GAA ACG AGG ATC CAT GCT CAA AAT CGC CAC C-3′N(xiāo)末端(BamHI位點(diǎn))SEQ ID NO25‘-TTG TTC ACT GCA GCT ACA CGT CAA ACA CAG C-3′C末端(PstI位點(diǎn))首先通過(guò)在一個(gè)2ml eppendorf管中以5,000rpm重復(fù)離心，收集所述細(xì)胞?？梢圆捎糜糜趶募?xì)菌細(xì)胞進(jìn)行分離的任一描述的方法進(jìn)行DNA分離。在這種情況下，用High PureTM PCR模板制備試劑盒(ROCHE Diagnostics GmbH，No.1796828)制備閃爍古生球菌基因組DNA。用這種方法，獲得濃度為72ng/μl的約6μg染色體DNA。
在4個(gè)相同的制備中，用上述引物，在ExpandTM高保真性PCR系統(tǒng)(ROCHE Diagnostics GmbH，No.1732641)和每管100ng閃爍古生球菌基因組DNA中進(jìn)行PCR。采用以下條件進(jìn)行PCR1× 94℃，2分鐘；10×94℃10秒；54℃30秒；68℃30秒；20×94℃10秒；54℃30秒；68℃3分鐘，每個(gè)循環(huán)加上20秒的循環(huán)延伸；1× 68℃7分鐘；在加入MgCl2至終濃度為10mM后，用BamHI和PstI各10單位于37℃酶切PCR產(chǎn)物2小時(shí)。在低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上分離反應(yīng)產(chǎn)物。在電泳后，切下合適的條帶，將凝膠條合并、熔化，通過(guò)瓊脂糖酶消化分離所述DNA片段，并用EtOH沉淀。將干燥的沉淀在30μl水中稀釋。
用所述插入片段所用的相同的限制性酶消化合適的表達(dá)載體，在這里是pDS56 T，并用相同的方法進(jìn)行提純(cleau)。
用快速DNA連接試劑盒(ROCHE Diagnostics GmbH，No.1635379)連接插入片段和載體后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主大腸桿菌392pUBS520(Brinkmann，U.等(1989)Gene85109-114)中。
用High PureTM質(zhì)粒分離試劑盒(ROCHE Diagnostics GmbH，No.1754777)分離轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，并通過(guò)用BamHI和PstI進(jìn)行限制消化以及瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行表征。
陽(yáng)性大腸桿菌pUBS520 ExoIII轉(zhuǎn)化子在甘油培養(yǎng)物中貯存于-70℃。通過(guò)DNA測(cè)序確證外切核酸酶III的編碼基因的序列。該序列示于
圖1中。
來(lái)自閃爍古生球菌或其它嗜熱生物的外切核酸酶III的克隆和表達(dá)也可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的其它技術(shù)來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)例如Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，Cold SpringHarbour Lab.，1989)。
實(shí)施例III重組Afu外切核酸酶III的表達(dá)在發(fā)酵罐中，在含有合適抗生素的豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)得自實(shí)施例I的轉(zhuǎn)化子。在光密度為[A540]5.5時(shí)通過(guò)離心收獲細(xì)胞，并且將其冷凍直至需要時(shí)，或通過(guò)用溶菌酶處理進(jìn)行裂解，以產(chǎn)生含有閃爍古生球菌外切核酸酶III活性的粗制細(xì)胞提取物。
采用實(shí)施例IV中描述的方法，或采用其它純化技術(shù)，例如親和色譜、離子交換色譜或疏水相互作用色譜，純化含有閃爍古生球菌外切核酸酶III活性的粗提取物。
實(shí)施例IV重組Afu外切核酸酶III的純化在10l發(fā)酵罐中，在含有胰胨(20g/l)、酵母提取物(10g/l)、NaCl(5g/l)和氨芐青霉素(100mg/l)的培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)得自實(shí)施例I的大腸桿菌pUBS520 ExoIII(DSM No.13021)，在指數(shù)生長(zhǎng)中期用IPTG(0.3mM)誘導(dǎo)，并再溫育4小時(shí)。通過(guò)離心收獲約45g細(xì)胞，將其貯存于-70℃。將2g細(xì)胞解凍，懸浮于4ml緩沖液A(40mM Tris/HCl，pH7.5；0.1mM EDTA；7mM2-巰基乙醇；1mM Pefabloc SC)中。在攪拌下，通過(guò)加入1.2mg溶菌酶于4℃達(dá)30分鐘，并且加入4.56mg脫氧膽酸鈉于室溫下達(dá)10分鐘，然后于0℃20分鐘，裂解所述細(xì)胞。將粗提取物調(diào)至750mM KCl，于72℃加熱15分鐘，并且離心去除變性蛋白。
高至90℃的加熱溫度也是可能的，在該溫度下不破壞(變性)閃爍古生球菌外切核酸酶III。將上清液對(duì)調(diào)至10mM MgCl2的緩沖液B(含有10％甘油的緩沖液A)透析，然后加樣于大小為1×7cm并且床體積為5.5ml、用緩沖液B平衡的Blue Trisacryl M柱(SERVA，No.67031)。用16.5ml緩沖液B洗滌該柱，用82ml緩沖液B中0-3M NaCl的線性梯度洗脫所述外切核酸酶蛋白。通過(guò)在10-15％SDS-PAGE梯度凝膠上電泳，分析所述柱流分(fraction)的閃爍古生球菌外切核酸酶蛋白。將16.5ml活性流分合并、用Aquacide II(Calbiochem No.17851)濃縮，并且對(duì)貯存緩沖液C(10mM Tris/HCl，pH7.9；10mM2-巰基乙醇；0.1mM EDTA；50mM Kcl；50％甘油)透析。透析后，加入Thesit和NonidetP40至終濃度均為0.5％。將該制備物貯存于-20℃。
通過(guò)SDS凝膠電泳估計(jì)，所獲得的閃爍古生球菌外切核酸酶III的純度為95％。收率為每2.3g細(xì)胞量(cellmass)(濕重)50mg蛋白。
實(shí)施例V得自閃爍古生球菌的重組外切核酸酶III的熱穩(wěn)定性通過(guò)分析對(duì)熱變性的抗性，測(cè)定如實(shí)施例II中所述克隆的閃爍古生球菌的外切核酸酶III的熱穩(wěn)定性。如實(shí)施例IV中所述裂解后，將100μl所述粗提取物在Eppendorf離心機(jī)中以15,000rpm離心10分鐘。將上清液等份分裝到5個(gè)新Eppendorf管中。將所述管于5個(gè)不同的溫度50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下溫育10分鐘。在如上所述離心后，通過(guò)在10-15％SDS-PAGE梯度凝膠上電泳，分析等份的上清液。如圖2中所示，于90℃溫育后閃爍古生球菌外切核酸酶III蛋白的量與在較低溫度下處理的樣品一樣。沒(méi)有可測(cè)量的由于熱變性引起的明顯損失。根據(jù)這一結(jié)果，可以推斷于90℃下半壽期超過(guò)10分鐘。
實(shí)施例VIAfu外切核酸酶III的活性外切核酸酶III催化從雙鏈體DNA的3’-羥基末端逐步去除單核苷酸(Rogers G.S.和Weiss B.(1990)Methods Enzymol.65201-211)。在每個(gè)結(jié)合事件期間去除數(shù)目有限的核苷酸。優(yōu)選的底物是3’平端或3’凹端。該酶對(duì)單鏈DNA無(wú)活性，3’突出端對(duì)酶切的抗性較強(qiáng)。DNA分子量標(biāo)記VI(ROCHE Molecular Biochemicals，No.1062590)由BglI消化的pBR328與HinfI消化的pBR328混合而組成。所述HinfI消化產(chǎn)物具有3’凹端，預(yù)期是外切核酸酶III降解的優(yōu)選底物，所述BglI酶切產(chǎn)物具有突出3個(gè)堿基的3’突出端，應(yīng)該對(duì)外切核酸酶III酶切的抗性較強(qiáng)。
將得自實(shí)施例IV的閃爍古生球菌外切核酸酶III的連續(xù)稀釋液與0.5μg DNA分子量標(biāo)記VI(ROCHE Molecular Biochemicals，No.1062590)在25μl以下溫育緩沖液10mM Tris/HCl，pH8.0；5mMMgCl2；1mM2-巰基乙醇；100mM NaCl中，覆蓋石蠟于72℃溫育2小時(shí)。包括10單位大腸桿菌外切核酸酶III(ROCHE MolecularBiochemicals，No.779709)作為對(duì)照。對(duì)照反應(yīng)于37℃下進(jìn)行。在加入5μl終止溶液(0.2％瓊脂糖，60mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH7.8，10％甘油，0.01％溴酚藍(lán))后，在1％瓊脂糖凝膠上分離混合物。結(jié)果示于圖3。Afu外切核酸酶III辨別出兩種不同類(lèi)型的底物。優(yōu)選的底物是具有3’凹端的片段(例如1766bp片段)，3’突出端(例如2176bp、1230bp、1033bp片段)對(duì)降解更具抗性。對(duì)于較高分子量的蛋白，所述底物的降解程度與分析大腸桿菌外切核酸酶III的產(chǎn)物的1道相似。使用增加量的Afu外切核酸酶蛋白，僅留下少量DNA底物(15-19道)，剩余片段的再降解可能是由作為所述制備物的雜質(zhì)的DNA結(jié)合蛋白引起的。
實(shí)施例VII在具有Afu外切核酸酶III的PCR中錯(cuò)配引物的校正用3’末端錯(cuò)配引物測(cè)試在PCR期間Afu外切核酸酶III/Taq聚合酶混合物的修復(fù)效率，該測(cè)定的原理示于圖4。對(duì)于PCR擴(kuò)增，使用其中正向引物在3’端具有一個(gè)或兩個(gè)不能與模板DNA配對(duì)的核苷酸的引物組。切除錯(cuò)配的引物端并且擴(kuò)增修復(fù)的引物，產(chǎn)生隨后可以用限制性?xún)?nèi)切核酸酶BsiEI切割的產(chǎn)物，而由錯(cuò)配引物產(chǎn)生的產(chǎn)物抗切割。
所用的引物是1.反向 5‘GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CG-3‘(SEQ ID NO.3)2.正向1(g∶a錯(cuò)配)5‘TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCA-3‘(SEQ ID NO.4)3.正向2(g∶t錯(cuò)配)5‘-TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCT-3‘(SEQ ID NO.5)4正向3(g∶c錯(cuò)配) 5‘TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TCC-3‘(SEQ ID NO.6)5正向4(2個(gè)堿基錯(cuò)配) 5‘TGG ATA CGT CTG AAC TGG TCA CGG TAT-3‘(SEQ ID NO.7)用2.5單位Taq DNA聚合酶(ROCHE Diagnostics GmbH，No.1435094)、0.25μg得自實(shí)施例IV的閃爍古生球菌外切核酸酶III、10ng噬菌體λ的DNA、04μM每種引物、200μM dNTP、1.5mMMgCl2、50mM Tris-HCl，pH9.2、16mM(NH4)2SO4進(jìn)行PCR。在50μl PCR體積中用以下條件進(jìn)行PCR1×94℃2分鐘；40× 94℃10秒；60℃30秒；72℃1分鐘；1×72℃7分鐘。將所述外切核酸酶/Taq聚合酶混合物的功能與2.5單位Taq DNA聚合酶、0.3單位Tgo DNA聚合酶(ROCHE Diagnostics GmbH)的兩個(gè)對(duì)照以及與0.75μl ExpandTM高保真性PCR系統(tǒng)(ROCHE Diagnostics GmbH，No.1732614)進(jìn)行比較。正如用BsiEI成功消化所述PCR產(chǎn)物所表明的，閃爍古生球菌外切核酸酶III表現(xiàn)出對(duì)所有所述錯(cuò)配的校正活性，校正效率為90-100％(圖5)。正如所預(yù)期的，Taq DNA聚合酶沒(méi)有表現(xiàn)出校正活性，而具有3’-5’外切核酸酶活性的Tgo DNA聚合酶也完全進(jìn)行了校正。ExpandTM高保真性PCR系統(tǒng)僅表現(xiàn)出對(duì)所述兩個(gè)堿基的錯(cuò)配有100％校正活性。對(duì)其它錯(cuò)配以大約50％的效率修復(fù)。
實(shí)施例VIII在PCR過(guò)程中Afu外切核酸酶III/Taq DNA聚合酶混合物的保真性在一個(gè)基于含有一個(gè)功能lac Iq等位基因的pUC19衍生物pUCIQ17(Frey，B.和Suppmann B.(1995)Biochemica234-35)的擴(kuò)增、環(huán)化和轉(zhuǎn)化的測(cè)定中，測(cè)定在PCR過(guò)程中Afu外切核酸酶III/Taq DNA聚合酶混合物的保真性。在lac I中的PCR衍生的突變導(dǎo)致lac Zα表達(dá)的去阻抑，并且隨后形成可以在X-Gal指示平板上容易檢測(cè)到的功能性β-半乳糖苷酶。與作為對(duì)照的Taq DNA聚合酶和Expand HiFi PCR系統(tǒng)(Roche Molecular Biochemicals)和Pwo DNA聚合酶(RocheMolecular Biochemicals)相比，測(cè)定用這種基于lac I的PCR保真性測(cè)定測(cè)量的Taq聚合酶/Afu外切核酸酶混合物的出錯(cuò)率。
通過(guò)用DraII消化將質(zhì)粒pUCIQ17線性化，以用作以所測(cè)試的酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增的底物。
所用的兩種引物在其5引物端具有ClaI位點(diǎn)SEQ ID NO.8引物15′-AGCTTATCGATGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG-3′SEQ ID NO.9引物25′-AGCTTATCGATAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGC-3′所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度是3493bp。
在50μl終體積中，在1.5mM MgCl2、50mM Tris-HCl，pH8.5(25℃)、12.5mM(NH4)2SO4、35mM KCl、200μM dNTP和2.5單位Taq聚合酶和分別為125ng、175ng、250ng、375ng和500ng的Afu外切核酸酶III存在下，進(jìn)行PCR。
循環(huán)條件如下1×將模板于95℃變性2分鐘 在PCR后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行PEG沉淀(Bames，W.M.(1992)Gene112229)，用ClaI將所述DNA限制性消化，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化。用快速DNA連接試劑盒(Roche Molecular Biochemicals)連接所述分離的DNA，并且將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，接種到TN Amp X-Gal平板上。用所產(chǎn)生的質(zhì)粒pUSIQ17(3632 bp)轉(zhuǎn)化的α互補(bǔ)大腸桿菌菌株DH5α在含有氨芐青霉素(100μg/ml)和X-Gal(0.004％w/v)的TN平板(1.5％細(xì)菌培養(yǎng)用胰胨、1％NaCl、1.5％瓊脂)上顯示出白色(lacI+)菌落。突變產(chǎn)生藍(lán)色菌落。
于37℃過(guò)夜溫育后，對(duì)藍(lán)色菌落和白色菌落計(jì)數(shù)。用Keohavong和Thilly(Keohavong，P.和Thilly，W.(1989)PNAS USA869253)公布的重排公式計(jì)算每bp的出錯(cuò)率(f)f＝-lnF/d×b bp其中F是白色菌落的分?jǐn)?shù)F＝白色(lacI+)菌落/菌落總數(shù)；d是DNA復(fù)制次數(shù)(the number of duplications)2d＝輸出DNA/輸入DNA；而b是(1080bp)lac I基因的有效靶大小，按照Provost等(Provost等(1993)Mut.Res.288133)，它為349bp。
示于圖6A和圖6B的結(jié)果證明，在反應(yīng)混合物中存在熱穩(wěn)定外切核酸酶III導(dǎo)致出錯(cuò)率低。隨著聚合酶與外切核酸酶之比的變化，所述出錯(cuò)率逐漸降低。用最適Taq聚合酶/Afu外切核酸酶III混合物達(dá)到的保真度(4，44×10-6)在與Taq/Pwo混合物(Expand HiFi；2，06×10-6)相似的范圍內(nèi)。對(duì)最適緩沖液條件的評(píng)估將進(jìn)一步提高保真度。必須優(yōu)化聚合酶與外切核酸酶之間的比率。外切核酸酶的量大降低產(chǎn)物的收率，明顯降低擴(kuò)增效率(Taq/Exo 1∶10相當(dāng)于2.5單位Taq聚合酶和500ng Afu外切核酸酶III)。
用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，例如通過(guò)改變緩沖液組分、優(yōu)化各個(gè)組分的濃度或改變循環(huán)條件，可以進(jìn)一步優(yōu)化該系統(tǒng)的保真性。
實(shí)施例IX在PCR期間在Afu外切核酸酶III存在下dUTP的摻入用dUTP完全取代TTP，測(cè)試Afu外切核酸酶/Taq聚合酶混合物的DNA合成。用2.5單位Taq DNA聚合酶，在0.125μg、0.25μg、0.375μg和0.5μg得自實(shí)施例IV的閃爍古生球菌外切核酸酶III存在下，用β-球蛋白基因作為靶，在PCR中根據(jù)作為模板的天然人基因組DNA確定或者TTP或者dUTP摻入的比較。使用以下引物正向5‘-TGG TTG AAT TCA TAT ATC TTA GAG GGA GGG C-3‘(SEQ ID NO.10)反向5‘-TGT GTC TGC AGA AAA CAT CAA GGG TCC CAT A-3‘(SEQ ID NO.11)在50μl體積中用以下循環(huán)條件進(jìn)行PCR1× 94℃2分鐘；40× 94℃10秒；60℃30秒；72℃1分鐘；1× 72℃7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分離等份的PCR反應(yīng)物。如圖7所示，用該模板/引物系統(tǒng)，用至多375ng Afu外切核酸酶III，在dUTP存在下DNA合成是可能的?？梢酝ㄟ^(guò)用尿嘧啶-DNA糖基化酶(TOCHE DiagnosticsGmbH，No.1775367)于室溫下處理等份的PCR反應(yīng)產(chǎn)物30分鐘，隨后于95℃溫育5分鐘，以于無(wú)嘌呤位點(diǎn)切割多核苷酸，導(dǎo)致所述片段的完全降解，進(jìn)一步證實(shí)dUTP摻入。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析示于圖8中。
實(shí)施例XAfu外切核酸酶III對(duì)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的影響Taq聚合酶能夠在基因組模板上合成長(zhǎng)度至多為3kb的PCR產(chǎn)物。為了估計(jì)Taq聚合酶/Afu外切核酸酶混合物合成較長(zhǎng)產(chǎn)物的能力，在作為模板的人基因組DNA上，用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增長(zhǎng)度為9.3kb、12kb和15kb的產(chǎn)物的3對(duì)引物，分析所述酶混合物。所用的緩沖液系統(tǒng)得自Expand長(zhǎng)模板PCR系統(tǒng)(Roche Molecular Biochemicals Cat.No 1681834)。在50μl體積中，用250ng人基因組DNA、220ng每種引物、350μM dNTPs和2.5單位Taq聚合酶和62.5ng Afu外切核酸酶，使用表1中概述的條件，進(jìn)行反應(yīng)表1
所用的tPA基因擴(kuò)增的特異性引物是引物7a正向5′-GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT GCA GCA CCC CTG C-3′(SEQ ID NO.12)引物14a正向5′-CAA AGT CAT GCG GCC ATC GTT CAG ACA CAC C-3′(SEQ ID NO.13)引物1 正向5′-CCT TCA CTG TCT GCC TAA CTC CTT CGT GTG TCC C-3′(SEQ ID NO.14)引物2 反向5′-ACT GTG GTT CCT GAC CCA TGG CAG AAG CGC CTT C-3′(SEQ ID NO.15)引物3 反向5′-CCT TCT AGA GTC AAC TCT AGA TGT GGA CTT AGA G-3′(SEQ ID NO.16)如圖9中所示，用Taq聚合酶/Afu外切核酸酶混合物可能合成長(zhǎng)度至少為15kb的產(chǎn)物。
實(shí)施例XI可以用聚合酶活性降低但3’外切核酸酶活性增加的聚合酶突變體取代熱穩(wěn)定外切核酸酶III在Niehaus F.，F(xiàn)rey B.和Antranikian G.在WO97/35988或Gene(1997)204(1-2)，153-8中描述的得自Thermococcuss aggregans的DNA聚合酶(Tag)中于位置385有一個(gè)氨基酸交換，其中酪氨酸被天冬酰胺取代(Boehlke等，已送交待公布，和歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)00105 155.6)，該聚合酶僅表現(xiàn)出6.4％的野生型DNA聚合酶的聚合酶活性，但表現(xiàn)出205％的野生型DNA聚合酶的外切核酸酶活性。用該酶證明，本發(fā)明不限于外切核酸酶III型酶，還包括其它類(lèi)型的負(fù)責(zé)3’外切核酸酶活性的酶。
在50μl體積中，用200ng人基因組DNA、200μM dNTP、220ng每種引物以及對(duì)于反應(yīng)1-4使用包含Mg++的Expand HiFi緩沖液，而對(duì)于反應(yīng)5-8使用Expand長(zhǎng)模板緩沖液1，進(jìn)行反應(yīng)(
圖10)。為了擴(kuò)增4.8kb的tPA基因片段，在反應(yīng)1-4中使用引物tPA 7a正向(5’-GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT GCA GCA CCC CTG C-3’，SEQID NO.12)和tPA 10a反向(5’-GAT GCG AAA CTG AGG CTG GCTGTA CTG TCT C-3’，SEQ ID NO17)。為了擴(kuò)增9.3kb的tPA基因片段，在反應(yīng)5-8中使用引物tPA 7a正向和tPA 14a反向(5’-CAA AGTCAT GCG GCC ATC GTT CAG ACA CAC C-3’，SEQ ID NO.13)。向反應(yīng)1、2、4、5、6和8中加入2.5單位Taq聚合酶，在用作陰性對(duì)照的反應(yīng)3和7中不加Taq聚合酶。向反應(yīng)2、3、6和7中加入11ng Tag聚合酶突變體，而向反應(yīng)4和8中加入150ng Afu外切核酸酶III。
用于反應(yīng)1-4的循環(huán)程序是1×94℃2分鐘，10× 94℃10秒62℃30秒68℃4分鐘20× 94℃10秒62℃30秒68℃4分鐘，每個(gè)循環(huán)加上20秒循環(huán)延伸1×68℃7分鐘對(duì)于反應(yīng)5-81×94℃2分鐘，10× 94℃10秒65℃30秒68℃8分鐘20× 94℃10秒65℃30秒68℃8分鐘，每個(gè)循環(huán)加上20秒循環(huán)延伸1× 68℃7分鐘在含有溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上分析所述PCR產(chǎn)物(
圖10)。數(shù)據(jù)表明，Taq聚合酶能夠擴(kuò)增4.8kb片段，但收率低。Taq聚合酶和Tag聚合酶突變體或Afu Exo III的組合導(dǎo)致產(chǎn)物收率非常大的提高。Tag聚合酶突變體酶本身不能夠合成該產(chǎn)物。
用9.3kb系統(tǒng)獲得了相似的結(jié)果。單獨(dú)用Taq聚合酶沒(méi)有可檢測(cè)到的產(chǎn)物。與Tag聚合酶突變體或Afu Exo III組合，以高收率獲得了所預(yù)期的PCR產(chǎn)物。
這些結(jié)果表明，Taq聚合酶不能從基因組DNA擴(kuò)增幾個(gè)kb的DNA片段，這支持Barnes的假說(shuō)(Bames W.M.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，912216-2220)PCR擴(kuò)增的長(zhǎng)度限制是由于在摻入錯(cuò)配堿基對(duì)的位置延伸效率低而引起的。在引物端去除錯(cuò)配的核苷酸后，Taq聚合酶能夠再進(jìn)行DNA合成。因此，在隨后的循環(huán)中，作為全長(zhǎng)產(chǎn)物的完整的核酸鏈可以用作引物結(jié)合的模板。
實(shí)施例XIIAfu Exo III對(duì)線性單鏈DNA無(wú)活性在50μl體積中，用270ng Afu Exo III、5μg49-mer寡核苷酸在具有MgCl2的Expand HiFi PCR緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，將反應(yīng)物于65℃溫育0、1、2、3、4和5小時(shí)。在加入10μl蛋白酶K溶液(20mg/ml)后，將樣品于37℃溫育20分鐘。在含有溴化乙錠的3.5％瓊脂糖凝膠上分析反應(yīng)產(chǎn)物。
結(jié)果描述于
圖11中。該圖表明，在所有泳道中所述核酸的大小相同。在與Afu Exo III一起溫育長(zhǎng)達(dá)5小時(shí)后獲得的產(chǎn)物(6道)的大小與對(duì)照(1、7和8道)相同。全長(zhǎng)寡核苷酸的強(qiáng)度沒(méi)有明顯的降低，也不能觀察到由降解產(chǎn)物所產(chǎn)生的成片條帶。
實(shí)施例XIIIAfu Exo III與熱穩(wěn)定B型聚合酶在引物降解活性方面的比較據(jù)報(bào)道熱穩(wěn)定B型聚合酶具有單鏈和雙鏈核酸酶活性(Kong H等(1993)Journal Biol.Chem.2681965-1975)。無(wú)論引物分子是與模板雜交，還是單鏈分子，該活性都能夠降解引物分子。在反應(yīng)混合物中用一種熱穩(wěn)定外切核酸酶取代熱穩(wěn)定B型聚合酶可能在單鏈引物或所述反應(yīng)混合物中存在的其它核酸的穩(wěn)定性方面是有利的。
為了測(cè)試引物降解活性，將無(wú)模板DNA的反應(yīng)混合物于72℃溫育1小時(shí)，然后加入DNA，進(jìn)行PCR。將所述結(jié)果與含作為熱穩(wěn)定B型聚合酶例子的Tgo聚合酶(Angerer B.等WO98/14590)的反應(yīng)物進(jìn)行比較。作為對(duì)照，用相同混合物而不進(jìn)行先前的溫育。在表2中總結(jié)了所述結(jié)果。表2
作為擴(kuò)增的靶，選擇p53基因的一個(gè)片段，所用的引物是p53I5’-GTC CCA AGC AAT GGA TGA T-3’(SEQ ID NO.18)和p53II5’-TGG AAA CTT TCC ACT TGA T-3’(SEQ ID NO.19)。在50μl體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)1-10號(hào)含有200ng人基因組DNA、40pmole每種引物、10mM Tris-HCl，pH8.5、17.5mM(NH4)2SO4、1.25mMMgCl2、0.5％Tween、2.5％DMSO、250μg/ml BSA和1單位(反應(yīng)1、3、5、7和9號(hào))或1.5單位(反應(yīng)2、4、6、8和10號(hào))Tgo聚合酶和200μM dNTP。反應(yīng)11-16號(hào)含有2.5單位Taq聚合酶、含有Mg++的Expand HiFi緩沖液、40pmole每種引物、200μM dNTP、100ng人基因組DNA。反應(yīng)12和15號(hào)含有37.5ng Afu Exo III，反應(yīng)13和16號(hào)含有75ng Afu Exo III。
正如表2中所述，反應(yīng)1、2、5、6和11-13在缺乏模板DNA的情況下于72℃溫育1小時(shí)。在開(kāi)始PCR之前加入模板DNA。反應(yīng)5、6、9和10在缺乏核苷酸的情況下預(yù)溫育，反應(yīng)9和10在預(yù)溫育步驟之后，補(bǔ)充額外的40pmol引物。因?yàn)門(mén)aq聚合酶的5’外切核酸酶活性，在預(yù)溫育后向反應(yīng)11-13中加入所述酶。
PCR條件是1× 94℃2分鐘，35×94℃10秒55℃30秒72℃4分鐘1× 72℃10分鐘在瓊脂糖凝膠上分析反應(yīng)產(chǎn)物，并且用溴化乙錠染色(
圖12)。
當(dāng)將Tgo聚合酶與所述引物在缺乏模板DNA的情況下溫育(反應(yīng)1、2、5和6)，并且與沒(méi)有預(yù)溫育的相應(yīng)反應(yīng)(3、4、7和8)進(jìn)行比較時(shí)，觀察到明顯的差異。所述預(yù)溫育導(dǎo)致PCR產(chǎn)物大大減少，明顯影響至少一種基本組分，最可能是影響PCR引物。在預(yù)溫育步驟之后額外加入40pmole PCR引物(反應(yīng)9和10)產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)，其強(qiáng)度與沒(méi)有預(yù)溫育的對(duì)照反應(yīng)相當(dāng)。這表明，無(wú)論dNTP是否存在，熱穩(wěn)定B型聚合酶Tgo聚合酶在缺乏模板的情況下都降解PCR引物。
在反應(yīng)12和13中，在加入模板DNA和Taq聚合酶之前所述引物與Afu外切核酸酶III一起預(yù)溫育，反應(yīng)12和13獲得的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的條帶與不使用預(yù)溫育步驟的反應(yīng)15和16獲得的條帶相似。根據(jù)相似的強(qiáng)條帶強(qiáng)度，可以推斷，很少或沒(méi)有發(fā)生引物降解，并且單鏈寡核苷酸對(duì)于Afu外切核酸酶III而言是不良底物。根據(jù)PCR產(chǎn)物的強(qiáng)條帶強(qiáng)度或增加的收率，可以推斷，該酶增強(qiáng)擴(kuò)增過(guò)程的保真性。
權(quán)利要求
1.表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的熱穩(wěn)定酶，而當(dāng)加入到表現(xiàn)出聚合酶活性的第二種酶中時(shí)，該酶增強(qiáng)擴(kuò)增過(guò)程的保真性。
2.可得自閃爍古生球菌(Archeoglobus fulgidus)的按照權(quán)利要求1的熱穩(wěn)定酶。
3.按照權(quán)利要求1或2的熱穩(wěn)定酶，而所述酶能夠作為校正酶與表現(xiàn)出聚合酶活性的第二種酶配合。
4.按照權(quán)利要求1、2或3的熱穩(wěn)定酶，而所述酶表現(xiàn)出DNA聚合酶活性降低。
5.包含一種第一種熱穩(wěn)定酶和一種第二種酶的組合物，所述第一種熱穩(wěn)定酶表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性，所述第二種酶表現(xiàn)出DNA聚合酶活性，而與應(yīng)用單一的所述第二種酶相比，擴(kuò)增過(guò)程的保真性由于應(yīng)用所述組合物而得到增強(qiáng)。
6.按照權(quán)利要求5的組合物，而第二種酶缺失校正活性。
7.按照權(quán)利要求5或6的組合物，而所述第二種酶是Taq聚合酶。
8.一種使用按照權(quán)利要求6或7的組合物制備或擴(kuò)增DNA的方法。
9.權(quán)利要求8的方法，而提前終止的鏈通過(guò)從3’至5’的降解作用而被修剪。
10.按照權(quán)利要求8或9的一項(xiàng)的方法，而或者引物或者生長(zhǎng)中的鏈的錯(cuò)配端被去除。
11.按照權(quán)利要求8-10中的一項(xiàng)的方法，而在所述反應(yīng)混合物中存在dUTP，而不是TTP。
12.按照權(quán)利要求11的方法，而用UNG降解污染性核酸。
13.按照權(quán)利要求8-12中的一項(xiàng)的方法，而以下酶的混合物-第一種熱穩(wěn)定酶，表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性，和-第二種酶，表現(xiàn)出DNA聚合酶活性產(chǎn)生出錯(cuò)率較低的PCR產(chǎn)物，其出錯(cuò)率低于在缺乏表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的所述第一種熱穩(wěn)定酶時(shí)由表現(xiàn)出DNA聚合酶活性的所述第二種酶產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的出錯(cuò)率。
14.按照權(quán)利要求13的方法，其中表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的第一種熱穩(wěn)定酶和一種表現(xiàn)出DNA聚合酶活性的第二種酶的混合物，產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度大于在缺乏表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的所述第一種熱穩(wěn)定酶時(shí)由表現(xiàn)出DNA聚合酶活性的所述第二種酶產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度。
15.按照權(quán)利要求8-14中的一項(xiàng)的方法，而表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性、但基本上無(wú)DNA聚合酶活性的所述第一種熱穩(wěn)定酶與得自大腸桿菌的外切核酸酶III相關(guān)，但卻是熱穩(wěn)定的。
16.按照權(quán)利要求8-15中的一項(xiàng)的方法，而獲得具有平端的PCR產(chǎn)物。
17.一種用表現(xiàn)出3’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定酶擴(kuò)增DNA的方法，其中所述酶對(duì)線性單鏈DNA無(wú)延伸活性或僅有可忽略的延伸活性。
18.按照權(quán)利要求17的方法，其中使用按照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的酶。
全文摘要
從嗜熱古細(xì)菌閃爍古生球菌得到一種純化的熱穩(wěn)定酶。該酶可以是天然或是重組的,在PCR條件下穩(wěn)定,并且表現(xiàn)出雙鏈特異性外切核酸酶活性。它是3’－5’外切核酸酶,切割產(chǎn)生5’單核苷酸。所述熱穩(wěn)定酶可用于許多重組DNA技術(shù)中,與一種熱穩(wěn)定DNA聚合酶如Tag結(jié)合尤其可用于通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
文檔編號(hào)C12N15/54GK1343254SQ00803058
公開(kāi)日2002年4月3日 申請(qǐng)日期2000年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月28日
發(fā)明者W·安肯鮑爾, F·勞埃, H·索貝克, M·格雷夫 申請(qǐng)人:羅赫診斷器材股份有限公司